방법 논문

이해 간체를 사용하여 초기 형성기

DOI:

10.3791/51526

⸱

2015년 1월 12일

 ,  ,  ,  , 
1Developmental and Stem Cell Biology, Hospital for Sick Children, 2Children's Health Research Institute, University of Western Ontario, 3Department of Physiology and Pharmacology, University of Western Ontario, 4Neurosciences and Mental Health, Hospital for Sick Children, 5Department of Paediatrics, University of Western Ontario

이 논문에서

요약

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Xenopus laevis 배아는 크기가 크고 조작이 용이하기 때문에 초기 발달 연구에 매우 유용합니다. 이 모델 시스템에서 특정 장기를 식별하는 데 사용할 수 있는 전체 마운트 in situ hybridization 프로토콜에 대한 단순화된 프로토콜이 제공됩니다.

초록

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Organogenesis는 장기가 어떻게 지정되고 발달 과정에서 특정 모양과 기능을 획득하는지에 대한 연구입니다. Xenopuslaevis 배아는 크기가 커서 기관 형성의 초기 단계에서 장기를 식별하는 데 매우 적합하기 때문에 기관 형성을 연구하는 데 매우 유용합니다. 현재 특정 장기 또는 원시를 식별하는 데 사용되는 주요 방법은 관심 기관에서 발현되는 유전자에 특이적인 표지된 안티센스 RNA 프로브를 사용한 전체 마운트 제자리 혼성화입니다. 또한, Xenopus에서 유전자 또는 신호 전달 경로를 조작하는 것은 비교적 쉬우며, in situ hybridization을 통해 표적 기관의 존재 또는 형태의 변화를 분석할 수 있습니다. 전체 마운트 현장 하이브리드화는 많은 단계가 포함된 여러 날에 걸친 프로토콜입니다. 여기에서는 일상적인 분석에 잘 작동하는 사용되는 단계 및 시약 수를 줄인 단순화된 프로토콜을 제공합니다. 현장 하이브리드화 로봇은 프로세스를 크게 촉진했으며 프로세스에서 해당 기술을 언제 어떻게 활용하는지 자세히 설명합니다. 현장 하이브리드화가 완료되면 결과의 최상의 이미지를 캡처하는 것이 어려울 수 있습니다. in situ hybridization 결과의 이미징을 최적화하는 방법에 대한 조언을 제공합니다. 프로토콜은 Xenopus laevis의 기관 형성 평가를 설명하지만, 동일한 기본 프로토콜이 Xenopus tropicalis 및 기타 모델 시스템에 거의 확실하게 적용될 수 있습니다.

서론

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특정 유전자의 발현 패턴은 특정 기관 또는 세포 유형의 발달에서 해당 유전자의 잠재적인 역할을 결정하는 데 중요한 정보입니다. 간단히 말해, 적절한 시기와 장소에서 표현되지 않는다면 중요한 역할을 하지 못할 것이다. 대부분의 초기 배아에서와 마찬가지로 Xenopus에서 유전자 발현을 검출하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 분석법은 표지된 안티센스 RNA 프로브를 사용한 전체 마운트 현장 혼성화입니다. Xenopus에서 유전자의 발현을 평가하기 위한 항체 염색의 사용은 연구자들이 일반적으로 포유류 단백질에 대해 제기된 항체를 발견함에 따라 Xenopus 상동체에 교차 반응하거나 자체 1-3을 생성함에 따라 더욱 보편화되고 있습니다. 그러나 Xenopus organogenesis에 대한 대다수의 연구는 여전히 안티센스 RNA 프로브를 사용합니다. 항체가 사용될 때, 각 개별 항체는 종종 1차 항체 농도 또는 고정 프로토콜에 대한 최적화가 필요합니다. 대조적으로, 현장 혼성화를 위한 프로토콜은 본질적으로 다른 프로브에 대해 불변합니다. 기본 개념은 비교적 간단하며 우수한 표준 프로토콜이 잘 확립되어 있습니다 4. 당사의 프로토콜은 원래 프로토콜 4의 간소화된 버전으로, 여전히 초기 배아에서 유전자 발현 패턴을 탁월하게 검출합니다. 배아는 고정된 다음 labeled antisense RNA probe를 타겟 mRNA에 매우 엄격하게 결합할 수 있도록 용액과 온도를 변경하여 혼성화를 위해 준비됩니다. 결합되지 않은 프로브는 씻겨 나가고 배아는 RNA 프로브의 표지에 대한 항체의 결합을 준비합니다. 그런 다음 과도한 항체를 씻어내고 효소 색상 반응을 사용하여 RNA 프로브가 배아에서 결합된 위치를 파악합니다. 현재 특정 조직에서 형광 단백질의 발현을 유도하는 많은 Xenopus 형질전환 세포주가 있으며, 이러한 유전자 변형 세포주는 Woods Hole의 National Xenopus Resource와 같은 Xenopus 재고 센터에서 사용할 수 있습니다. 살아있는 배아의 기관 형성을 조사해야 하는 많은 실험에 매우 유용하지만, 이 옵션은 형질전환 계통을 위한 별도의 하우징이 필요합니다.

in situ hybridization은 초기 배아에서 특정 장기 또는 세포 유형이 형성되는 위치를 명확하게 설명할 수 있습니다(그림 1). 이 기술은 단일 배아에서 소수의 세포에서 유전자 발현을 감지할 수 있다는 점을 감안할 때 매우 민감합니다 5. 그러나 비색 염색 강도를 사용한 현장 혼성화는 색상 반응이 선형 반응이 아니기 때문에 정량화 할 수있는 것으로 간주되지 않습니다. 염색 강도를 정량화하는 데 어려움이 있음에도 불구하고 발현의 변화는 종종 매우 눈에 띄게 나타납니다. 특히 현장 혼성화가 발현 영역의 크기에서 정량화 가능한 증가 또는 감소를 보이는 경우 6,7.

전체 마운트 in situ hybridization의 분명한 장점은 초기 발달 연구에서 중요한 분석법입니다. 그러나 며칠에 걸쳐 많은 단계를 수행해야 하는 시간이 많이 걸리는 작업입니다. 이 프로토콜은 현장 결과의 품질을 저하시키지 않고 여러 단계를 제거하는 표준 프로토콜의 단순화된 버전입니다. 단순화는 또한 변동성의 원인을 제거하여 현장 하이브리드화가 최적이 아닌 경우 문제를 더 쉽게 해결할 수 있습니다. 특히, 배아의 proteinase K 및 RNAse 처리의 사용을 제거했는데, 이 두 단계는 시약 품질에 따라 달라질 수 있으며 과도하게 수행할 경우 신호 강도를 줄일 수도 있습니다. 이 프로토콜은 또한 여러 시약의 사용을 없애기 때문에 어느 정도의 비용 절감 효과를 제공합니다. 마지막으로, 이 프로토콜은 현장 혼성화 결과의 이미지 캡처를 개선하기 위한 몇 가지 간단한 지침도 제공합니다. 이 프로토콜은 제노푸스 배아(Xenopus embryos)에서의 작업에 최적화되어 있지만, 적어도 일부 단순화는 다른 배아 시스템에서의 현장 혼성화 작업에 적용될 수 있을 것으로 보입니다.

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프로토콜

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1. 배아 준비

  1. 배아 문화, pH가 8.0 이전의 고정 8 2.5 % 시스테인을 사용하여 드 젤리 배아의 일환으로 정기적으로하지 않으면. 이 절대적으로 필요하지 않지만 수동으로 미세 집게를 사용하기 전에 고정에 시비 봉투를 제거하려면 유용합니다.
    1. 배아를 전송하는 데 유리 파스퇴르 피펫을 사용합니다. 피펫은 배아 그렇게 배아를 선택하기에 충분히 넓은 지점에서 유리 피펫을 절단하는 다이아몬드 펜을 사용하여 전송하기에 충분히 넓은 없습니다. 신속하게 날카로운 모서리 용융 분젠 버너의 불꽃을 통해 절단 팁을 전달하여 절단 후 피펫의 날카로운 모서리를 제거합니다.
      참고 : 관리는 육안 검사로 냉각 한 것으로 나타나더라도 유리가 여전히 화상을 초래할 정도로 뜨거울 수 있습니다로, 촬영해야합니다.
  2. 단계의 배아 고정을 수행합니다. 첫째, 배아 고정에 사용되는 유리 병을 준비합니다. 마지막 포함한 모든 단계에 대해이 유리 병을 사용하여저장. 프로세스의 모든 단계에서 배아를 모니터링 할 수 있도록 뚜껑에 좋은 테프론 씰 분명 유리 병을 사용합니다. 영구 마커를 사용하여 적절한 실험 정보와 함께 유리 병에 레이블을, 심지어 영구 마커 인해 알코올 및 기타 용매의 사용 절차의 과정을 통해 손실됩니다로서 다음, 투명 테이프로 라벨을 커버한다.
    1. 배아를 해결하기 위해 Mempfa를 사용합니다. 한 번에 50 ~ 100 ml의 배치로 8 % 파라 포름 알데히드의 재고를 확인하십시오. 용액에 파라 포름 알데히드를 얻기 위해 필요한 50 ~ 60 ° C에 필요한 H 2 O 및 열의 약 75 %를 사용합니다.
      참고 :이 솔루션은 포름 알데히드보다는 파라 포름 알데히드를 활용한다는 점에서 Memfa 나이가 발표 된 프로토콜 버전에서 사용보다 약간 다릅니다.
    2. 10N NaOH를 2 ~ 3 방울을 추가 또는 pH가 7.5까지 (산도를 확인하기 위해 사용 산도 용지) 약. 파라 포름 알데히드는 매우 독성, 따라서 흄 후드에서 원액을 생성합니다. 파라 번포름 알데히드 용액에, 신선한 컨테이너로 와트 만 여과지 용액을 필터 및 최종 부피로 H 2 O를 추가한다. 필요한 경우 1 ~ 2 주 동안 4 ° C에서 파​​라 포름 알데히드 용액을 저장합니다.
    3. Mempfa 고정 용액 (표 1)의 나머지 구성 요소를 조립한다. 파라 포름 알데히드의 최종 작업 농도가 4 % 있는지 확인합니다. 주식으로 4 ° C에서 고정 솔루션의 모든 구성 요소를 저장합니다.
    4. 컷 유리 피펫을 사용하여, Mempfa 용액 (표 1)의 약 3-4 ml로 충전 된 라벨 유리 병에 배아를 추가하여 배아를 수정. 유리 병 당 이상의 20 ~ 30 배아를 고정하지 마십시오. 배아 매체로부터 액체 전사의 최소 배아를 추가합니다. 실온에서 2 시간 또는 밤새 4 ° C에 대한 Mempfa 솔루션에 배아를 수정합니다.
    5. 후반 내배엽 구조에 대해서는 수동으로 고립 장과 내배엽 파생 상품 9,10에 원위치에서 수행프로브의 좋은 침투 할 수 있으며 또한 공동의 얼룩을 방지한다.
    6. -20 ℃에서 100 %의 메탄올 용액을 저장한다. 파라 포름 알데히드 고정 후, 약 4 ml의 -20 ° C, 배아의 저장을위한 100 % 메탄올 Mempfa 솔루션을 교체합니다.
    7. 유리 또는 다른 배아 달라 붙는 것을 방지하기 위해 배아 메탄올을 첨가 한 후, 바이알 소용돌이 친다. 또한, 느슨한 경우 메탄올이 시간에 냉장고에 증발 할 수 있기 때문에 병이 단단히 밀봉되어 있는지 확인합니다.
      주 : 배아 보체 품질의 손실없이 염색 전에 메탄올 가능성 이상 1 년 이상 저장 될 수있다.

2. 프로브 준비

  1. 제닌 표지 프로브를 만들기 위해 주형 DNA의 1-2 μg의를 사용합니다. 제한하여 원하는 유전자의 5 '말단에 적절한 DNA 서열을 함유하는 플라스미드를 절단하기에 적합한 효소 그쪽t 벡터는 안티센스 프로브를 생성한다.
    참고 : 플라스미드 적절한 RNA 중합 효소 결합 부위 (예를 들어 T7, T3, 또는 SP6)을 가져야한다.
  2. DNA, 물, NTP는 프로브 합성 반응을 조립하기 전에 실온까지 가온 혼합하고 중합 효소 완충액 허용. 표 2에 열거 된 순서대로 1.5 ㎖의 마이크로 원심 분리 튜브에 RNA 합성 반응의 요소를 추가한다. 물의 양을 조절하여 20 ㎕의 프로브 합성 반응의 총 부피를 가지고 첨가. 중합 효소 완충액 성분 및 고농도에서 냉간시 주형 DNA를 침전 할 수 있기 때문에, 실온에서 반응을 조립한다.
  3. 37 ° C에서 2 시간 동안 전사 반응을 품어.
    참고 : 약간 긴 두 시간 이상의 항온 부작용없이 리드뿐만 아니라, 약간의 수율은 커지고있다. 한 시간 동안 배양 한 경우, 수율은 여전히​​ 좋은 프로브를 확인하기에 충분 감소하지만됩니다.
    1. 마무리 전사 반응을 기다리는 동안, 프로브의 품질을 테스트하기 위해 사용되는 아가 로스 겔을 만든다. 1X TAE 완충액 100 mL에 아가 1 μg의 용융 비점 용액을 가열하여 (표 1 참조). 아가로 오스 분말이 완전히 용해 될 때 열에서 솔루션을 제거합니다.
    2. 아가로 오스는 자외선 (UV) 빛 아래 RNA의 시각화를 허용하도록 약 60 ° C로 냉각되면, 아가 로스 겔을 약 100 ㎖로 2 μL 티듐 브로마이드 스톡 용액 (10 ㎎ / ㎖)를 첨가.
      주 : 겔 미래 반복 용융시키지 않고 주입 될 수 있도록이 아가 로스 겔 용액을 60 ° C의 배양기에서 유지 될 수있다. 때문에 잠재적 인 독성에 티듐 브로마이드 처리에주의하십시오.
  4. 주형 DNA를 제거하기 위해 37 ℃에서 10 분 동안 추가로 2 시간 배양 한 후에 전사 반응에 1 μL DNAseI (RNAse가없는 등급)를 첨가하고, 배양한다.
  5. 반응물 믹스 1 μL를 제거TE 완충액 (10 mM 트리스 산도 8.0, 1 ㎜ EDTA), 5M NH 4 아세테이트 10 μL, 220 μL에 1 % SDS의 80 μl를 추가 1 % 아가로 오스-TAE 젤과 나머지 (20 μL)에 확인 차가운 에탄올. 와류 혼합하고 격렬 RNA 품질 검사 결과가 공지 될 때까지 얼음 상 방치.
    1. 1 % 아가로 오스-TAE 젤에 침전하기 전에 제거 RNA의 1 μl를 실행합니다. 젤에 로딩을 쉽게하기 위해, 물 4 ~ 5 μL와 RNA 표준 로딩 염료 1 μl를 추가합니다. (설명 참조) 프로브의 품질을 확인하기 위해 UV 광 트랜스 일루미네이터를 이용하여 겔상에서 RNA보기.
  6. 10 ~ 15 분 동안 전속력으로 마이크로 원심에서 회전에 의해 단계 2.5에서 얼음에 방치 된 나머지 RNA를 침전. 인출 유리 피펫으로 상층 액을 배출시킵니다 간략하게 건조 할 수 있습니다.
    1. 에펜 도르프 튜브에서 RNA 혼성화 완충액 1 ㎖ (표 1)에 프로브를 재현 탁. 소용돌이와 BRiefly 다시 37 ° C와 소용돌이에 튜브를 가열한다. 15 ml의 캡 폴리스티렌 튜브를 나사에 프로브 솔루션을 전송하고 RNA 하이브리드 버퍼가 7-10 ml의 입력합니다. 참고 : 프로브 (10 배 더 희석 여전히 작동 할 수 있습니다) 종종 낮은 배경의 결과로하지만, 염색 반응이 또한 오래 걸릴 더 희석 될 수있다.

현장 하이브리드 3.

  1. -20 ° C 메탄올에 기억 된 배아를 취하여 실온으로 가온 할 수있다. 유리 병에 전체 절차를 수행합니다. 한 그룹에서 다른 배아가 다른 프로브에 의해 바라 보았다 될하려는 경우, 프로브는 첫날 변동과 노동을 줄이기 위해 추가 직전까지 하나의 유리 병에 보관하십시오.
    1. 프로브의 첨가에 대비하여 표 3 (워시 레시피 표 1 참조)에 설명 된대로 일련의 메탄올 배아를 재수. 조심스럽게 엠브리 소용돌이각 변경 후 운영 체제는이 측면 또는 서로 부착되지 않도록하고, nutator에 튜브를 장착하여 배아를 바위합니다. 액체를 전송하는 경우, 배아가 갇혀되지 않았는지 확인하기 위해 캡의 내부를 확인합니다.
    2. 표 3에 기재된 바와 같이 용액 중 프로브되면 배아를 밤새 혼성화.
  2. 프로브 솔루션을 제거합니다. 15 ㎖에 저장함으로써 저장 사용되는 프로브는 -20 ° C에서 날짜와 프로브가 사용 된 횟수로 표시 캡 폴리스티렌 튜브, 스크류.
    주 : 비색 반응이 원하는 강도에 도달하기 위해 비정상적으로 긴 시간이 걸릴 것을 시작까지 동일한 프로브 계내 혼성화에 대한 후속 여러 번 재사용 될 수있다.
    1. 프로브가 제거되면, 표 4에 제시된 일련의 세척을 통해 상기 프로브에 대해 항체 염색을 위해 배아를 준비한다. 온도를 변경 t를 이동하여 (표 4)를 필요에 따라직접 적절한 온도로 설정되어 하이브리드 레인지에 부착 된 배아의 병을 가진 그는 nutator.
    2. MAB의 적절한 음량을 확인 + HTSS + BR + 배아 항체를 첨가하기 전에 차단되도록 + HTSS + BR 차단 용액 MAB 배양되고 있음을 한번에 항 발굴 항체 (표 4) 배아. 사용의 날에 차단 솔루션은 신선한합니다.
  3. 항체 용액을 제거하고 항체와 하룻밤 배양 한 다음 표 5에 설명 된대로 세척을 시작합니다. 알칼리 포스 파타 아제 염색 기재를 준비하고 최대한 배경을 감소시키기 위해, 적어도 열두 30 분 세척을 수행한다. 세척 단계는 MAB 버퍼 또는 TBT 용액 (표 1)를 사용합니다.
    참고 : TBT 솔루션은 2 mg의이 TTW입니다 / BSA의 ㎖를 추가했다.
    1. BM 퍼플 알칼리 포스 파타 아제 기판과 마지막 세척 용액을 교체합니다. 염색 REAC를 수행실내 온도 37 ° C에서 하나의 기.
      참고 : 염색은 37 ° C에서 더 빠른하지만 밤새 방치하면, 받아 들일 수없는 배경 염색 종종 결과 일 수있다. 염색 반응은 종종 밤새 염색을 필요로하고 실내 온도가 이것에 대한 가장 안전하다.
    2. 또한 염색이 필요하며 BM 퍼플 솔루션은 푸른 색을 복용 한 경우 신선한 BM 보라색으로 염색 액을 교체하고 37 ° C의에 튜브를 넣어. 표적 mRNA의 매우 풍부한 경우, 밤새 4 ℃에서 염색 액에서 배아를 넣고 실온 배아를 움직이거나 37 ° C는 염색 반응을 더 잘 모니터링을 허용하도록.
    3. 최종 결과에 시간이 다른 대상 RNA를 사이에 상당한 차이로, 조심스럽게 새로운 반응을 모니터링합니다. 일관성을 위해, 이상 발생에 배양 발현은 새로운 사이트가없는 경우 (3.4) 염색 반응을 정지. 중요한 것은, 계내 혼성화 경우 세이로 사용되고다른 치료 그룹에서 찾고 실험, 치료 및 제어 배아 사이의 색상 반응에 대해 동일한 시간을 사용합니다.
  4. 염색 반응을 중지하고 표 6에 설명 된대로 액체를 변경하여 저장 및 이미지를 촬영할 수있는 배아를 준비합니다. 얼룩 제거는 배아 주변의 메탄올 보라색 색상으로 시각화 할 수 있기 때문에이 단계에서 배아를 흔들지 마십시오.
    참고 :이 무거운 배경 또는 공동 얼룩을 제거하기에 충분하지 않지만 종종 배아, 염색 액의 적어도 일부가 제거 할 수 있습니다 냉 메탄올에서 밝은 파란색 염색이있다. 냉 메탄올은 -20 ° C 냉장고에 유지되는 메탄올을 의미한다.
    1. 배아를 재수와 Mempfa (표 6)으로 얼룩을 수정합니다. 고정되면, Mempfa를 제거하고 25 % 메탄올로 배아를 씻으십시오.
    2. 25 %의 메탄올을 제거하고 경우 표백 용액을 추가 내인성 안료의 제거필요합니다. 화상을 입을 수 있으므로 표백 솔루션을 취급에주의하십시오. 상대적으로 빠르게 일어나고 표백의 정도가 서로 다른 효과 (그림 2)에 대한 변화 될 수 밀접하게 표백을 준수하십시오.
    3. 다음 표백 장기 저장을 위해 100 % 메탄올 메탄올 시리즈를 통해 탈수 배아, 또는 단기 보관 및 후속 이미징 PBS로 전송 (표 6 참조).

4. 이미징 태아

  1. 배아 염색 공정을 완료하면, 화상 배아 관심 유전자가 발현되는 위치에 정보는 넓은 청중 포착되도록. 해제되지 않은 배아를 볼 수 배경으로 아가로 오스 1 %를 사용합니다.
    참고 : 아가로 오스는 배아 및 염색 반응의 블루 컬러와 잘 대조 파란색 / 회색 배경을 제공합니다. 또한 산만 그림자와 배아의 관심을 전환 반사를 확산하는 데 도움이됩니다.
    1. 물에 아가로 오스 추가 아가로 오스 솔루션에 때까지 끓인다 다음 페트리 접시에 쏟아져 전에 50 식힌다. TAE 젤 솔루션과 마찬가지로, 여러 용도에 55 ° C 배양기에서 아가로 오스 솔루션을 저장합니다. 페트리 접시에 약 2 mm의 깊이로 아가로 오스를 따르십시오. 필요한 경우, 배경은 약간 다르게 그늘을 산출하기 위해 아가로 오스의 깊이를 조정합니다.
    2. 수용액 (PBS 또는 TTW)에 메탄올 저장에서 재수에 따라, 메탄올 시리즈를 사용하여, (표 6 참조) 아가로 오스베이스와 페트리 접시에 배아를 놓습니다. 깨끗한 솔루션을 유지하고 필요한 경우, 좋은 이미지의 깨끗한 배경을 방해 할 수있는 작은 입자상 물질을 제거하는 간단한 필터링을 사용합니다.
    3. 이미지와 같은 복부 측면에서와 같은 다른 뷰에서 배아는, 그림 3 미세 집게를 사용하여 배아를 맞게 (방향에 대한 그 채널에서 배아를 배치 아가로 오스 얇은 채널을 잘라 ). 그들은 쉽게 손상으로 배아를 조작에주의하십시오.
      주 : 대부분의 단계는 솔루션에 배치 때 가정 특성 위치를 가지고있다. 예를 들어, 포배 단계의 배아는 동물 쪽을 앉아서하는 경향이있다. 배아 신장하기 시작하면, 그들은 그들의 옆에 누워.
  2. 이미지에 깊이를 제공하는 배아에 그림자를 만들어, 얕은 각도에서 배아를 조명 및 표면 구조를 식별하는 데 도움이 광섬유 광원을 사용합니다. 표백 유용 랜드 마크를 제공 색소를 제거 할 수 있기 때문에 강력하게 표백 된 배아 그림자 사용합니다.
  3. 이러한 뇌, (그림 4)의 척색, 폐, 또는 지역에서와 같이, 깊은 배아 내에 이미지 염색에 배아를 취소합니다. 이를 위해, 100 % 메탄올까지 메탄올 일련 배아를 넣어.
    1. 메탄올 침지 완료 후, 용액의 한 부분과 벤질 알콜 배아를 전송하고 두 부분이있을 벤질nzoate (BABB). 초기 배아 표면에 떠 있지만 메탄올 BABB와 혼합, 그들은 BABB로 가라 앉는다. 유리 병이나 요리 BABB 다루는 모든 단계를 수행; BABB은 플라스틱이나 페인트를 녹여 것입니다.
    2. 일단, 클리어 배아 아래에서 오는 투과광와 배아를 볼 수 있습니다. 콘트라스트를 개선하고 최적의 색을 제공하기 위해 아래에서 광의 세기뿐만 아니라 각도를 조정한다.
    3. 보기 삭제 배아는 기본 떨어져 유리 페트리 접시를 제기합니다. 단순히 배아와 접시의 영역이 상승되도록을 높이기 위해 두 개의 다른 페트리 접시 뚜껑을 사용하여이 작업을 수행합니다.
      주 :이 초점을 취하고베이스 이미지를 방해 할 수 현미경 받침대 결함 나 얼룩에서 산만 한 효과를 제거하는 이점을 갖는다.

5 번에서의 현장 하이브리드

  1. 동시에 TW의 발현 양상를 이용하기 위해서는단일 배아 상이한 유전자 O를 두 프로브, 상이한 유전자 각각에 대한 하나의 합성. 전술 한 바와 같이 라벨로서 DIG-11-UTP를 이용하여 하나의 프로브를 합성. 계내 혼성화에서 단일 사용보다 3 배 더 농축 된 프로브를 수득 RNA 혼성화 완충액 전사 반응 생성물을 희석.
    1. DIG는 DIG-11-UTP 대체되어야한다는 레세 -12- 표지 된 프로브를 제외 UTP와 동일한 프로토콜을 사용하여 관심있는 다른 프로브를 합성. 계내 혼성화에서 단일 사용보다 3 배 더 농축 된 프로브를 수득 RNA 혼성화 완충액 전사 반응 생성물을 희석.
    2. : 1의 비율로 1 개의 농축 프로브를 섞는다. 최상의 결과를 위해 현장 하이브리드 프로토콜의 하나에서 가장 강한 표현을 보여줍니다 유전자의 형광 표지 된 프로브를 사용합니다.
  2. 현장 하이브리드 프로토콜에서 동일하게 사용이 <현장에서 하나에 대한 설명/ EM> 혼성화, 이중 프로브를 사용한 것 이외는 보체 단일 프로브 대신에 제 하루의 끝에 (디곡시 제닌 - 표지와 형광 표지 된 프로브의 1.5 배를 함유하는 혼합물을 농축 프로브).
    1. 안티 DIG-AP Fab 단편 대신에 4,000 희석 : 1에서 사용 방지 형광-AP Fab 단편을 제외하고, 현장 하이브리드 프로토콜의 이중의 두 번째 날에 단일 하이브리드 프로토콜을 따르십시오. 동일계 프로토콜에서와 같이 하나의 배아로부터 과량의 항체를 씻어 BM-AP 퍼플 기판을 사용하여 제 1 색 반응을 수행.
  3. 제 1 색 반응 후, 0.1 M 글리신 pH를 MAB에서 5-10 분간 세척 한 다음 2.0 40 분 flourescein 항체를 비활성화. 90 분 동안 MAB + HTSS + BR의 배아를 차단합니다. 1 항 DIG 항체를 추가 MAB + HTSS + BR 2,000 희석 4 ° C에서 하룻밤 배양한다.
    1. 다음 날 번째 배아를 씻어oroughly MAB (30 분의 12 세척)에 과량의 항체를 제거합니다.
    2. AP 버퍼에서 10 분 (표 1)의 배아를 세척 한 후 BCIP (AP 버퍼에서 0.5 ㎎ / ml)로 얼룩.
      참고 : 현장 조합은 제 1 색 반응과 두 번째 (그림 5)에 대한 빛 푸른 색 반응 어두운 파란색 보라색 얼룩을 제공해야합니다.
    3. AP 버퍼를 제거함으로써 최종 색 반응을 정지하고 MAB로 3 회 헹군다. 10 분 동안 Mempfa와 배아를 수정합니다. MAB 또는 TBT 5 빠른 세척과 배아를 씻으십시오.
    4. 그것은 BCIP 단독 색상을 제거하므로,이 색상 조합으로, 사후 염색 처리 메탄올의 사용은 더 이상 가능하지 않다. 0.02 %의 아 지드 화 나트륨과 함께 PBS에 고정하고 염색 후 배아 보관. 강도를 염색하는 것은 원위치에 두 번에 약이 될 수 있습니다. 이 문제라면, 4 개의 2 시간 기간의 각각을 세척을 감소시킨다.

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결과

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조직 특이 적 프로브의 사용은 특정 기관에 대한 개발의 상태에 관해서 뛰어난 정보를 제공 할 수있다. 다음 예에서, 배아 단계는 Nieuwkoop 및 파버 스테이징 테이블 (11)에 기초한다. 하나는 프로브 형태 분화 후 유전자 발현, 단계 28-30에서 심장 트로포 닌 I (예를 들어,도 1C), 차별화 된 장기의 존재 또는 크기를 사용하는 경우, 어느 단계 포스트 분화에서 평가 될 수있다. 몇 년 전, embryologists 초기 배아 12, 13의 조직학의 놀라운 지식을 바탕으로 이러한 분석을 수행 할 수 있었다하지만 전문 지식은 크게 embryologists의 현재 세대에 손실되었습니다. 하지만이 전문 손실은 연구원에 사용할 특정 조직을 식별하게 보체 기법의 신뢰성 및 사용의 용이성, 유감 고려 될 수있다. 상대적으로 눈에 띄지있는 조직, t배아 단계 25 예 (그림 1A)에서 선을 부화...

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토론

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특정 유전자의 발현 패턴을 시각화하는 계내 혼성화에 사용하는 능력은 제노 푸스 배아의 특정 기관 또는 세포 유형을 식별하기 위해 가장 일반적으로 사용되는 방법에 남아있다. 이는이 기술에 의해 제공되는 몇몇 이점이다. 유전자의 발현은 해당 셀 (18)의 명확한 경계하기 전에 심장 전구 세포에서 nkx2.5 식의 사례로 잘 분화의 조직 학적 서명하기 전에 특정 구조를 식별 할 수 있습니다. 모든 시약은 손에 이동 한 후에, 또한 매우 비용 효과적이다. 효과적으로 재사용 할 수있는 많은 개별 프로브의 세대는 약간의 여분의 시간과 관심의 유전자를 인코딩 플라스미드를 취득 이외의 비용을 투자 할 수있다. 우리의 경험에 의하면, 프로브는 각각의 사용과 함께 제공되는 피할 수없는 작은 희석에도 불구하고 활동에 약간의 손실이 년 동안 재사용 할 수있다. 마지막으로, 약간의 최적화 requi가빨간색은 다른 프로브를 사용하는 경우.

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공개 사항

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저자는 공개할 경쟁적인 재정적 이해관계가 없습니다.

감사의 글

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저자는 Steve Deimling의 펠로우십 지원에 대해 CIHR과 Steve Deimling, Rami Halabi 및 Stephanie Grover에 대한 지원에 대해 웨스턴 온타리오 대학교 소아과에 감사를 표합니다. 이 작업은 NSERC 보조금 R2654A11와 NSERC Discovery Accelerator Supplement의 지원을 받았습니다

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Labguake 튜브 쉐이커VWR17-08-2011
VWR 바이알VWR10-07-2012
L-CysteineBioShopCYS342.500
리보 뉴클레오 시드 트리 포스페이트 세트, 100mMRoche11277057001
Digoxigenin-11-UTPRoche11209256910
Rnase inhibator (Rnase OUT)인비트로젠 10777-019
T7 RNA 중합효소발효asEPO111
T3 RNA 중합효소발효asEPO101
SP6 RNA 중합효소fermentasEPO131
Dnase 1Invitrogen 18047-019
양 혈청  Wisent31150
차단 시약Roche11096176001
BM 보라색 Ap 기질Roche11442094001
Anti-Digoxigenin-Ap Feb 단편Roche11093274910
MethanolVWRCAMX0485-7
NaClBioShopSOD002.10
SDSEM 7910
EDTABioShopEDT001.500
TrisBioShopTRS003.5
Tween-20EM 9480
MgSO4시그마M-2643
MopsBioShopMOP001.250
EGTA시그마E-3889-25G
파라포름알데히드BioShopPAR070.500 
포름아미드  폭스바겐       CAFX0420-4 
RNA로슈10109223001
말레산  폭스바겐       CAMX0100-3
삼중나트륨 시트레이트BioShopCIT001
과산화수소 (30% 용액)EM HX0635-2
BSABioShopALB001.100
PVP-40ICN195451
Ficoll 400GE Healthcare17-0300-10
벤질 알코올시그마B-1042
벤질 벤조에이시그마B-6630
UltraPure 아가로스 인비트로젠 16500-500
트 년

참고문헌

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  1. Ninomiya, H., et al. Cadherin-dependent differential cell adhesion in Xenopus causes cell sorting in vitro but not in the embryo. J Cell Sci. 125, 1877-1883 (2012).
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  15. Smith, S. J., Kotecha, S., Towers, N., Latinkic, B. V., Mohun, T. J. XPOX2-peroxidase expression and the XLURP-1 promoter reveal the site of embryonic myeloid cell development in Xenopus. Mech Dev. 117, 173-186 (2002).
  16. Drysdale, T. A., Tonissen, K. F., Patterson, K. D., Crawford, M. J., Krieg, P. A. Cardiac troponin I is a heart-specific marker in the Xenopus embryo: expression during abnormal heart morphogenesis. Dev Biol. 165, 432-441 (1994).
  17. Carroll, T., Wallingford, J., Seufert, D., Vize, P. D. Molecular regulation of pronephric development. Curr Top Dev Biol. 44, 67-100 (1999).
  18. Tonissen, K. F., Drysdale, T. A., Lints, T. J., Harvey, R. P., Krieg, P. A. XNkx-2.5, a Xenopus gene related to Nkx-2.5 and tinman: evidence for a conserved role in cardiac development. Dev Biol. 162, 325-328 (1994).
  19. Davidson, L. A., Ezin, A. M., Keller, R. Embryonic wound healing by apical contraction and ingression in Xenopus laevis. Cell Motil Cytoskeleton. 53, 163-176 (2002).
  20. Hurtado, R., Mikawa, T. Enhanced sensitivity and stability in two-color in situ hybridization by means of a novel chromagenic substrate combination. Dev Dyn. 235, 2811-2816 (2006).

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