방법 논문

선형 증폭 매개 PCR - 알 수없는 측면에서는 DNA의 유전 적 요소와 특성의 현지화

DOI:

10.3791/51543

⸱

2014년 6월 25일

 ,  ,  ,  , 
1Department of Translational Oncology, National Center for Tumor Diseases (NCT) and German Cancer Research Center (DKFZ)

이 논문에서

요약

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선형 증폭 중재 (LAM)-PCR은 게놈에 바이러스 벡터를 통합의 정확한 위치를 식별하기 위해 개발 된 방법입니다. 이 기술은 유전자 치료 환자 등 새로운 벡터 기술, T-세포의 다양성, 암 줄기 세포 모델의 바이오 안전성에 클론 역학을 공부하는 우수한 방법으로 진화하고있다

초록

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Linear-amplification mediated PCR(LAM-PCR)은 통합 벡터 시스템을 사용하여 유전자 요법으로 치료받은 환자의 유전자 교정 세포에서 조혈을 연구하기 위해 개발되었습니다. 레트로바이러스 벡터의 안정적인 통합으로 인해 통합 부위는 개별 세포와 그 자손의 클론 운명을 연구하는 데 사용할 수 있습니다. LAM-PCR은 유전자 치료 환자에서 백혈병이 프로바이러스에 의해 유도된 이웃 원발암유전자의 과발현에서 비롯되었다는 증거를 처음으로 제공했다. inverse PCR 및 ligation mediated (LM)-PCR과 같은 기존 방법에 비해 LAM-PCR의 높은 민감도와 특이도는 biotinylated vector specific primer를 사용하는 초기 사전 증폭 단계(100주기의 선형 PCR)를 통해 달성되며, 이를 통해 후속 반응 단계를 고체상(magnetic beads)에서 수행할 수 있습니다. LAM-PCR은 현재 알려진 DNA에 근접한 알려지지 않은 DNA를 식별하는 데 사용할 수 있는 가장 민감한 방법입니다. 최근에는 제한 소화를 우회하여 통합 부위의 검색 편향을 없애고 숙주 게놈에서 프로바이러스 위치를 종합적으로 분석할 수 있는 LAM-PCR의 변이가 개발되었습니다. 다음 프로토콜은 integrated lentiviral vector에 인접한 3' 및 5' sequence의 증폭을 단계별로 설명합니다.

서론

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선형 증폭 PCR (LAM-PCR)을 매개하는 모든 근원의 알려진 DNA에 인접한 알 수없는 측면에서는 DNA를 식별하고 특성화 할 수 있습니다. 보다 구체적으로, LAM-PCR은 숙주 게놈 내에서 1,2 (IS) 바이러스 벡터의 삽입 부위를 집중하기 위해 개발되었다. 레트로 바이러스 나 트랜스포존과 같은 유전 적 요소는 (반) 임의의 방식 3-6 호스트 게놈에 자신의 게놈을 통합 할 수 있습니다. 많은 경우에 이러한 벡터가 통합 정확하게 위치를 알고 결정적이다. LAM-PCR은 결찰 매개 PCR 7 및 그 변종 또는 역 PCR 8와 같은 대체 기술에 우수한 것으로 입증되었습니다. 이 방법의 감도와 견고성은 벡터 게놈 접합 증폭 PCR 제품의 자기 선택의 최초의 프리 앰프에서 발생한다. 언급 된 다른 방법과 마찬가지로, LAM-PCR은 9-11의 검색 능력에 편견을 도입, 제한 효소의 사용에 의존한다. 따라서,IS 레퍼토리 (integrome)의 서브 세트 만이 하나의 반응에서 검출 될 수있다. 이 바이어스는 제한 효소 (9)의 최적의 조합을 사용하여 주어진 샘플의 병렬 분석을 통해 최소화된다. 최근 기술의 변형은 제한 효소의 사용을 우회 한 번의 반응 9,12있는 샘플의 공정한 게놈 넓은 해석을 허용하는 LAM-PCR (nrLAM-PCR)이 개발되었다 비 제한 칭했다.

과거에는, LAM-PCR은 원인 레트로 바이러스가 유전자 치료 임상 시험 13 ~ 15에서 몇 환자에서 백혈병에 상승을주고 식별하는 데 사용되었습니다. 그 이후로, LAM-PCR을 식별하기에 적합 한 다른 통합 벡터 (렌티 바이러스 벡터, 트랜스포존) 또한 수동적으로 아데노 - 관련 벡터 (AAV) 또는 인테그라 불량 렌티 바이러스 벡터 (IDLV)와 같은 벡터를 통합하는 통합 패턴을 식별 할 수에서 (16) -21. LAM-PCR의 응용 프로그램은 광범위한 확산되어 기존의LY,이 기술은 널리 유전자 치료를받은 환자에서 유전자 변형 세포의 클론 구성을 공부하거나 통합 문제 15,16,22-24을 탈피하여 새로운 벡터 시스템의 바이오 안전성을 평가하는 데 사용됩니다. 최근, LAM-PCR은 IDLV 트래핑 분석 (25)에 의해 특이 디자이너 클레아의 오프 대상 활동을 결정하는 사용.

또한, LAM-PCR 쉽게 유기체에서 시간이 지남에 형질 세포의 운명을 수행 할 수 있습니다. 이 프로토 암 유전자뿐만 아니라 종양 억제 유전자를 확인하고 또한 조혈 또는 암 줄기 세포 생물학 26-28을 연구 할 수 있습니다. 마지막으로 적어도, LAM-PCR은 인간 29 (및 게시되지 않은 데이터)에 T-세포 수용체의 다양성을 연구하기 위해 적응했다.

기술의 본질적인 힘은 단일 염기 R과 함께 알 수없는 측면에서는 DNA의 수백만의 특성을 허용 깊은 시퀀싱 기술과 방법을 연결하여 강화전체 게놈의 esolution. 다음과 같은 프로토콜에서, 우리는 단계별로 증폭 및 렌티 바이러스 벡터입니다 확인하는 예시 적으로 알 수없는 DNA를 측면에서는 식별을 설명합니다. 프로토콜에 사용 된 올리고 뉴클레오티드. 어떤 소스의 추출 된 DNA 또는 cDNA를이 LAM-PCR 및 nrLAM-PCR을위한 DNA 템플릿으로 이용 될 수는 표 1에 나타내었다.

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프로토콜

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링커 카세트 1. 준비 (LC)

  1. LC1 올리고 뉴클레오티드 (표 1), (적절한 제한 효소 오버행 표 1) LC2 올리고, 110 ㎕의 트리스 - 염산 (100 ㎜, 산도 7.5), 10 ㎕의 250 mM의 MgCl2를 40 μL의 40 μl를 섞는다.
  2. 5 분 95 ° C에서 품어 반응이 실온으로 천천히 냉각 할 수 있습니다. 300 μL의 H 2 O를 추가하고 원심 분리 필터에 dsLinker-DNA를 집중한다. 0.2 PCR 튜브에 준비 링커 카세트의 용출액과 나누어지는 10 μL에 80 μL의 H 2 O를 추가합니다.

벡터 게놈 접합 2. 프리 앰프

  1. 분석 할 수있는 모든 샘플은 50 ㎕의 PCR 반응을 준비합니다.
    1. DNA 샘플의 농도를 결정합니다. 피펫은 X μL (1-1,000이 nrLAM에 겨 LAM/100-1, 000 겨) 0.2 ML PCR 튜브에 DNA의. DNA의 양이 각각의 샘플과 RAN에서 동일해야합니다0.5-25 μL의 GE.
    2. 표 2에 설명 된대로 PCR 마스터 믹스를 준비 믹스 (50 - X). 0.2 ML PCR 튜브에 각각의 DNA 샘플과 마스터 믹스 μL.
  2. PCR을 완료 한 후. 표 2에 예시 된 PCR 조건을 사용하여 프리 앰프를 벡터 게놈 접합 각 PCR 튜브를 다시 실행 PCR 프로그램의 Taq 중합 효소 μL 0.5을 추가합니다. PCR 제품은 -20 ° C에서 최대 4 일 ~ 장기 4 ° C에 저장할 수 있습니다

PCR 제품의 3. 자기 분리

  1. 자석 구슬의 준비
    1. 피펫 (20) 1.5 ML 튜브에 스트렙 타비 딘 코팅 자석 구슬의 μL (200 μg) 및 상온에서 자성 입자 분리기 (MPS)에 1 분간 노출. 상층 액을 버린다.
    2. MPS에서 튜브를 제거하고 40 ㎕의 PSB / 0.1 % BSA (산도 7.5)에 자석 구슬을 재현 탁. 1 분 동안 MPS에 노출하고 상층 액을 버린다. 일단이 단계를 반복합니다.
    3. 워시 무선 비즈3 M의 LiCl 용액 20 μL 번째 (3 M LiCl을, 10 mM 트리스 - 염산, 1 ㎜ EDTA)은 1 분 동안 MPS에 노출하고 상층 액을 버린다. 6 M의 LiCl 용액 (6 M LiCl을, 10 mM 트리스 - 염산, 1 ㎜ EDTA)의 50 μL에 재현 탁 구슬.
  2. 준비 자석 구슬의 50 μL와 2.2 단계에서 전체 PCR 반응을 섞는다. 적어도 실온에서 2 시간 동안 수평 진탕 기 (300 RPM)에 품어. 이 단계는 코팅 된 비즈 (구슬 DNA 복합체를) 스트렙 타비 딘에 바이오틴 PCR 제품의 결합을 할 수 있습니다. DNA 구슬 복잡한 하룻밤 진탕 배양 또는 최대 4 일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
  3. 실온에서 1 분 동안 MPS에 DNA 비드 복잡한 노출, 상층 액을 제거하고 100 μL의 H 2 O의 DNA 비드 복잡한을 재현 탁 즉시 LAM 또는 nrLAM을위한 5 단계에 대해 4 단계를 진행합니다.

4. LAM-절차

  1. 이중 가닥 DNA (dsDNA) 합성 (LAM 전용)
    1. 1 분 및 표시에 대한 MPS 단계 3.3에서 DNA 비드 복잡한 노출카드 뜨는. 8.25 H 2 O의 μL, 1 μL 배 hexanucleotide 버퍼 0.25 μL의의 dNTPs (10 ㎜) 0.5 μL (2 U) 클레 나우 중합 효소를 추가합니다. 1 시간 동안 37 ℃에서 배양한다.
    2. H 2 O의 90 μl를 추가하고 1 분 동안 MPS에 노출. 100 μL의 H 2 O에 뜨는에 resuspend DNA 비드 복잡한 폐기
  2. 제한 다이제스트
    1. 1 분 동안 MPS에 DNA 비드 복잡한을 노출하고 상층 액을 버린다. 8.5 μL의 H 2 O, 1 ㎕의 10 배 제한 효소 버퍼와 제한 효소의 0.5 μl를 추가하고 1 시간 동안 반응을 품어. 4.1.2 단계를 반복합니다.
      참고 : 제한 효소의 제조업체에서 권장하는 온도에서 반응을 품어. 제한 사이트 내에 존재하는 또는 관심의 DNA에 프리 앰프에 사용되는 프라이머 결합 부위의 다운 스트림이 없는지 확인합니다. 적당한 제한 효소 / 제한 효소 조합의 선택을 위해 9를 참조하십시오.
  3. 결찰 DS의 링커 (LK)
    1. 1 분 동안 MPS에 DNA 비드 복잡한을 노출하고 상층 액을 버린다. 5 μL의 H 2 O, 1 ㎕의 10 배 FastLink 버퍼, 1 μL의 ATP (10 ㎜), 단계 1.2 ~ 2 μL 링커 카세트, 1 ㎕를 고속 링크 DNA 리가 제 (2 U / μL)를 추가합니다. 5 분 동안 실온에서 배양한다. 4.1.2 단계를 반복합니다.
  4. 신시 dsDNA의 변성
    1. 1 분 동안 MPS에 DNA 비드 복잡한을 노출하고 상층 액을 버린다. 5 ㎕를 0.1 N 수산화 나트륨에 재현 탁 DNA 비드 복잡한. 가로 통에 실온에서 5 분 알을 품다.
    2. 1 분 동안 MPS에 DNA 비드 복잡한을 노출하고 새로운 1.5 ML 튜브에 뜨는을 포함 증폭 된 벡터 게놈 접합을 수집합니다. 즉시 -20 ℃에서 6 단계 또는 저장 상층 액을 진행

5. nrLAM - 절차

  1. 단일 가닥 링커의 결찰 (SSLC) (nrLAM 만)
    1. MPS에 단계 3.3에서 DNA 비드 복잡한 노출1 분 및 폐기 뜨는하십시오. 6.5 μL의 H 2 O를 추가, 1 ㎕의 10 배 반응 버퍼, CircLigase 0.5 ㎕의 MnCl 2 (50 ㎜), 0.5 ATP (1 ㎜) μL, 1 μL의 ssLinker 올리고 0.5 μL의 CircLigase (100 U / μL). 1 시간 동안 60 ° C에서 알을 품다.
    2. H 2 O의 90 μl를 추가하고 1 분 동안 MPS에 노출. 뜨는을 취소하고 100 μL의 H 2 O의 DNA 비드 복잡한 세척 다시 10 μL의 H 2 O에서 1 분, 폐기 뜨는에 resuspend DNA 비드 복잡한에 대한 MPS에 노출

6. 지수 증폭 I

  1. 분석 할 수있는 모든 샘플은 50 ㎕의 PCR 반응을 준비합니다.
    1. 피펫 2 μL 템플릿 (단계 4.4.2 (LAM부터) 또는 5.1.2 (nrLAM)) DNA 0.2 ml의 PCR 튜브에.
    2. 표 3에 설명 된대로 PCR 마스터 믹스를 준비합니다. 단계 6.1.1에서 각각의 샘플에 마스터 믹스 48 μl를 추가하고 PCR 컨디셔닝 시스템에 의해 벡터 게놈 접합을 증폭표 3에 예시 된 NS는. PCR 제품은 -20 ° C에서 최대 4 일 ~ 장기 4 ° C에 저장할 수 있습니다

PCR 제품의 7. 자기 분리

  1. 3.1.3 - 3.1.1 단계에 예시 된 바와 같이 자석 구슬을 준비합니다. (LAM에 대한) 20 μL 6 M의 LiCl 용액 (6 M LiCl을, 10 mM 트리스 - 염산, 1 ㎜ EDTA)의 (nrLAM에 대한) 50 μL에 재현 탁 구슬. 20 μL (LAM) 또는 준비 자석 구슬 단계 6.1.2에서 PCR 반응 (단계 7.1) 50 μL (nrLAM)를 혼합하고 실온에서 2 시간 동안 수평 진탕 기 (300 RPM)에 품어. DNA 구슬 복잡한 하룻밤 진탕 배양 또는 최대 4 일 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다.
  2. 1 분 MPS에 DNA 비드 복잡한 노출, 상층 액을 제거하고 100 μL의 H 2 O의 DNA 비드 복잡한을 재현 탁 1 분 동안 MPS에 DNA 비드 복잡한을 노출하고 상층 액을 버린다.
  3. 20 μL (LAM) 또는 5 μL (nrLAM) 0.1 N 수산화 나트륨에 재현 탁 DNA 비드 복잡한. 인큐가로 통에 실온에서 10 분 동안 BATE는 1 분 MPS에 노출 새로운 1.5 ML 튜브에서 증폭 된 DNA가 포함 상층 액을 수집합니다. 즉시 -20 ℃에서 8.1 단계 또는 저장 상층 액을 진행

8. 지수 증폭 II

  1. 분석 할 수있는 모든 샘플은 50 ㎕의 PCR 반응을 준비합니다.
    1. 0.2 ML PCR 튜브에 (단계 7.3) 피펫 2 μL 템플릿 DNA.
    2. 표 4에 설명 된대로 PCR 마스터 믹스를 준비합니다. 단계 8.1.1에서 각각의 샘플에 마스터 믹스 48 μl를 추가하고 표 4에 예시 PCR 조건에 벡터 게놈 접합을 증폭. PCR 제품은 최대 4 동안 4 ° C에 저장할 수 있습니다 -20 ° C에서 일 또는 장기
  2. 시각화 (NR) LAM-PCR 제품, 2 % 아가로 오스 겔상에서 단계 8.1.2의 PCR 생성물의 부하 10 μL. 밴드가 보이지 않는 경우, 고해상도 겔 LAM-PCR 생성물의 10 μl를 분석한다. 주의 : 잇hidium 브로마이드 변이원성이다. 매우 신중하게 작업하고 항상 적절한 장갑을 착용하십시오.

높은 처리량 시퀀싱 9. 준비

  1. (NR) LAM-PCR 제품의 정제
    1. 실내 온도 AMPure XP 자석 구슬의 44 μL와 단계 8.1.2에서 40 ㎕의 PCR-제품을 섞는다. 실온에서 5 분을 품어 추가로 2 분 동안 MPS에 노출.
    2. 뜨는을 취소하고 MPS에 200 ㎕의 70 % EtOH로 두 번 씻어.
    3. 30 μL의 H 2 O에 뜨는에 resuspend DNA 비드 복잡한 폐기 신선한 0.2 ML 튜브에 1 분 및 전송 뜨는을 품어. 정제 된 DNA의 농도를 결정합니다.
  2. Fusionprimer PCR은 특정 어댑터를 시퀀싱 추가 할 수 있습니다.
    1. 분석 할 수있는 모든 샘플은 50 ㎕의 PCR 반응을 준비합니다.
    2. 0.2 ML PCR 튜브에 DNA의 피펫 X μL (40 NG). DNA의 양이 각각의 샘플과 0.5-25 μL의 범위에서 동일해야합니다.
    3. 표 5에 설명 된대로 PCR 마스터 믹스를 준비 추가 (50 - X). 단계 9.2.2에서 각 샘플에 대한 마스터 믹스 ㎕의 표 5 PCR 제품에 예시 PCR 조건에 따라 (NR) LAM-PCR 제품 시퀀싱 어댑터를 소개합니다. -20 ° C에서 최대 4 일 ~ 장기 4 ° C에 저장할 수 있습니다
    4. Fusionprimer-PCR 제품 부하에게 2 % 아가 로스 겔상에서 단계 9.2.3의 PCR 생성물의 10 μL를 시각화. 9.1.3 - 9.1.1 단계에 설명 된대로 나머지 PCR 제품을 정화. 정확하게 Fusionprimer-PCR 제품의 농도 및 단편의 크기를 정량화하는 자동화 된 고해상도 전기 영동 장치에 단계 9.4에서 1 ㎕의 정제 된 PCR 생성물을 분석한다.

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결과

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LAM-PCR 각 접합에 대한 정의 조각의 크기와 벡터 게놈 접합의 증폭 결과. 각각의 PCR 단편의 크기는 게놈 DNA의 공지 된 위치와 가장 가까운 제한 효소 인식 부위 사이의 거리에 의존한다. 이 겔 전기 영동에 의해 분석 샘플 예에서 증폭 접합 다양성을 시각화한다. 단지 단일 (모노클로 날), 몇개 (올리고 클론), 또는 다수의 (폴리 클로 날) 밴드는 겔에 존재하는 경우. LAM-PCR의 결과는 가장 높은 해상도의 전기 영동 젤 (그림 2A)로 볼 수 있습니다뿐만 아니라, 2 % 아가 로스 젤 (그림 2B)에 시각화 할 수 있습니다. nrLAM-PCR은 각각의 접합을위한 다양한 길이의 PCR 단편 발생합니다. 따라서, 단일 클론 올리고 클론 또는 클론 샘플은 전기에 의한 얼룩으로 표시하고 시각적으로 구별 할 수 없습니다. 2 % 아가 로스 겔상에서 nrLAM-PCR 생성물을 떠올리 SUC를 결정하기에 충분하다프로토콜 (그림 2C...

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토론

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LAM-PCR 기술은 공지 된 DNA 영역의 측면 불명 DNA 서열을 식별한다. 때문에 공지 된 DNA 서열에 특이 적 프라이머의 혼성화와 접합부의 증폭 량으로 인해 고감도, 그것은 단일 세포 수준까지조차 희귀 접합을 증폭 및 검출 할 수있다. 반대로, 클론 상황에서 LAM-PCR은 하나의 반응에 다른 접합의 수천을 증폭 할 수 있습니다.

그러나, 제한의 사용으로 인해이 integrome 만 하위 성분마다 특정한 제한 효소 접합부의 존재를 LAM-PCR에 의해 분석 할 수있는 효소. 따라서, 다른 효소와 동일한 샘플의 반복 분석은 9를 권장합니다. 제공된 LAM-PCR 증폭 산물은 젤 상에 존재하지 않으면, 가장 가능성이 알려진 DNA 단편의 위치와 선택된 제한 효소의 가장 인식 부위 사이의 거리 LAM-PCR 제품 초래할 너무 커서15.이 경우 다른 효소 접합을 증폭하는 데 사용되어야한다.

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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기금은 Deutsche Forschungsgemeinschaft (SPP1230, 하이델베르크/만하임 종양센터 보조금), Bundesministerium für Bildung und Forschung (iGene), 유럽연합 집행위원회의 VIth + VIIth Framework Programs (CONSERT, CLINIGENE 및 PERSIST)에 의해 제공되었습니다. 비디오에서 프로토콜 기술을 시연해 주신 Ina Kutschera에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Taq DNA 중합효소Genaxxon Bioscience GmbHM3001.5000대체 Taq 중합효소 사용 가능
PCR 완충액Qiagen201203이 완충액의 사용을 권장합니다.
dNTP-MixtureGenaxxon Bioscience GmbHM3015.4020또는 기타 dNTP
올리고뉴클레오티드(프라이머)MWG BiotechHPLC purified
Dynabeads M-280 스트렙타비딘 Invitrogen11206D
PBSGibco14190-0860.1% wt/vol BSA
6 M LiClRoth3739.110 mM Tris-HCl (pH 7.5)/1 mM EDTA
Tris-HCl, pH 7.5USB Corporation 22637또는 기타 공급업체
EDTAApplichemA1103,0250또는 기타 공급업체
Klenow PolymeraseRoche Diagnostics10104523001
Hexanucleotide 혼합물Roche Diagnostics11277081001
Restriction, endonucleaseNEB또는 기타 공급업체
Fast-Link DNA ligation kit진원지 생명 공학LK11025
CircLigase ssDNA 리가제 키트, 진원류 생명 공학CL4111K
NaOHSigma-Aldrich72068또는 기타 공급 업체
Agarose LERoche Diagnostics11685660001또는 기타 공급 업체
TBE 완충액Amresco0658또는 기타 공급
업체 Ethidium bromideApplichemA2273,0005Ethidium bromide는 변이가 가능한
100 bp DNA LadderInvitrogen15628-050또는 다른 DNA ladder
20 mM NaClSigma-Aldrich71393-1L또는 다른 공급 업체
Magna-Sep 자기 입자 분리기입니다.Life TechnologiesK1585011.5 ml 튜브와 함께 사용하기 위해
Magna-Sep 자기 입자 분리기Life TechnologiesK15869696-웰 플레이트와 함께 사용하기 위해
Amicon Ultra-0.5, Ultracel-30 membraneMilliporeUFC503096
PerfectBlue Gelsystem Midi SPeqLab40-1515또는 기타 전기영동 시스템과 함께 사용하기 위해 
TProfessional 96Biometra050-551또는 기타 96웰 플레이트용 열순환기
, 오비탈 쉐이커, KS 260, basic, IKA2980200또는 기타 수평 쉐이커
PCR 소프트튜브, 0.2 ml, Biozym Scientific GmbH711082또는 기타 0.2 ml PCR 튜브
1.5 ml 튜브Eppendorf12682또는 기타 1.5 ml 튜브
, 겔 문서화 시스템PeqLab또는 다른 젤 문서화 시스템
Nanodrop ND-1000 분광 광도계Thermo ScientificND-1000
Spreadex EL1200 프리캐스트 젤Elchrom Scientific3497
수중 젤 전기영동 장치 SEA 2000 Elchrom Scientific2001E
2100 전기영동 바이오분석기Agilent TechnologiesG2939AA
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참고문헌

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