Xenopus laevis 배아는 크기가 크고 조작이 용이하기 때문에 초기 발달 연구에 매우 유용합니다. 이 모델 시스템에서 특정 장기를 식별하는 데 사용할 수 있는 전체 마운트 in situ hybridization 프로토콜에 대한 단순화된 프로토콜이 제공됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
Organogenesis는 장기가 어떻게 지정되고 발달 과정에서 특정 모양과 기능을 획득하는지에 대한 연구입니다. Xenopuslaevis 배아는 크기가 커서 기관 형성의 초기 단계에서 장기를 식별하는 데 매우 적합하기 때문에 기관 형성을 연구하는 데 매우 유용합니다. 현재 특정 장기 또는 원시를 식별하는 데 사용되는 주요 방법은 관심 기관에서 발현되는 유전자에 특이적인 표지된 안티센스 RNA 프로브를 사용한 전체 마운트 제자리 혼성화입니다. 또한, Xenopus에서 유전자 또는 신호 전달 경로를 조작하는 것은 비교적 쉬우며, in situ hybridization을 통해 표적 기관의 존재 또는 형태의 변화를 분석할 수 있습니다. 전체 마운트 현장 하이브리드화는 많은 단계가 포함된 여러 날에 걸친 프로토콜입니다. 여기에서는 일상적인 분석에 잘 작동하는 사용되는 단계 및 시약 수를 줄인 단순화된 프로토콜을 제공합니다. 현장 하이브리드화 로봇은 프로세스를 크게 촉진했으며 프로세스에서 해당 기술을 언제 어떻게 활용하는지 자세히 설명합니다. 현장 하이브리드화가 완료되면 결과의 최상의 이미지를 캡처하는 것이 어려울 수 있습니다. in situ hybridization 결과의 이미징을 최적화하는 방법에 대한 조언을 제공합니다. 프로토콜은 Xenopus laevis의 기관 형성 평가를 설명하지만, 동일한 기본 프로토콜이 Xenopus tropicalis 및 기타 모델 시스템에 거의 확실하게 적용될 수 있습니다.
서론
특정 유전자의 발현 패턴은 특정 기관 또는 세포 유형의 발달에서 해당 유전자의 잠재적인 역할을 결정하는 데 중요한 정보입니다. 간단히 말해, 적절한 시기와 장소에서 표현되지 않는다면 중요한 역할을 하지 못할 것이다. 대부분의 초기 배아에서와 마찬가지로 Xenopus에서 유전자 발현을 검출하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 분석법은 표지된 안티센스 RNA 프로브를 사용한 전체 마운트 현장 혼성화입니다. Xenopus에서 유전자의 발현을 평가하기 위한 항체 염색의 사용은 연구자들이 일반적으로 포유류 단백질에 대해 제기된 항체를 발견함에 따라 Xenopus 상동체에 교차 반응하거나 자체 1-3을 생성함에 따라 더욱 보편화되고 있습니다. 그러나 Xenopus organogenesis에 대한 대다수의 연구는 여전히 안티센스 RNA 프로브를 사용합니다. 항체가 사용될 때, 각 개별 항체는 종종 1차 항체 농도 또는 고정 프로토콜에 대한 최적화가 필요합니다. 대조적으로, 현장 혼성화를 위한 프로토콜은 본질적으로 다른 프로브에 대해 불변합니다. 기본 개념은 비교적 간단하며 우수한 표준 프로토콜이 잘 확립되어 있습니다 4. 당사의 프로토콜은 원래 프로토콜
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프로토콜
1. 배아 준비
- 배아 문화, pH가 8.0 이전의 고정 8 2.5 % 시스테인을 사용하여 드 젤리 배아의 일환으로 정기적으로하지 않으면. 이 절대적으로 필요하지 않지만 수동으로 미세 집게를 사용하기 전에 고정에 시비 봉투를 제거하려면 유용합니다.
- 배아를 전송하는 데 유리 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 피펫은 배아 그렇게 배아를 선택하기에 충분히 넓은 지점에서 유리 피펫을 절단하는 다이아몬드 펜을 사용하여 전송하기에 충분히 넓은 없습니다. 신속하게 날카로운 모서리 용융 분젠 버너의 불꽃을 통해 절단 팁을 전달하여 절단 후 피펫의 날카로운 모서리를 제거합니다.
참고 : 관리는 육안 검사로 냉각 한 것으로 나타나더라도 유리가 여전히 화상을 초래할 정도로 뜨거울 수 있습니다로, 촬영해야합니다.
- 배아를 전송하는 데 유리 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 피펫은 배아 그렇게 배아를 선택하기에 충분히 넓은 지점에서 유리 피펫을 절단하는 다이아몬드 펜을 사용하여 전송하기에 충분히 넓은 없습니다. 신속하게 날카로운 모서리 용융 분젠 버너의 불꽃을 통해 절단 팁을 전달하여 절단 후 피펫의 날카로운 모서리를 제거합니다.
- 단계의 배아 고정을 수행합니다. 첫째, 배아 고정에 사용되는 유리 병을 준비합니다. 마지막 포함한 모든 단계에 대해이 유리 병을 사용하여저장. 프로세스의 모든 단계에서 배아를 모니터링 할 수 있도록 뚜껑에 좋은 테프론 씰 분명 유리 병을 사용합니다. 영구 마커를 사용하여 적절한 실험 정보와 함께 유리 병에 레이블을, 심지어 영구 마커 인해 알코올 및 기타 용매의 사용 절차의 과정을 통해 손실됩니다로서 다음,....
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결과
조직 특이 적 프로브의 사용은 특정 기관에 대한 개발의 상태에 관해서 뛰어난 정보를 제공 할 수있다. 다음 예에서, 배아 단계는 Nieuwkoop 및 파버 스테이징 테이블 (11)에 기초한다. 하나는 프로브 형태 분화 후 유전자 발현, 단계 28-30에서 심장 트로포 닌 I (예를 들어,도 1C), 차별화 된 장기의 존재 또는 크기를 사용하는 경우, 어느 단계 포스트 분화에서 평가 될 수있다. 몇 년 전, embryologists 초기 배아 12, 13의 조직학의 놀라운 지식을 바탕으로 이러한 분석을 수행 할 수 있었다하지만 전문 지식은 크게 embryologists의 현재 세대에 손실되었습니다. 하지만이 전문 손실은 연구원에 사용할 특정 조직을 식별하게 보체 기법의 신뢰성 및 사용의 용이성, 유감 고려 될 수있다. 상대적으로 눈에 띄지있는 조직, t배아 단계 25 예 (그림 1A)에서 선을 부화.......
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토론
특정 유전자의 발현 패턴을 시각화하는 계내 혼성화에 사용하는 능력은 제노 푸스 배아의 특정 기관 또는 세포 유형을 식별하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법에 남아있다. 이는이 기술에 의해 제공되는 몇몇 이점이다. 유전자의 발현은 해당 셀 (18)의 명확한 경계하기 전에 심장 전구 세포에서 nkx2.5 식의 사례로 잘 분화의 조직 학적 서명하기 전에 특정 구조를 식별 할 수 있습니다. 모든 시약은 손에 이동 한 후에, 또한 매우 비용 효과적이다. 효과적으로 재사용 할 수있는 많은 개별 프로브의 세대는 약간의 여분의 시간과 관심의 유전자를 인코딩 플라스미드를 취득 이외의 비용을 투자 할 수있다. 우리의 경험에 의하면, 프로브는 각각의 사용과 함께 제공되는 피할 수없는 작은 희석에도 불구하고 활동에 약간의 손실이 년 동안 재사용 할 수있다. 마지막으로, 약간의 최적화 requi가빨간색은 다른 프로브를 사용하는 경우.
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공개 사항
저자는 공개할 경쟁적인 재정적 이해관계가 없습니다.
감사의 글
저자는 Steve Deimling의 펠로우십 지원에 대해 CIHR과 Steve Deimling, Rami Halabi 및 Stephanie Grover에 대한 지원에 대해 웨스턴 온타리오 대학교 소아과에 감사를 표합니다. 이 작업은 NSERC 보조금 R2654A11와 NSERC Discovery Accelerator Supplement의 지원을 받았습니다
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Labguake 튜브 쉐이커 | VWR | 17-08-2011 | |
| VWR 바이알 | VWR | 10-07-2012 | |
| L-Cysteine | BioShop | CYS342.500 | |
| 리보 뉴클레오 시드 트리 포스페이트 세트, 100mM | Roche | 11277057001 | |
| Digoxigenin-11-UTP | Roche | 11209256910 | |
| Rnase inhibator (Rnase OUT) | 인비트로젠 | 10777-019 | |
| T7 RNA 중합효소 | 발효as | EPO111 | |
| T3 RNA 중합효소 | 발효as | EPO101 | |
| SP6 RNA 중합효소 | fermentas | EPO131 | |
| Dnase 1 | Invitrogen | 18047-019 | |
| 양 혈청 | Wisent | 31150 | |
| 차단 시약 | Roche | 11096176001 | |
| BM 보라색 Ap 기질 | Roche | 11442094001 | |
| Anti-Digoxigenin-Ap Feb 단편 | Roche | 11093274910 | |
| Methanol | VWR | CAMX0485-7 | |
| NaCl | BioShop | SOD002.10 | |
| SDS | EM | 7910 | |
| EDTA | BioShop | EDT001.500 | |
| Tris | BioShop | TRS003.5 | |
| Tween-20 | EM | 9480 | |
| MgSO4 | 시그마 | M-2643 | |
| Mops | BioShop | MOP001.250 | |
| EGTA | 시그마 | E-3889-25G | |
| 파라포름알데히드 | BioShop | PAR070.500 | |
| 포름아미드 | 폭스바겐 | CAFX0420-4 | |
| RNA | 로슈 | 10109223001 | |
| 말레산 | 폭스바겐 | CAMX0100-3 | |
| 삼중나트륨 시트레이트 | BioShop | CIT001 | |
| 과산화수소 (30% 용액) | EM | HX0635-2 | |
| BSA | BioShop | ALB001.100 | |
| PVP-40 | ICN | 195451 | |
| Ficoll 400 | GE Healthcare | 17-0300-10 | |
| 벤질 알코올 | 시그마 | B-1042 | |
| 벤질 벤조에이 | 시그마 | B-6630 | |
| UltraPure 아가로스 | 인비트로젠 | 16500-500 |
참고문헌
- Ninomiya, H., et al. Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo. J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).
- Movassagh, M., Philpott, A. Cardiac differen....
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재인쇄 및 허가
