굴지의 질병을 일으키는 돌연변이는 세포 골격 기능을 변경할 수 있습니다. 골격 역학 전체 내부 형광 현미경을 사용하여 찬란 태그 단백질의 영상을 통해 정량화된다. 예를 들어, 세포 골격 단백질, Aip1p는 돌연변이 말라 이소, R256H을 발현하는 세포의 현지화 및 이동을 변경했다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
굴지의 변이는 종종 세포 골격 기능을 변경하는 특정 분자의 변화로 인해 인간의 질병의 범위가 발생할 수 있습니다. 본 연구에서는 형광의 영상은 전체 내부 형광 (TIRF) 현미경은 세포 골격 역학의 변화를 시각화하고 정량화하는 데 사용됩니다를 사용하여 단백질을 태그. TIRF 현미경과 형광 태그의 사용은 굴지의 돌연변이에 의해 발생 골격 역학의 변화를 정량화 할 수 있습니다. 이 기술을 이용하여 살아있는 세포에서 세포 골격 함수의 정량화는 소중하게 단백질 기능의 시험 관내 연구를 보완한다. 예를 들어, 액틴 잔기 R256에 영향 과오 돌연변이는이 아미노산 규제 상호 작용에서 중요한 역할을 제안하는 세 인간 액틴 동형에서 확인되었다. 골격의 움직임에 말라의 돌연변이 R256H의 효과는 효모 모델을 이용하여 연구 하였다. 말라 해중합에 cofilin을 지원하는 것으로 알려져 있습니다 단백질, Aip1는했다N-말단에 녹색 형광 단백질 (GFP) 태그와 TIRF 현미경을 사용하여 생체 내에서 추적. 야생형과 돌연변이 균주 모두에서 Aip1p 운동의 환율을 정량 하였다. R256H 돌연변이 액틴을 발현하는 세포에서 Aip1p의 움직임은 제한과 운동의 비율은 1.60에 비해 R256H 세포에서 0.88 ± 0.30 μm의 / 초 (야생형 세포에서 측정 거의 절반의 속도입니다 ± 0.42 야생형 세포 μm의 / 초, P <0.005).
서론
악틴 세포 골격을 구성하는 지배적 인 단백질과 세포 분열, 세포 기관의 움직임, 세포 운동성, 수축, 및 신호 등의 중요한 세포 과정에 참여하고 있습니다. 지난 10 년간 굴지의 질병을 일으키는 돌연변이는 근육 병증에서 관상 동맥 질환 1-7로, 질환의 범위에 이르는 6 인간 말라 이소 각각 발견되었다. 말라의 돌연변이가 질병으로 이어질하는 과정은 밝혀 계속. 효모 모델은 하나의 필수 말라 이소, 유전 온순함과 굴지의 순서와 기능의 높은 보존의 장점으로 인해 굴지의 기능에 대한 변이의 생화학 적 효과를 연구하기위한 황금 표준 남아있다. 연구는 개별 말라 돌연변이가 지배적 인 부정적인 영향 8 분자의 특정 기능 장애로 이어질 것을 보여줍니다. 예를 들면,리스 - 118 잔기에 영향을 γ-비 - 근육 액틴의 난청 유발 돌연변이에 의해 규제를 변경할액틴 결합 단백질 Arp2 / 3 9. 연구 자주 체외에서 사용하는 단백질의 분석 : 단백질 상호 작용을. 세포 생물학에 돌연변이를하는 걸하고, 특히, 셀에 결합 단백질의 현지화를하는 걸의 효과에 대한 조사가 제한됩니다.
생체 내에서 효모 세포 골격의 연구는 종래 거꾸로 형광 현미경 (10)에서
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
1. PB1996 플라스미드에 복제
- 설계 및 주문의 DNA 표적 서열의 측면과 선택된 상위 플라스미드 독특한 제한 부위를 포함하는 올리고 뉴클레오티드를 제조 회사로부터 프라이머. 주 :이 경우, 프라이머 Aip1 서열의 5 '말단에서 400 염기쌍을 증폭하도록 고안되었다. XhoI에 제한 사이트는 약 20 bp의 Aip1 순서 전에 프라이머로 통합하고, XmaI는 대상 Aip1 순서 후 약 20 BP를 포함되었습니다. 클로닝에 사용되는 플라스미드는 형광위한 3XGFP 태그, 효모 균주 선택 URA 유전자 및 세균 선택 암피실린 내성 유전자를 포함 PB1996이었다.
- 우라 효모 반수체 균주의 게놈 DNA를 정화. 참고 : 복제 프로세스의 다이어그램 그림 1을 참조하십시오.
- 어느 EN에 제한 부위로 Aip1p 유전자를 증폭하기 위하여 두 개의 프라이머 및 효모 게놈 DNA를 사용하여 표준 PCR 반응을 실행D. PCR 제품을 소화하고 업체 당 별도의 반응에 제한 효소로 PB1996 플라스미드 프로토콜을 권장합니다. 이 경우 XmaI 및 XhoI에 1 시간 동안 37 ° C에서의 첨부 된 완충액으로 사용 하였다.
- 소화 DNA 조각을 분리하는 0.8 % 아가 로스 전기 영동 젤을 실행합니....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
이미지에 대한 방법은 셀의 골격 단백질의 동역학이 제시된다. 액틴 결합 단백질, Aip1p는 GFP 태그했다. 태그 된 제품을 코딩하는 플라스미드를위한 디자인은도 1에 도시된다. 플라스미드 후 효모 세포로 형질 전환 하였다. 형광 발현은 Aip1p는 셀의 단백질 거동의 시각화를 허용 태그. Aip1p는 일반적으로 엔도 시토 시스 (22)의 사이트에서 말라 패치에 지역화. 그림 2A와 같이 Aip1p의 움직임을 정량화하기 위해 50 개 이상의 형광 Aip1p의 초점은, 10 개 이상의 셀에서 추적했다. 평균 속도는 각 형광 Aip1p 에리어 (도 2b 참조)에 대하여 계산 하였다. 야생형 세포에서 Aip1p 운동은 셀에 걸쳐 다양하고, 나중에 사라진다. 야생형 세포 Aip1p의 움직임의 속도는 보통 / 초 1.60 ± 0.42 μM이다. 말라 CY의 비정상적인 형태를 갖는 것으로 알려져 R256H 돌연변이 액틴을 발현하.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
병원성 돌연변이에 대한 연구에서 세포 골격과 유틸리티의 역학을 시각화 할 수있는 효과적인 전략은 여기에 설명되어 있습니다. 고급 영상 기법은 세포막에 가까운 단백질의 세포 내 이동을 이해하는 새로운 기회를 만들었습니다. 전반사 형광 현미경 (TIRF)는 살아있는 세포의 기능 연구를위한 중요한 기술이다. TIRF는 커버 슬립과 수성 매질의 굴절률의 차이로 인해 사라져가는 필드를 만들고 각진 여기 레이저를 사용합니다. 에바 네 센트 필드 에너지는 형광 물질을 자극하지만, 커버 슬립과 물 사이의 계면의 거리와 함께 지수 적으로 감소한다. 이 잡음 비율과 커버 슬립 / 매체 인터페이스 위의 50 ~ 250 nm의에서 강력한 해상도 높은 신호가 발생합니다. 이러한 자질은 TIRF 현미경에게 적은 비용으로 살아있는 세포에서 단일 분자 수준에서 세포 골격 단백질을 시각화 할 수있는 강력한 도구를 만들광독성 및 기타 기술 (24)에 대한 향상된 대비 상대 - 26.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
저자는 원래 PB1996 클론 유용 토론 및 기술 자문 피터 루벤스 타인 데이비드 Pellman 감사합니다. 이 작품은 천의 월에서 그랜트와 어린이를위한 라이드의 자금에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Agarose | rpi | 9012-36-6 | |
| Bromophenol Blue | Amresco | 115-39-9 | |
| BSA | NEB | B9001S | |
| Change-IT 다중 돌연변이 부위 지시 돌연변이 유발 키트 | USB Corporation | 4166059 | |
| CutSmart Buffer | NEB | B7204S | |
| DNA, 연어 고환 | 에서 단일 가닥Sigma | 9007-49-2 | |
| EDTA pH 7.4 | Sigma | 93302 | |
| 에티듐 브로마이드 | Invitrogen | 15585-011 | 경고! 유해한 자극 |
| 곰팡이/박테리아 DNA 키트 | Symo Research | D6005 | |
| HpaI | NEB | R0105S | |
| 리튬 아세테이트 | AlfaAesar | 6108-17-4 | |
| Low DNA Mass Ladder | Invitrogen | 10068-013 | |
| NE Buffer #4 | NEB | B7004S | |
| Platinum PCR SuperMix High Fidelity | Invitrogen | 12532-016 | |
| Miniprep Kit | Qiagen | 27106 | 모든 키트가 작동합니다 |
| . 빠른 결찰 키트 | NEB | M2200S | |
| 아지드화 나트륨 | 시그마 | 26628-22-8 | |
| PBS | Invitrogen | 10010-023 | |
| PEG | Amresco | 25322-68-3 | |
| Tris 베이스 초순수 | rpi | 77-86-1 | |
| Wizard SV 젤 및 PCR 클린업 시스템 | Promega | 1/6/2015 | |
| XhoI | NEB | R0146S | |
| XmaI | NEB | R0180S | |
| YPD 미디어 | LabExpress | 3011-URA | |
| 미디어 | LabExpress | 3010 | |
| PCR 기계 | Invitrogen | 4359659 | 모든 PCR 기계가 작동합니다. |
| TIRF 현미경 | 올림푸스 IX81 | ||
| 하마마츠 ORCA-R 카메라 | 하마마츠 |
참고문헌
- Lehtonen, H. J., et al. Segregation of a missense variant in enteric smooth muscle actin gamma-2 with autosomal dominant familial visceral myopathy. Gastroenterology. 143, e1483 1482-1491 (2012).
- Matsson, H., et al.
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
