허혈성 뇌졸중의 마우스 모델에서 감각 운동 피질 손상 후 보상 사지 사용과 운동 기능의 학습 행동 평가

요약

마우스 모델은 행동 신경 과학 연구에서 점점 인기를 얻고 있습니다. 모델이 발전함에 따라 마우스에 특정한 민감한 행동 조치를 개발하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 뇌졸중의 마우스 모델에 사용하기 위한 숙련된 운동 작업인 Pasta Matrix Reaching Task를 설명합니다.

초록

마우스 모델은 행동 신경 과학의 분야에서 점점 더 인기를 끌고, 특히 실험 뇌졸중의 연구에있다. 모델 어드밴스로서, 마우스에 민감한 특정 행동 대책을 개발하는 것이 중요하다. 이 의정서는 뇌졸중의 마우스 모델에서 사용하기 위해 숙련 된 모터 작업을 설명합니다. 파스타 매트릭스는 정확한 결과의 데이터를 수집하고 보상 전략 (즉, 비 사용을 배운)와 재활 훈련에 집중을 포함하여 인간의 임상 현상을 모방하는 사지의 사용을 조작하는 실험자를 허용하는 다양하고 민감한 행동 분석으로 작업 기능을 도달. 신경 해부학 적 도구와 함께 사용하면,이 작업은 또한 뇌졸중 다음과 같은 기능 (또는 그 부족)의 행동 복구를 지원하는 메커니즘을 탐구하는 연구자를 허용합니다. 이 작업은 푸에 관한 다수의 연구 질문에 대한 교육 및 테스트 다양한 옵션을 제공하고, 간단하고 저렴한 설정하고 행동 둘 다부상 다음 nctional 결과. 작업이 뇌졸중의 마우스 모델에 적용되어 있지만, 그것은 또한 다른 상지 손상 모델에서 기능적 결과의 연구에 도움이 될 수 있습니다.

서론

마우스 모델로 인해 부분에서의 편리함과 경제성뿐만 아니라 다른 응용 프로그램 사이에서 생체 내 이미징에 적합한 유전자 변형 라인의 가용성에 실험 뇌졸중 연구를 위해 점점 더 인기를 끌고있다. 이 실험 모델에서 인기를 증가로 부상 다음과 같은 기능적 결과의 중요한 행동 평가의 개발에 대한 관심은 ^1-7 증가했다. 인간의 뇌졸중 생존자에서 사용 재활 및 보상 전략을 모두 모방 동물 훈련 프로토콜의 개발은 성공적으로 병원 ^8에 사용하는 실험 동물 연구에서 연구 결과를 번역 할 수있는 능력을 향상시킵니다. 작업 (재조합 단백)에 도달 파스타 매트릭스에 모터 기술 교육 이전에 감각 피질 ⁽³⁾ 허혈성 모욕 다음과 같은 운동 기능의 결과에 민감한 행동 평가로 설립되었습니다.

주요 관심사 중 하나뇌졸중 연구 문제의 재활 및 모욕 다음과 같은 기능의 개선 회복을 촉진 행동 전략의 개발과 이해의. 현재, 인간의 재활 전략은 불완전 복구 ^(8)에 발생합니다. 또한, 재활 치료는 완벽하게 영향을받는 사지 (들)의 기능을 회복 할 수있는 능력을 훼손 할 수 뇌졸중 생존자를 복구하는 동안 개발 보상 전략에 대처해야합니다. 예를 들어, 상지 기능에 영향을 미치는 일방적 인 행정 다음, 인간은 자신의 덜 영향을 사지 ^{(9, 10)에} 대한 의존도를 개발하는 경향이있다. 단기적으로 작동하는 사람의 능력을 향상시키는 동시에,이 영향을받는 사지의 비 사용 배웠다 동물 모델 ^{11-13에서와} 같이, 그것의 궁극적 인 회복 가능성을 방해 할 수 있습니다. 동물의 이러한 연구 결과는 인간의 ^14에 제약 유도 운동 치료의 개발과 사용을 알려 도왔다. 동물 모델은 beneficia 있습니다연구진은 보조하다 신경 생물학적 메커니즘을 탐구하고 기능의 회복을 촉진 할 수 있도록하여 재활 치료 전략을 향상시키기위한 L. 뇌졸중 후 기능의 효과적인 행동 평가 인 이외에, 재조합 단백 감각은 스트로크 ^{(15)는 다음의} 기능적 결과 개선을 촉진 할 수있는 효과적인 재활 전략으로 확립되었다. 재조합 단백에 또한 영향을받는 사지 효과적으로 모방 학습 이외의 용도에 사용할 수 있으므로 초기에도 불구하고 기능 회복을 향상시킬 수 있습니다 행동 조작에 대한 통찰력을 제공 할 수 있습니다에 의존 덜 영향을 사지 ^13.

재조합 단백의 건설 이전에 ³ 설명 하였다. 간단히 도달 챔버는 오픈 상단과 하단으로 (20 ㎝ 높이 15cm 길이, 8.5 cm 폭) 네 플렉시 유리 벽으로 구성되어 있습니다. 식사이 챔버의 전방 벽의 바닥베이스로부터 연장되는 중심 슬릿 (13cm 높이 5 ㎜ 폭)가 있습니다도달하는 구멍 (그림 1A)로. 파스타 행렬은 블록의 깊이를 완전히 뚫고 1mm 직경의 구멍 (8.5 cm 길이 5cm, 폭 1.5 ㎝ 높이) 대형 플라스틱 블록입니다. (260) 구멍의 총 각 구멍 (그림 1B) 사이에 2mm로 도달 창에서 2mm를 시작하고 있습니다. 파스타 매트릭스는 건조, 수직 배향 파스타 조각이 노출 파스타 매의 대략 절반 매트릭스 단의 전체 깊이를 관통하도록 설계된다. 오버 헤드 플라스틱이나 카드 용지의 이동식 조각 크기로 잘라 매트릭스의 밑면에 안전하게 녹화해야합니다. 이 운송 중에 행렬에서 떨어지는에서 파스타 조각을 방지하고 깨진 파스타 조각을 쉽게 제거 할 수 있습니다.

재조합 단백 정확한 결과 데이터를 수집 및 임상 현상을 모방하는 사지의 사용을 조작하는 실험자를 허용하는 다양하고 민감한 행동 분석입니다. 행동 O를utcome 측정은 재조합 단백은 실험자보다 정확하게 경색 크기 ^{3, 16의} 전통적인 측정보다 재활 전략의 효과를 반영하는 행동 데이터를 수집 할 수 있습니다. 행동 조작으로, 재조합 단백은 실험자은 생쥐에서 상지의 사용을 제어 할 수 있습니다 재활 치료의 임상 경험 (즉, 영향을받는 사지 훈련) 또는 배운 사용하지 않은 (즉, 덜 영향을 사지 훈련)을 모방하기 위해. 신경 해부학 적 방법과 함께 사용하면 재조합 단백은 뇌졸중 후 보상 사지 사용 다음과 같은 기능이나 부적응 가소성의 행동 복구를 지원하는 메커니즘을 탐구 할 수있는 기회와 연구자를 제공합니다. 재조합 단백 더욱 외상성 뇌 손상과 같은 뇌 손상 및 상지 손상의 다른 뮤린 모델에 적용 할 수있다. 재조합 단백의 또 다른 장점은 경제성이다. 태스크에 필요한 장비가 집에서 상당히 합리적인 구성 될 수 있으며, 데이터 수집이 수행공간이나 재정 자원의 큰 금액을 요구하고, 작업이 안정적으로 데이터를 수집하는 학부 학생들을위한 아주 간단하지. 또한, 재조합 단백도 작은 행동 적자 ^{3, 13에} 민감합니다.이 프로토콜은, 운동 기능 학습을 평가 상해 다음 행동 회복을 촉진하고, 행정의 확립 된 쥐 모델에서 모방 학습 이외의 사용을 현상 할 수있는 간단하고 효과적인 방법을 제공합니다.

프로토콜

다음 방법은 텍사스 대학교 오스틴 캠퍼스 및 일리노이 웨슬리 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 프로토콜에 따라 수 있습니다. 그것은 연구자가 장갑을 착용 또는 실험실 동물과 행동 교육에 종사 할 때 적절한 예방 조치 (손 씻기 전후)을 가지고 어느 것이 좋습니다. 수술과 동안 준비 동물을 취급 할 때는 장갑을 착용해야합니다.

1. 요법 이니와 음식 제한

NOTE : 재조합 단백이 appetitive 작업이기 때문에, 그것이 도달 응답 동기 및 트레이닝 세션 동안 물림을 방지하기 위하여 종래의 훈련 발병에 먹이의 양 및 타이밍을 제한하는 것이 유리하다.

1. 이전 작업 훈련의 시작에 적어도 일주 시작 제한된 공급 일정에두고 마우스. 번째로 결정 무료 수유 가중치를 설정하기 전에 음식 제한의 발병에 각 마우스의 무게를제한된 공급의 첫 날에 각 동물의 전자 무게.
   1. (예를 들어, 케이지에 보관 4 쥐가있는 경우, 케이지는 매일 음식의 10g을 받게됩니다) 각 마우스의 수신 ~ 하루에 표준 설치류 식사의 2.5 g을, 하루에 한 번 마우스를 넣습니다. 수유, 매일 같은 시간에 발생하는 것이 바람직 시간에 매일 훈련이 결론을 내릴 것으로 예상되어 있는지 확인합니다.
   2. 어떤 마우스가 자신의 자유 먹이 체중의 10 % 이상을 상실하지 않도록 정기적으로 동물의 무게를. 참고 : 적절한 체중 유지를 촉진하기 위해 따라 매일 음식의 양을 조절합니다. 그들이 성숙 마우스는 일반적으로 일정한 음식 제한 마우스는 재조합 단백 교육 / 평가 기간 동안 음식 제한에 남아 심지어 무게를 얻을 수 있습니다.
2. 자신의 홈 케이지에 파스타의 작은 조각 (1.6 cm로 절단)에 동물을 노출 neophobic 반응을 극복하기 위해 사전 교육을 여러 번. 참고 : 일반적으로 노출 5-10 일 마우스 provi에 당 약 4 조각, 충분각 공급에 공격 한.
3. 면도날을 사용하여 사이즈 (3.2 cm)에 파스타 조각을 잘라. 참고 :이 파스타 조각의 과잉이 전에 하루의 훈련과 밀폐 용기에 저장하지 않는 조각을 시작하기로 절단하는 것이 좋습니다. Capellini 파스타는 행렬을 채우기 위해 사용된다. 파스타 등 다양한 브랜드가 파스타를 깰 수있는 마우스의 매트릭스 또는 필요한 힘의 양에 파스타의 안정성에 영향을 미칠 수있는 질감과 직경 변화, 그것은 DeCecco 브랜드 파스타는 교육 및 테스트를 통해 사용하는 것이 좋습니다.
4. 매트릭스에서 사용할 수있는 모든 구멍 (그림 1A)를 작성, 파스타 매트릭스 않은 capellini 파스타 조각을 놓습니다.
5. 앞에 배치 전체 파스타 매트릭스 (그림 1A) 및 테스트 챔버의 하단에 먹는 파스타의 여러 조각 테스트 챔버에 마우스를 길들. 5 ~ 10 분의 3 세션에 마우스를 길들. 참고 : 마우스는 habitua 동안 파스타에 도달하도록 권장 안기 훈련. 마우스는 일반적으로 조리개를 통해 스니핑에 도달 챔버의 외부에있는 파스타에 관심을 표시하기 시작합니다. 그것은 원하는 경우 하나의 챔버 내에서 두 개의 케이지 메이트를 습관화하는 것이 가능하지만 마우스는 모양과 개별적으로 훈련을해야한다. 각 동물이 행동 장치에 배치되어 이전과 이후의 모든 표면은 70 % 에탄올 또는 유사한 안전 소독 용액으로 청소해야합니다.

2. 형성 리치

1. 3-5 번 매일 성형 시험을 통해 범위를 형성하여 각 동물의 선호 사지를 결정합니다. 10 분이나 먼저 발생 10 배, 총에 도달하기 위해 쥐를 허용합니다.
   1. 습관화 훈련 (그림 1A)에서와 같이 실의 전면에서 전체 파스타 매트릭스 테스트 실에서 개별적으로 마우스를 놓습니다.
   2. 개별적으로 오른쪽과 왼쪽에 도달 사지의 수를 나타내는 각 사지에 도달의 수를 기록한다. 확장으로 범위를 정의손목 챔버의 비행기를 파괴하도록 도달 구멍을 통해 다리의; 범위가 향한 또는 파스타와 접촉 할 필요는 없습니다.
2. 에 도달하기를 꺼려 쥐를 장려하기 위해 도달하는 구멍을 통해 바로 챔버 내부 파스타의 여러 조각을 잡고. 마우스가 이렇게 후퇴 파스타 조각 한 후 도달하는 격려, 관심 (예를 들어, 스니핑, 무는)를 표시 할 때 파스타 조각을 그립니다. 마우스가 처음 건조 파스타에 관심을 표시하지 않는 경우, 그들을 더 맛있 수 있도록 따뜻한 물을 작은 컵에 파스타 조각의 끝을 적시.
3. 마우스가 하나의 다리와 자신의 일상에 도달 70 % 이상을 보일 경우 사지 환경 설정을 확인합니다. 이 도달하는 작업 ^(17)의 훈련 부분 동안 관찰 학습의 양을 제한 할 수있는, 동물 모양 이상하지 마십시오. 생쥐 모양의 일단 재조합 단백 훈련을 시작합니다. 참고 : 교육은 곧 NEX으로 시작할 수 있습니다t 일, 그러나 그것은 형성 및 교육 과정 사이에 몇 일을 기다려야하는 것도 허용됩니다.

3. 도달 교육

1. 기차 마우스 재조합 단백에 대한 능력을 구축하기 위해 이전 모욕 회. 참고 : 각 재판이 먼저 발생 15 분 또는 (성공 및 실패) 관찰자에 의해 계산 (100)에 도달, 최대로 구성되어 있습니다. 마우스는 자신이 선호하는 사지에 도달하는 훈련을하고 있습니다. 더 강렬한 훈련 패러다임 ^(18)를 원하는 경우 마우스는 하루에 두 개의 시험을 허용합니다.
   1. 앞 (그림 1B)에 배치 된 반 전체 매트릭스 테스트 챔버에 마우스를 놓습니다. 기차 마우스는 마우스가 자신의 몸의 정중선을 가로 질러 도달하기 때문에 선호하는 사지에 매트릭스 반대측 만면을 작성하여 자신이 선호하는 사지 만에 도달한다. 의되지 않을 것이 사지 (에 도달하려는 시도를 저지하기 위해 채워지지 바람직하지 않다 사지에 해당하는 매트릭스의 일부를 남겨uccessful가 파스타에 도달) 및 선호 사지 만에 도달 격려 할 수 있기 때문이다.
2. 이 마우스가 성공적 이른 트레이닝 세션 동안 매 분해 있도록 행렬에있는 동안 파스타 압력 소량 배치. 마우스의 파스타 조각을 중단하지 마십시오. 가볍게 뒤에 하나 또는 두 개의 파스타 조각을 들고와 의도에 도달 목표에 수직으로이를 달성. 지원의이 작은 금액은 처음에 작업을 배우고로 쥐 잡기위한 매우 유연하고 어려운 얇은 파스타, 안정화하는 데 도움이됩니다.
3. 도달, 성공에 도달 수, 성공에 도달의 위치의 총 수를 기록한다. 성공에 도달는 구멍을 통해 도달 파스타의 조각을 잡고, 매트릭스에서 분리 파스타 조각을 깰 수있는 마우스가 필요합니다. 참고 : 파스타 조각 재판이 종료 된 때​​까지 행렬에서 교체 할 수 없습니다. 조기 교육에, 마우스는 많은 파스타 조각을 휴식하지 않습니다.
4. (일 조각 이상 더 이상 2보다 많거나 적은 파스타 적어도 9 개 조각 속보) 일관된 성능의 최소한 3 일 (최대 5 일)로 정의 능력에 재조합 단백에 기차 마우스. 그것은 종종 능력에 젊은 성인 쥐를 훈련 15-20 일이 소요된다.

4. 덜 영향을 사지 교육

1. (선호 / 영향과 less-affected/unpreferred 사지에 설명 그림 2 참조) 선호에 도달 사지에 반대측의 운동 피질에 허혈성 모욕 후 사일 시작 덜 영향을 사지 (즉, 수술 전 바람직하지 않다 사지를) 훈련 . 하루에 한 번 15 분 또는 100 범위의 교육 세션을 관리 할 수​​ 있습니다.
   1. 파스타의 첫 번째 열을 제거합니다 (즉, 도달 구멍에서 연장 대부분의 중간 수직 열) 보장하기 위해 덜 영향을 사지 훈련의 첫 주에 그 초기에 영향을받는 사지에 도달에 성공하지 않습니다.
   2. 장소 앞에 배치 된 반 가득 행렬에 도달 챔버의 생쥐. 행렬의 작성 절반은 이제 덜 영향을받는 (바람직하지 않다) 사지에 도달하기 위해 쥐를 강제로 수술 전 못 절반의 반대 있는지 확인합니다.
2. 도달하는 구멍을 통해이 다리의 확장을 강화하여 덜 영향을 사지에 도달 격려한다. 마우스에 도달 챔버의 바닥에 파스타의 작은 (1 / 2 개)에 관계없이 범위가 성공 여부의 훈련 장소의 처음 몇 일에 덜 영향을받는 다리를 확장 할 때.
3. 100까지의 총에 향해 덜 영향을 사지로 만든 만에 도달를 계산합니다. 도달의 총으로 영향을받는 사지와 몰래 시도를 계산에 포함되지 않습니다.
4. 덜 영향을 사지 훈련의 첫 번째 7 일 후 행렬에 파스타의 가장 내측 수직 열을 반환합니다.
5. 도달, 성공에 도달 수, SUCC의 위치의 번호를 기록essful에 도달한다. NOTE : 이러한 데이터는 덜 영향 가지 패턴으로 도달 차이를 관찰하기 위해 분석 될 수 있지만, 이전에보고되지 않았다.

5. 도달 분석

덜 영향을 사지 훈련을 다음과 재조합 단백 작업에 영향을받는 사지를 평가하여 영향을받는 사지의 기능 회복에 덜 영향을받는 사지 사용의 영향을 확인합니다. 덜 영향을받는 사지 훈련 일의 원하는 숫자 (보통 14 일) 완료 후이 평가가 발생합니다.

1. (채워진 선호 사지에 매트릭스 반대측의 절반 즉,) 훈련 절차와 동일 중심의 실 앞의 행렬을 놓습니다. 참고 :이 자신의 영향을받는 (이전에 선호) 사지에 도달하기 위해 쥐를 강제로.
2. 전 스트로크 성능 수준과 비교하는 도달, 성공에 도달 수, 성공에 도달의 위치의 총 수를 기록한다. 성능을 조사하지 마십시오이러한 영향을 사지 프로브 덜 영향을받는 사지 훈련 도중 손상된 다리는 영향을받는 사지의 회복에 영향을 줄 수있는 교육 과정으로 기능 할 수있다.

결과

재조합 단백의 분석 결과는 깨진 파스타 조각의 수와 성공에 도달의 패턴을 포함해야한다. 감각 대뇌 피질의 병변을 가진 마우스의 결과는 그림 3A에서와 같이 허혈성 모욕, 성공에 도달의 수뿐만 아니라 실제 손 패턴 ^{3, 19} 모두에 영향을 미친다는 것을 나타냅니다. 대표적인 패턴의 변화는 그림 (b)에서 관찰 할 수있다. 마우스에서 배운 비 사용의 효과를 모방하는 재조합 단백의 기능은 덜 영향을받는 사지 교육 ^{13, 20} 다음 영향을받는 사지의 장애 복구에 의해 증명된다. 그 결과, 영향을받는 사지 만 성공적으로 도달이 분석된다. 감각 피질에 허혈성 병변이 마우스의 결과는 허혈성 뇌졸중 다음 덜 영향을 사지 훈련을 2 주에서 7 일 이상 ^{13 일에} 대한 영향을받는 사지의 사용을 손상하는 것이 좋습니다. 그림 4에서와 같이, 덜 영향을 사지 T를 수신 마우스일방적 인 허혈성 모욕 후...

토론

재조합 단백은 생쥐의 숙련에 도달하는 성능을 평가하는 간단한, 양적 방법을 나타냅니다. 시간이 소요하지만, 그것은 훈련 이전에 경험이없는 대학생은 몇 가지 교육 세션과 신뢰성 및 재현성 데이터를 수집 할 수 있습니다. 태스크는 허혈성 모욕 ^{3, 13, 15} 다음 마우스 운동 기능 성능에도 약간의 변화를 측정 할 수있을만큼 민감하고 있기 때문에 많은 연구가. 트레이닝 프로토콜 ^{15, 20, 22의} 다양한 장기 적자를 인용 일방적 작업, 또한 마우스 작업을 수행되는 림을 지시하는데 사용될 수있다. 재조합 단백의이 기능은 모욕뿐만 아니라 덜 영향을 사지에 배운 신뢰 발생 부적응 및 보상 변경에 따라 모두 적응 행동 및 신경 가소성의 연구에 효과가 있습니다. 이 작업은 또한 프레 쥐 모델에서 조사가 아니라 한 bimanual 사지 사용의 연구에 빌려 준다이라 고한다면 마우스 ^23.

현재 프로토콜의 가장 중요한 측면은 다음을 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
리치 챔버			리치 챔버는 플렉시글라스
블록			파스타 매트릭스 상자는 무거운 플라스틱 블록을 사용하여 사내에서 만들어집니다
카펠리니 파스타	DeCecco		DeCecco 브랜드 카펠리니 파스타는 식료품점이나 아마존과 같은 온라인 소매점을 통해 구입할 수 있습니다.