제브라 피쉬 배아 조직 특정 형광의 반 자동화 이미징을위한 프로토콜은 여기에 설명한다.
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이 논문에서
요약
초록
제브라 피쉬 배아는 작은 분자의 대규모 스크리닝을위한 강력한 도구입니다. 형광 리포터 단백질을 표현 형질 전환 지브라 피쉬 자주 유전자 발현을 조절하는 물질을 식별하는 데 사용된다. 라이브 제브라 피쉬에서 형광을 분석 실험 화학의 화면은 종종 높은 콘텐츠 심사를 위해 고가의 전문 장비에 의존하고 있습니다. 우리는 모터 단계 자동으로 이미지 제브라 피쉬 배아에 함께 표준 표면 형광 현미경을 사용하여 프로 시저를 설명하고 조직 특이 형광을 감지합니다. GFP의 발현을 통해 에스트로겐 수용체의 활동을보고 형질 전환 제브라 피쉬를 사용하여, 우리는 조직 특정 방식으로 기자를 활성화 에스트로겐 수용체 리간드에 대한 화면으로 반 자동화 된 절차를 개발했다. 이 비디오에서 우리는 96 - 웰 플레이트에 24-48시간 포스트 수정 (HPF)에서 제브라 피쉬 배아으로 배열 및 에스트로겐 수용체를 바인딩 작은 분자를 추가하는 절차에 대해 설명합니다. 72-96 HPF에서, 각각의 이미지를 잘에서전체 판을 자동으로 수집 및 수동으로 조직 특이 형광을 위해 검열된다. 이 프로토콜은 아니지만 간에서의 심장 판막의 수용체를 활성화 에스트로겐을 감지하는 능력을 보여준다.
서론
형질 전환 제브라 피쉬는 섬유 아세포 성장 1, 레티노 산 2 인자 라이브 배아, 3 에스트로겐과 같은 경로를, 신호의 활동의 직접적인 시각화 수 있도록 개발되었다. 이러한 도구는 (형광 강도의 변화로 정량) 신호 전달 경로를 교란 화학 물질 또는 조직 특이하게 4 (형광 현지화의 변화)에 신호를 변조 화학 물질에 대한 검사를 가능하게합니다. 자동 이미지 캡처는 크게 5,6 화학 화면의 처리량을 증가시킨다. 라이브 제브라 피쉬의 자동 분석 형광 종종 고가의 전문 장비에 의존 화면. 소위 높은 콘텐츠 심사는 높은 해상도, 양적 이미징하지만, 공 초점 현미경 7,8에 장착 된 특수 플레이트 리더를 사용하는 비용의 혜택을 제공합니다. 이 방법의 목적은 제브라 피쉬 배아 자동 분석 조직 특이 형광하다표준 표면 형광 현미경을 사용하여 96 - 웰 플레이트에. 조직 특이 형광이 기술을 사용하여 구분할 수 있습니다 전문 플레이트 리더 또는 높은 콘텐츠 검사 장치에 대한 액세스를 부족 실험실을위한 합리적인 방법이 될 수 있습니다.
이 프로토콜에서는, 우리는 3 일 포스트 수정 (DPF)에서 조직 특정 에스트로겐 수용체 (ER) 라이브 제....
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프로토콜
참고 :이 프로토콜은 버밍엄 기관 동물 관리 및 사용위원회에 위치한 앨라배마 대학에 의해 승인되었습니다.
1. Zebrafish의 사육 및 계란 컬렉션
- 사흘 화학 물질 노출을 시작하기 전에, 별도의 남성과 여성에 대한 분할을 사육 탱크를 조립합니다. 양식 시스템 물을 각 탱크의 중간을 입력합니다. 칸막이로 구분하여 각각의 탱크에 2 명의 남성과 3 명의 여성을 배치, 사육 탱크에 c262/c262 물고기 : 그물을 사용하여,의 Tg (GFP 5xERE)을 전송합니다. 각각의 탱크에 뚜껑을 배치하고 날짜와 교차하는 긴장과 레이블.
- 다음날 아침, 모든 장벽을 제거하고 기울기는 사육 수조의 한쪽 끝에서 얕은 지역을 만들기 위해 배플. 제브라 피쉬의 정확한 발달 준비를하기 위해 10 분 간격으로 배아를 수집, 짝짓기를 할 수 있습니다. 배양 접시에 E3B 매체 부드럽게 세척 배아를 사용하여 차 여과기를 세척하여 청소 계란. 영구적으로 성인 물고기를 반환탱크.
- 해부 현미경을 사용하여, 정렬, 계산, 및, 미 수정의 이상 또는 손상 배아를 제거합니다. 어두운주기 : 14시 10분 빛으로 28.5 ° C에서 E3B 매체와 집에있는 페트리 접시에있....
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결과
그림 1은 96 - 웰 플레이트의 각각의 우물에서 합성 이미지를 보여줍니다. 각 합성 이미지는 5 % 이미지 중첩 59 개별 이미지로 구성되어 있습니다. 라이브 제브라 피쉬가 아니라 각 내에서 무작위로 지향, 아직 우리가 간에서 중심에 형광을 구별 할 수있게되어 있습니다. 시야 이미지는 제브라 피쉬의 방향을 평가하고, 형태 학적 이상 (그림 1A와 1C)를 시각화에 대한 참조로서 유용하다. 10 배 목표를 사용하여 자동화 된 영상이 화학 물질을 화면과 높은 배율에서 수동 평가 보증을 결정하는 데 사용된다. 2도 더 자세한 분석을 위해 20 배 긴 작동 거리 목표로 촬영 한 이미지를 보여줍니다. 이러한 이미지는 현미경 스테이지에서 플레이트를 제거하지 않고도 1에 도시 된 자동화 된 주사 직후 촬영했다. 20 배 목표를 사용하여 마음에 형광 정확하게 심장 발을 지역화 할 수 있습니다VES (그림 .......
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토론
이 프로토콜은 제브라 피쉬 배아에 자동으로 이미지 조직 특이 형광을 간단한 방법을 설명합니다. 프로토콜은 자이스의 Axio 옵저버를 사용하여 개발되었습니다. Z1은 선 블루 2011 소프트웨어와 함께, 그러나이 기술은 합성 이미지를 만들 수 타일링을 수행 할 수있는 자동화 된 무대와 현미경 제어 소프트웨어와 함께 모든 거꾸로 현미경을 사용하여 적용 할 수 있습니다. 전동 무대 거꾸로 현미경을 갖추는 것은 높은 콘텐츠 심사를위한 전문 장비를 구입에 실제보다 저렴한 대안을 제공 할 수 있습니다. 전동 스테이지는 스테이지의 현미경과 품질의 제조업체와 모델에 따라 수천에서 미국 달러의 수만에 이르기까지 다양합니다.
프로토콜 내에서 몇 가지 중요한 단계가 있습니다. 일부 화학 물질에 따라서는 치료 기간 동안 어둠 속에서 배아를 배양하는 것이 도움이 될 수 있습니다, 광 감응성. 제브라 피쉬 배아는 탈수에 민감합니다. 따라서, CHEMI에 대한칼 노출 하루 이상 지속은 증발 (프로토콜 .......
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공개 사항
저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없습니다.
감사의 글
우리는 수잔 농부와 제브라 피쉬의 치료에 대한 UAB의 제브라 피쉬 연구 시설의 직원을 감사드립니다. 약리학 및 독물학의 부에서 창업 자금에 의해 제공되는 자금.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 플라스틱 이송 피펫; 넓은 구경 | Fisher | 13-711-23 | |
| 플라스틱 이송 피펫; 파인 팁 | Fisher | 13-711-26 | |
| 96-웰, 원형, 평평한 바닥 플레이트 | Fisher | 21-377-203 | |
| 100 x 35 mm 플레이트 | Fisher | 08-757-100D | |
| 35 x 60 mm 플레이트 | Fisher | 08-757-100B | |
| Dumont #5 파인 | 사이언스 도구 | 11254-20 | 팁 치수 0.05 x 0.01 mm, 배아에서 chorions를 수동으로 제거하기 위한 |
| Tricaine methanesulfonate | Sigma Aldrich | A5040-25G | 레시피는 제브라피쉬 책 참조 (http://zfin.org/zf_info/zfbook/chapt10.html#wptohtml63) |
| 1-페닐 2-티오우레아(PTU) | 시그마 알드리치 | P7629-10G | 20mM 재고(100x)를 준비하고 200°C에서 사용합니다. E3B의 M |
| Zeiss Axio Observer Z1 | Carl Zeiss | 있는 도립 형광 현미경이 필요합니다 | |
| Carl Zeiss | 0.4 NA 및 8.4mm 작동 거리가 있는 대물렌즈를 사용합니다 | ||
| Axiocam HRm 디지털 카메라 | Carl Zeiss | ||
| ZenBlue 2011 현미경 제어 소프트웨어 | Carl Zeiss | 프로토콜은 모터화된 스테이지를 사용하여 타일 이미지를 캡처할 수 있도록 현미경 자동화 및 제어 소프트웨어를 필요로 합니다. | |
| Methylene Blue | Sigma Aldrich | MB-1; 25그램 | RO 물에 2% 용액을 만들어 E3B (아래)E3B |
| 60X E3 용액에서 사용하기 위한 것입니다. 해결책: NaCl - 17.2 그램 KCl - 0.76 그램 < / > CaCl2< / sub>-2H 2< / sub>O - 2.9 그램 MgSO4-7H2O - 4.9 그램 또는 MgSO4- 2.39 그램 1 리터 Milli-Q 물에 용해시킵니다. 멸균 1리터 병에 보관하십시오. 1X E3B 제브라피쉬용 솔루션: 60X E3 150 ml 2% 메틸렌 블루 100 &뮤; 엘 Milli-Q water 로 9리터로 사용 |
참고문헌
- Molina, G., Watkins, S., Tsang, M. Generation of FGF reporter transgenic zebrafish and their utility in chemical screens. BMC Developmental Biology. 7, 62(2007).
- Perz-Edwards, A., Hardison, N. L., Linney, E. Retinoic acid-mediated gene exp....
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재인쇄 및 허가
