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방법 논문

노화 마우스 전정 시스템의 행동 평가

16.7K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51605

⸱

2014년 7월 11일

 ,  ,  ,  , 
1Discipline of Biomedical Science, University of Sydney, 2The Bosch Institute Animal Behavioural Facility, University of Sydney

이 논문에서

요약

모터 제어 및 균형 성과는 나이와 함께 저하하는 것으로 알려져있다. 이 논문은 노화의 쥐 모델에서 균형 성능 전정 시스템 및 표시 변경에 도전 할 수있는 간단한 회전 자극의 추가와 함께 표준 비 침습적 행동 검사의 번호를 제공합니다.

초록

균형 성과 연령 관련 감소는 악화 근육 강도, 모터 조정 및 전정 기능과 관련이 있습니다. 연구의 수는 거의 정상 조건 중 하나에 따라 또는 노화 동안 균형 전정 기여를 분리 설치류에 나이가 균형 표현형의 변화를 표시하는 동안. 로타로드 테스트와 경사 평형 시험 : 우리는 수명에 정의 된 세 지점에서 마우스의 균형 성능을 특징 짓는 두 가지 표준 행동 검사를 사용합니다. 중요하지만, 사용자 정의 내장 된 회전도 (멀미의 명백한 징후를 유도하지 않고) 마우스의 전정 체계를 자극하는 데 사용됩니다. 이 두 시험은 전정 매개 균형 성능의 변화는 쥐의 수명에 존재 함을 표시하는 데 사용되었다. 예비 결과는 로타로드 검사 및 수정 된 평형 시험 둘 이상의 diffic 대안으로 에이징 중에 밸런스 성능의 변화를 식별하기 위해 사용될 수 있음을 보여이러한 vestibulo 안구 (VOR) 측정과 같은 ULT 및 침입 기술.

서론

균형 우리의 감각은 아마도 산책과 터닝을 포함 심지어 가장 기본적인 모터 활동의 가장 아직 간과 중요한 구성 요소 중 하나입니다. 밸런스가 근력 운동 조정 및 전정 기능 등 다양한 요소에 의해 영향을, 그리고 모든 기능이 균형 시스템의 중요성이 평가된다만이 전정 신경 병증의 존재 또는 정상적인 노화 과정이다. 전정 시스템 장애는 종종 현기증이나 어지러움과 낙상 이후 부상 1의 위험이 증가의 결과로 불균형의 경험과 연결되어 있습니다. 이 폭포는 부상 2의 주요 원인 중 하나입니다 세 이상 인구에서 특히 중요합니다.

전정 기능 검사는 일반적으로 전정 반사, 특히, vestibulo 안구 (VOR) 또는 vestibulo-collic 반사 (VCR)를 기준으로합니다. VOR 및 VCR이 이미지의 안정화를 위해 필수적입니다각각 머리와 몸의 움직임 동안 망막과 머리 위치. 일반적으로, VOR 측정은 안구 운동 또는 눈 운동 3의 비디오 추적을 측정하기 위해 검색 코일의 침략 주입을 필요로합니다. 이는 마우스의 눈과 비디오 분석 3 학생을 검출의 어려움의 작은 자연에 마우스에 도전하고있다. 대안으로, VCR은 침습 수술 사에 대한 필요없이 마우스에서 신체의 움직임에 응답하여 헤드의 안정성을 측정하기 위해 사용되었다. 그럼에도 불구하고, 몇 가지 연구는 전정 시스템이 더 중요한 것은 노화 동안 변경되는 방식을 전반적으로 수행하는 방법에 특별히 초점을 맞추고있다.

전체의 밸런스 성능을 평가하기 위해 간단하고 비 침습적으로 우리는 두 가지 일반적으로 사용되는 행동 테스트를 수정했습니다. 로타로드 및 경사 밸런스 빔 테스트는 설치류 및 이전 연구에서 모터 성능의 다양한 측면을 평가하는 것은 완전한를 취득하는 테스트 전지에 사용되어왔다운동 능력의 프로필. 이 기능은 질병이나 유전 적 변형에 의해 영향을, 또한 정상적인 발달과 5-7 노화와 관련된 프로세스에 민감 할 수있다. 로타로드를 사용하여 이전 작업은 마우스에 모터 조정은 8 만 3 개월 후 감소하는 것으로 나타났습니다. 또한, 쥐 평형 시험 9 연령 증가와 함께 눈에 띄는 균형 적자를 보여줍니다.

이 논문은 전정 시스템에 도전하고 젊은 세 생쥐의 균형 성과에 대한 후속 영향을 특성화하기 위해 전정 자극과 함께 로타로드 밸런스 빔 테스트를 사용하는 방법을 설명한다. 설명 간단하고 비 침습적 인 방법은 말초 전정 기능의 독립형 조치로 설계되지 않은 있지만, 그들은 생쥐의 정상적인 노화 과정 전정 처리의 여러 단계에서 세포와 세포 내 변화를 비교하는 유용하고 간단한 행동 측정을 제공 않습니다.

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프로토콜

1. 동물

  1. 나이 1, 9, 오래된 13개월의 마우스 (C57/BL6)는 동물 자원 센터 (퍼스, 호주)에서 얻을 수 있었다. 이 마우스는 음식과 물을 임의로에 액세스 할 수있는 12분의 12 시간 빛 / 어둠주기에 시드니 대학의 보쉬 설치류 시설의 표준 마우스 케이지에 보관되어 있었다. 아래에서 설명하는 절차는 시드니 동물 윤리위원회의 대학에 의해 승인되었습니다.
  2. 마우스는 테스트 환경에 순응 할 수 있도록 이전 10 분 동안 각 시험에 시험장에 마우스 새장을 가져옵니다.

2. 로타로드

  1. 로타로드 장치 (그림 1A)를 설정합니다 :
    1. 로타의 각 레인에 다보를 설치합니다.
      참고 :이 경우 쥐 다보에서 (직경 70mm)은 맞춤에 집착하고 "수동 회전"(10)을 수행 쥐를 억제하는 대신 마우스 다보 (직경 32 ㎜)으로 사용된다.
    2. 멋 부리다그들은 로타의 바닥을 터치하고 경사되지 않도록하는 로타의 각 레인의 하단에 위치한 와이어에 자기 착륙 플랫폼을 이온은 건드리지 않고 각 레인의 자기 오른쪽 벽에 가능한 한 가깝게 배치됩니다.
      참고 : 로타로드 테스트 마우스가 회전 및 가속 다보에 머물 전방으로 걸어해야합니다 동안. 마우스가 더 이상 맞춤에 머물 수있을 때, 그들은 빠지지 이후에 자기 센서를 활성화 착륙 플랫폼을 치환. 시간은 회전 다웰, 하강 및 여행 거리가 자동으로 각 마우스에 대해 계산 및 로타의 전면에 표시 화면 상에 기록되는 시점 다웰 RPM에서 하강하는 데 걸리는.
    3. 위의 맨 아래에 짧은 패널과 이상 패널을 각 로타 레인의 전면에 2 투명 플라스틱 패널을 밀어 넣습니다.
    4. 입력 로타로드의 앞에 위치한 키패드를 사용하여 테스트 파라미터. 세인트 팔로우EPS 가속 로타로드 테스트 매개 변수에 대한 2.1.4.6로 2.1.4.1과 고정 속도 로타로드 테스트 매개 변수에 대한 2.1.4.12에 2.1.4.7 단계를 반복합니다.
      1. 60 초에 시험의 최대 기간을 설정합니다.
      2. 사용될 차선의 번호 (또는 시험 생쥐의 수)를 설정한다.
      3. 5 rpm의 시험의 초기 속도를 설정한다.
      4. 44 rpm으로 시험의 최고 속도를 설정합니다.
      5. 60 초에 테스트의 램프 속도를 설정합니다.
      6. 선택된 다웰의 크기 및 순방향으로 회전 래트 다웰에 회전 방향을 설정한다.
      7. 240 초에 테스트의 최대 기간을 설정합니다.
      8. 마우스가 개별적으로 테스트 1로 사용하는 차선의 수를 설정합니다.
      9. 15 rpm으로 테스트의 시작 속도를 설정합니다.
      10. 15 rpm으로 시험의 최고 속도를 설정합니다.
      11. 0 초에 테스트의 램프 속도를 설정합니다.
      12. forwa을 회전 쥐의 다웰하도록 선택 다웰의 크기와 회전 방향을 설정RD 방향.
        참고 : 위의 설정이 다른 실험의 목적에 맞게 변경 될 수있다.
    5. 실험하는 동안 마우스의 동작을 기록 할 수 있고, 추가 생쥐 로타로드에 체재 할 수 있었던 시간의 재생 시간을 결정하기 위하여하기 분석을 위해 사용되도록, 고정 속도 로타로드 시험용 로타로드 앞에 카메라를 배치.
  2. 가속 로타로드 테스트의 단계 2.2.4에 2.2.1를 수행
    1. 마우스 로타에 순응 할 수 있도록 5 분마다 고정 맞춤에 하나의 마우스를 놓습니다.
    2. 부드럽게 로타의 뒷면을 향하도록 마우스를 슬쩍 찌르다 모든 과목이 방향에 직면하는 경우 (그림 1B 참조) 로타로드 테스트를 시작합니다.
    3. 그들은 회전 다보에서 떨어진 경우 자신의 새장에 마우스를 모두 반환하고 음식과 물에 접근 할 수있는 10 분 동안 휴식을 둡니다.
    4. 반복 확인 청소하는 8 시험의 총을 완료하기 위해 2.2.3 2.2.1 단계다보, 차선, 소변 및 대변의 로타의 착륙 플랫폼, 다시 각 시험 타협의 시작 위치로 착륙 플랫폼을 이동합니다.
      참고 : 처음 3-5 실험은 쥐가 작업을 숙지 할 수 있도록 교육 시험으로 사용됩니다. 가을에 시간, 거리를 걸어 각 후속 재판 가을시의 맞춤 끝 회전 수 (그림 2) 나중에 분석을 위해 기록됩니다.
  3. 고정 속도 로타로드 테스트를 위해 2.3.8에 2.3.1 단계를 수행
    1. 이 로타에 순응 할 수 있도록 5 분 다보에 하나의 마우스를 놓습니다. 다시 케이지에 마우스를 반환합니다.
    2. 로타에 카메라를 눌러 시작에 비디오 녹화를 시작합니다. 그 다음은 로타의 뒷면에 직면 보장 회전 맞춤에 마우스를 놓습니다.
    3. 마우스가 회전 다보에서 떨어질 때 카메라의 비디오 녹화를 중지하고 음식과 물에 접근 할 수있는 10 분간의 케이지에 마우스를 반환합니다.
    4. 반복 8 시험의 총 확인 다보, 차선, 대변과 소변의 로타의 착륙 플랫폼을 청소하고 인수 될 때까지 2.3.2와 2.3.3 단계, 다시 각 시험 사이의 시작 위치에 착륙 플랫폼을 이동 .
    5. 쥐가 소리에 익숙해 질 수 있도록 20 초 동안 3 Hz에서 사용자 지정 내장 된 회전 스위치를 켭니다. 드릴을 전환하여 20 초 후 회전을 중지하고 초기 20 초를지나 회전 계속을 중지하기 위해 실행중인 바퀴의 양쪽에 손을 놓습니다.
      참고 : 회전 자체가 드릴 (그림 3A)에 고정 된 설치류 실행 바퀴로 구성되어 있습니다. 주행 바퀴의 중심에는 마우스 (도 3b)에 배치되는 메쉬 뚜껑 소형 챔버이다. 회전기는 수직 축에 대해 반 시계 방향으로 회전시킨다. 자극의 크기는 0.2 ~ 3 Hz로까지 회전 자극이 gener하기에 충분하다 보여 이전의 연구와 일치한다VOR 및 VCR 응답에게 4,11,12을 먹었다.
    6. 회전의 중심에 챔버 내부에 마우스를 올려 놓고 뚜껑을 교체합니다.
    7. 20 초 동안 3 Hz에서의 가장 낮은 설정에서 회전 스위치를 켭니다. 로타로드를 시작하고 곧 시험에 대비 한이 시간 동안 카메라의 비디오 녹화를 시작합니다. 20 초 끝에 드릴을 끄고 회전을 중지하기 위해 실행중인 바퀴의 양쪽에 손을 놓습니다. 회전 맞춤에 가능한 한 빨리 전송하여 즉시 후 로타에 마우스를 다시 테스트합니다.
    8. 마우스가 다보에서 떨어질 때 카메라의 비디오 녹화를 중지하고 그 케이지에 마우스를 반환합니다.
  4. 중성 세제 / 물 믹스와 함께 투명 플라스틱 패널을 청소 원통형 다보, 차선, 모든 마우스가 테스트 한 70 % 에탄올로 로타의 금속 착륙 플랫폼.

전정 도전 3. 평균대

  1. 학사 학위를 설정랜스 빔 장치는도 4a에서 볼.
    주 : 평형 장치는 카터 등의 설명 장치에서 적응했다 (2001 년) 13.. 이 테스트의 경우, 마우스는 60cm 지상 위치 (5 × 6cm 출입구와 13 × 22cm) 어두운 목표 상자로, 52.5 cm 땅 위에 빔의 하단에서 도보 (그림 4A ). 마우스는 자연적으로 노출 된 빔의 호의에있는 어둠과 목표 상자의 보호를 추구하고 더 위쪽 방향으로 14에서 실행하는 자연 탈출 메커니즘을 활용 약간의 경사에 의해 빔을 통과하는 것이 좋습니다. 빔 자체의 길이가 1m이고, 14mm의 직경을 갖는 원형 단면을 갖는다. 빔 직경의 범위는 맞춤형 실험자가 시험의 감도를 조정하거나 큰 피사체를 수용 할 수 있도록하는 데 사용할 수있다. 균형 빔의 하단에 흰색 선이 출발 선을 나타냅니다. 또 다른 라인이있다피니시 라인 (그림 4A)를 표시하기 위해 보의 높은 끝에서 출발 선에서 60cm를 그려.
    1. 포지션이 카메라, 밸런스 빔 (도 4b)의 하단부에 밸런스 빔의 양쪽에 하나.
      참고 :이 카메라는 평형의 전체 길이를 캡처하고 그 시작과 끝 선이 평형에 표시하기 위해 각도해야 명확하게 볼 수 있습니다. 그들은 밸런스 빔을 통과 이러한 카메라는 얻어진 영상은 나중에 분석을 위해 사용되는, 비디오 레코드로 마우스의 동작을 사용한다.
    2. 각 마우스를 테스트 한 후 소변과 대변의 쉬운 청소를 가능하게하고, 목표 상자 안에 주제의 홈 케이지에서 주택 돔을 배치, 종이 타월에 성공 상자의 바닥 라인.
    3. 장치에서 가을 어떤 과목을 보호하기 위해 제기 빔 아래에 충분한 거품 또는 다른 쿠션 소재를 놓습니다. 가을 마우스는 실험에 의해 즉시 선택됩니다어 및 휴식을 목표 상자 내부에.
  2. 그것은이 환경에 익숙하게되도록 2 분의 목표 상자에 하나의 마우스를 놓습니다. 마우스가이 동작을 억제하는이 시간 동안 빔에 산책하려고하면 5 초 동안 장갑을 낀 손으로 목표 상자에 구멍을 커버.
  3. 다만 목표 상자 오프닝 외부 빔에 배치하고 목표 상자에 빠질 수 있도록하여 마우스를 양성. 마우스가없는 지원과 최소한의 주저와 목표 상자로 출발 선에서 도보 할 수있을 때까지 점진적으로 더 멀리 목표 상자에서 빔에 배치하여 마우스를 훈련하는 것을 계속한다. 각 실행 후 1 분 동안 목표 상자에 휴식을 마우스를 둡니다.
  4. 트레이닝이 완료되면 마우스를 시험 시작.
    1. 카메라에서 비디오 녹화를 시작합니다.
    2. 빔의 출발 선에 마우스를 놓고는 목표 상자의 방향으로 빔을 통과하는 동안 잠시 기다려.
    3. CA에 비디오 녹화를 중지마우스가 상자에 도달 Meras 티.
    4. 1 분 목표 상자에 휴식을 마우스를 둡니다. 기다리는 동안 시험 동안에 퇴적되었을 수있는 소변이나 대변을 제거합니다.
    5. 반복 5 시험의 총이 완료 될 때까지 3.4.4에 3.4.1 단계를 반복합니다.
  5. 쥐가 소리에 익숙해 질 수 있도록 (고정 속도 로타로드 테스트에서와 같은) 20 초 동안 3 Hz에서 사용자 지정 내장 된 회전에 스위치. 드릴을 전환하여 20 초 후 회전을 중지하고 회전을 중지하기 위해 실행중인 바퀴의 양쪽에 손을 놓습니다.
  6. 회전의 중심에 챔버 내부에 마우스를 올려 놓고 뚜껑을 교체합니다.
  7. 20 초 동안 3 Hz에서의 가장 낮은 설정에서 회전 스위치를 켭니다. 곧 시험을 준비하기 위해이 시간 동안 카메라에 비디오 녹화를 시작합니다. 20 초 끝에 드릴을 끄고 초기 20 초를지나 회전 계속을 중지하기 위해 실행중인 바퀴의 양쪽에 손을 놓습니다. 티를 ransfer 가능한 한 빨리 평형의 시작 마우스와 마우스가 목표 상자에 빔을 통과하는 동안 잠시 기다려.
  8. 마우스가 목표 상자에 도달하면 카메라에서 비디오 녹화를 중지하고 그 케이지에 마우스를 반환합니다.
  9. 70 % 에탄올로 평형 장치를 청소하고 각 마우스를 테스트 한 후 목표 상자에 종이 타월을 변경합니다.

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결과

로타

생쥐의 모터 성능은 8 시험을 통해 각 마우스에 대한 기록 떨어 시간 (TTF)로 설명했다. TTF의 이러한 측정을 사용하여, 각각의 마우스에 대한 교육 곡선을 그릴 수 있습니다. 그림 2는 8 시련의 과정을 통해 1 개의 1 개의 개월 된 마우스와 하나 9개월 된 마우스의 모터 성능의 예를 보여줍니다. 이러한 트레이닝 곡선 후속 고원이어서 제 3-5 실험 동안 TTF의 증가를 보여준다. 고원을 형성 TTF의 측정 기록 (그림 5) 데이터 분석에 사용하는 동안 고원 전에 기록 TTF의 측정은, 교육 (그림 2)로 간주되었다.

그림 5는 로타에 모터 성능이 나이와 함께 저하 것을 보여줍니다. 자신의 9개월 된 대응 (N = 8) 1 개월 마우스 (N = 6) 이상 크게 로타에 머물 수 있었다 (18.38 ±...

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토론

프로토콜 내에서 중요한 단계

이전 작업은 로타와 평형 장치 및 결과로 모두 쥐를 지나치게 연습하기 쉬운 것으로 나타났습니다, 정확한 측정의 인수 도전 15이 될 수 있습니다. 평형에 오버 트레이닝은 더 자주 정지 (예비 동작)과 반대 방향으로 이동 될 수 있습니다 예를 들어, 로타에 오버 트레이닝하면 향해 (마우스는 의도적으로 모두 적응과 시험 기간 동안 다보 점프에 예를 초래할 수 선) 15를 시작합니다. 궁극적으로, 오버 트레이닝은 실제 모터 능력의 과소 평가로 이어질 수 있습니다. 그것은 교육의 곡선이 이전에 분석 평가하는 것이 때문에 매우 중요하다.

로타 프로토콜 내에서 또 다른 중요한 단계는 마우스는 이전에 각각의 재판을 시작하기 (회전 반대 방향)으로 올바른 방향을 향하도록 보장하는 것입니다. 잘못된 방향을 향하도록 마우스기 다보 어려움 맞춤에 균형을 유지하고 결과...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

저자는 가넷 패스와 로드니 윌리엄스 기념 재단(The Garnett Passe and Rodney Williams Memorial Foundation)과 보쉬 연구소 동물 행동 시설(Bosch Institute Animal Behavioural Facility)에 감사를 표합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
로타로드IITC 생명 과학 Inc.#755"쥐 은못" = 직경 70mm. 에탄올이 방풍에 닿지 않도록 하십시오.
아이폰애플모든 유형의 카메라를 사용할 수 있습니다. 3D 관절 암에 부착하기 위해 뒷면에 고정된 벨크로.
3D 관절 암Fisso/BaitellaClassic 3300-28모든 유형의 안정적인 수직 스탠드가 적합합니다. 벨크로는 iPhone 부착을 위해 팔의 정점 끝에 고정되어 있습니다.
나무 보행 빔: 직경실험 매개변수에 맞게 다양한 직경 및 단면 모양을 사용할 수 있습니다
11mm 두께의 보드
41 x 41mm 빔으로 만든 지지대: 시작과 목표 끝에서 각각 지면에서 525 및 590mm 떨어진 2개의 수직 빔; 보행 빔 바로 아래에서 지면을 따라 달리는 803mm 수평 빔; 두 개의 20mm 길이의 빔이 "피트" 역할을 하여 각 끝에서 수평 및 수직 빔을 결합합니다. "시작" 수직 빔의 정점 끝에 깎인 21 x 21 x 36mm 블록; 13 x 13 mm의 조리개가 이 블록의 중앙을 잘라내어 보행 빔에 수직으로 뻗어 있는 터널을 형성합니다.모든 조인을 작은 강철 브래킷으로 버팀대합니다.
블랙 페인트 (수성)핸디칸아크릴 매트 밸런스빔 장치의 모든 목재 표면에 블랙 2-3 코트
클리어 마감Wattle Estapol폴리 우레탄 매트모든 빔에 대한 단일 코트. 밸런스 빔 장치의 다른 모든 표면에 대한 이중 코팅
폼, 포장재밸런스 빔으로 인한 추락을 완충하기 위해
70% 에탄올, 종이 타월각 동물 사이의 깨끗한 빔과 골 상자.
거즈 패드 / 종이 타월을 정렬하기 위해
(홈 케이지에서)
14mm의 원형 단면을 가진 1m 길이의 부드러운 나무 스트립 로 만든 나무 골 상자(130 x 140 x 220mm) 골 상자 마우스 하우스 바닥

참고문헌

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  22. Tung, V. W., et al. An isolated semi-intact preparation of the mouse vestibular sensory epithelium for electrophysiology and high-resolution two-photon microscopy. J. Vis. Exp. (76), (2013).

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