이 프로토콜은 흡입 독성 화학 물질을 세포 배양의 노출 방법을 설명하기 위해 설계되었습니다. 차별화 된 공기 - 액체 인터페이스기도 상피 세포 (ALI) 문화의 노출은 염소와 같은 독성 가스에기도 노출의 독특한 모델을 제공합니다. 이 논문에서 우리는 염소 상피 세포의 공기 - 액체 인터페이스의 문화에 대한 노출과 심근의 침수 문화의 영향을 설명합니다. 체외 노출 시스템이 중요한 기전 연구는 다음 새로운 치료제를 개발하는 데에 이용 될 수있는 경로를 평가할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
세포 배양은 이전의 동물 모델에서의 사용에 대한 치료제의 효능을 개발하고 연구하는 것이 필수적이다. 우리가 잘 분화 된 인간기도 상피 세포와 심장 근육 세포를 모델링 할 수있는 독특한 기능이 있습니다. 이것은 일반적으로 세포 표면과 상호 작용하고, 물과 반응하고, 침수 문화에 미치는 영향을 제한에 따라 다양한 부산물을 형성 할 수있는 염소 등의 유해 화학 물질 흡입,의 해로운 효과를 연구하는 귀중한 도구가 될 수 있습니다. 공기 liqiuid 인터페이스에서 잘 분화 된 인간기도 상피 세포 배양을 이용하여 우리의 모델은 이러한 제한을 우회뿐만 아니라 잠재적 인 독성 흡입 화학 물질의 독성의 중요한 메커니즘을 평가하는 기회를 제공한다. 우리는 막 무결성의 강화 손실, 염소 노출 같은 독성 화학 물질 흡입시 카스파 릴리스과 죽음에 대해 설명합니다. 이 문서에서는, 우리는 포유 동물의 마음과기도 상피 C 염소 노출을 모델링하는 방법을 제안한다문화와 이러한 종류의 세포에 미치는 영향을 평가하는 간단한 테스트에서 ELL 학생.
서론
독성 화학 물질 흡입 (TICS)에 노출 / 염소 (망할 CIA 2) 등의 가스 사고 피폭뿐만 아니라 화학 물질의 위협으로 자신의 잠재적 인 사용의 지속적인 건강 관심사 남아있다. 폐는 기본 목표이지만, 심장과 뇌 등의 장기는 생체 내 모델이 일반적으로 틱에서 테스트 독성에 사용됩니다. 1-3에 영향을하지만, 독성 평가를위한 시험 관내 분석에서 비용 효과, 간단한 빠르고 더 있습니다됩니다.에서 체외 모델은 생체 내에서 평가하기 어려울 수 있습니다 에이전트 세포 상호 작용의 광범위한 조사를 할 수 있습니다. 이러한 체외 노출 시스템은 드물고 또한, 독성 에이전트가 세포가 침수되는 배양 배지에 첨가되는 일부 기존 모델에, 에이전트의 속성으로 인해 상호 작용과 매체의 구성 요소에 바인딩을 변경할 수 있습니다. 같은 이러한 시나리오 세포 배양 시스템에서 공기 - 액체 계면 (ALI직접 가스 에이전트에 노출 될 수 있습니다 여기에 제안 된 기본 인간기도 상피 세포의) 문화가 유망 될 수 있습니다.
기도를 안 감 상피 세포 흡입 독성 화학 물질에 대한 방어의 첫 번째 라인이다. 인간기도 상피는 폐의 루멘 및 기본 세포 사이의 물리적....
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프로토콜
1. 쥐 심근 문화
- 모든 실험은 기관의 동물 관리 및 사용위원회, IACUC 승인 프로토콜에 따라 수행되었다.
- 이전에 4 설명한 방법을 사용하여 수컷 쥐의 마음 (심실) (2백40~2백60g)에서 쥐의 심근 세포를 얻습니다. (100 ㎎ / ㎏, 발가락 핀치 방법으로 마취를 확인) 간단히, 펜토 바르 비탈의 복강 내 주사를 사용하여 동물을 마취 한 후 10.0 ㎖, 크렙스 링거 버퍼, 산도 7.4를 포함하는 1 ㎜ 칼슘 2 +에 마음을 제거합니다.
- 혈액을 제거하고 0.02 %의 단백질 분해 효소와 0.06 %의 콜라게나 제 (5.0 ㎖ / 마음)를 포함하는 칼슘 2 + 무료 크렙스 링거 버퍼로 전환 마음에게 5 - 6 배를 씻어. 가끔 흔들면서 37 ° C에서 10 ~ 15 분 동안이 솔루션의 마음을 품어.
- 15 분 후, 추가로 5 분 동안 칼슘 2 + 무료 크렙스 링거 버퍼 효소 솔루션을 세척 할 것. 이완 된 조직을 우리로부터 세포를 해제위아래로 여러 번 현탁액을 피펫으로 25 ㎖의 피펫을 보내고.
- 70 μm의 나일론 메쉬를 필터링하여 조직에서 세포를 분리하고 0.1 밀리미터 칼슘 2 +를 포함 크렙....
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결과
기본 막대 모양의 심근은 라미닌 행렬에 연결하고 (그림 1A 및 삽입)를 확산하고 융합 문화로 분화. 이들 세포는 더 sarcomeric 액틴 및 SERCA2 식 (도 1B 및 1C)에 기초하여 특징으로 하였다. 쥐의 심근은 라미닌 코팅 된 멤브레인 (그림 1D)에 성장 세포에 잠긴 문화와 합류 층의 중단에 광범위한 세포 반올림과 죽음을 야기 100 ppm의 염소에 15 분 노출로 염소의 독성에 매우 민감하다. 카스파에 삽입한다 (그림 1E)에 성장 심근의 3 / 7 릴리스 된 바와 같이이는 사멸 세포 죽음을 강화했다.
차별화 된 인간기도 상피 세포의 노출 (세포 배양의 단면을 보여주는 패널 1 인세 그림 2, 컬럼에 삽입 섬모 세포 고블릿) 염소 벗는와 난생 일으켰(100 ppm)를 고 (300.......
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토론
하나는 폐에 유독 한 화학 물질을 호흡 할 때 급성 독성 노출의 가장 일반적인 유형은 발생합니다. 이러한 화학 물질은 신속하게 혈류에 흡수 될 수 있고, 뇌와 심장 등 다른 장기에 영향을 미칠 수 있습니다. 동물 모델을 사용하여 여러 에이전트의 흡입 독성을 연구하고 널리보고, 그러나 메커니즘은 덜 잘 이해된다. 이는 효과적인 치료 개발에 주요 장애물이다. 체외 노출 시스템의 부재는 기계적인 통찰력의 부족 뒤에 가장 큰 이유입니다. 여기에서 우리는 심장 근육과기도 염소 노출 독성 흡입 화학 물질의 영향을 연구하는의 세포 배양 모델을 설명합니다. 염소는 염산과 차아 염소산 3,11,12을 형성하는 수성 표면에 빠르게 반응한다. 염소는 또한 표면 (13)을기도의 중요한 단백질 및 효소의 산화를 초래할 수있다 반응성 화합물을 생성하는 반응성 산소 종 (ROS)와 결합 할 수있다. 연구침수 문화를 사용하는 것은 단지 염소의 경우에는보다는 가스 자체에서 이러한 유리 HOCl와 같은 .......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
이 연구는 CounterACT와 프로그램, 국립 보건원 (NIH), 이사의 사무실 및 환경 보건 과학 연구소 (NIEHS) 부여 번호 U54 ES015678 (CWW)에 의해 지원된다. SA는 어린이 병원 광산 공동 파일럿 보너스 번호의 G0100394 및 아동 병원 콜로라도 연구 Institue 파일럿 상 # 1 G0100471 콜로라도 / 콜로라도 학교에서 지원됩니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 쥐 | Harlan Laboratories | Sprague-Dawley | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P3761 | |
| Chlorine | AirGas, Inc | X02NI99CP163LS1 | |
| Caspase 3/7 키트 | Promega | G8091 | |
| 상피 전압저항계와 젓가락 전극 | 세계 정밀 기기 | EVOM 및 STX2 | |
| Snapwell 삽입 | Corning | 07-200-708 | |
| 70 마이크론 나일론 셀 여과기 | Corning | #352360 | |
| Polysulfone 생물 격리실 | BCU, Allentown 케이지 장비 | BCU | |
| DMEM | Life technologies | 12491-015 | |
| Sarcomeric actin 항체 | Abcam Cambridge, MA | ab28052 | |
| SERCA2 항체 | 친화성 생물 시약, Golden, CO | MA3-9191 | |
| Ki-67 항체 | Dako, Carpinteria, CA | M7248 | |
| Alexa 488-conjugated secondary 항체 | Invitrogen, Grand Island, NY | A11029 | |
| BSA | 시그마-알드리치 | A9418 | |
| 카르니틴 | 시그마-알드리치 | C0283 | |
| 타우린 | 시그마-알드리치 | T8691 | |
| 크레아티닌 | 시그마-알드리치 | C6257 | |
| 크렙스 링거 버퍼 | 시그마-알드리치 | K4002 | |
| 프로테아제 | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| 콜라겐 분해 | 효소 Sigma-Aldrich | C6885 | |
| DNAase | Sigma-Aldrich | DN-25 | |
| 젖산 링거 용액 | Abott Laboratories | 7953 | |
| 당나귀 혈청 | Fisher Scientific | 017-000-001 | |
| PBS, 인산염 완충 식염수 | Sigma-Aldrich | D1408 | |
| 4-15% SDS-PAGE 젤 | Bio-Rad | 456-1083 | |
| 니트로셀룰로오스 막 | Bio-Rad | 162-0115 | |
| Dergent, Tween | Sigma-Aldrich | P1379 | |
| 과산화효소 검출 키트 | Pierce | 3402 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | |
| 장착 매체, Fluormount G | eBiosciences | 00-4958-02 | |
| 구연산나트륨 | Sigma-Aldrich | 71497 | |
| 콜라겐 | Sigma-Aldrich | C7521 | |
| MEM | 시그마-알드리치 | M8028 | |
| 라미닌 | BD 생명과학 | 354259 | |
| 페니실린/스트렙토마이신 | 생명 기술 | 15070063 | |
| FBS | Gibco | 200-6140AJ |
참고문헌
- Mohan, A., et al. Acute accidental exposure to chlorine gas: clinical presentation, pulmonary functions and outcomes. Indian J Chest Dis Allied Sci. 52, 149-152 (2010).
- Kose, A., et al.
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재인쇄 및 허가
