이 프로토콜의 목표는 전자 상자성 공명(EPR) 모니터링 산화 환원 적정을 사용하여 Saccharomyces cerevisiae Nar1의 다양한 보조 인자를 식별하는 것입니다. 산화 환원 적정은 효소 및 단백질에서 다양한 산화 환원 활성 보조 인자의 중간점 전위를 얻을 수 있는 매우 강력한 방법을 제공합니다.
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이 논문에서
요약
초록
전자 스핀 공명 (EPR)가 산화 환원 적정 강력한 방법은 보조 인자 단백질의 중간 점 전위를 결정하고, 그 검출 산화 환원 상태에서 보조 자극 분자를 식별하고 정량화 모니터링한다.
기술은 전자 전달 속도에 대한 정보를 제공하지 않기 때문에, 접근하지만, 연구중인 단백질 공동 인자의 정체 및 산화 환원 상태를 확립 않는 직접 전기 화학 (볼타) 상보 적이다. 기술은 전자 상자성 공명 (EPR)을 포함하는 보조 인자 검출하는 단백질에 넓게 적용 할 수있는 것이다.
전형적인 적정 1-100 μM의 범위의 농도를 갖는 조효소 2 ㎖의 단백질을 필요로한다. 단백질은 일정한 전위로 샘플을 포이즈 위해 화학적 환원제 (온산 나트륨) 또는 산화제 (페리 시안화 칼륨)으로 적정한다. 백금선과 Ag / AgCl 기준 전극은 볼트에 연결되어m은 단백질 용액의 전위를 측정 하였다. 13 개의 다른 레 독스 매개체 세트는 단백질의 산화 환원 보조 인자와 전극 사이에 평형을 위해 사용된다. 샘플이 단백질이 다른 산화 환원 보조 인자에 대한 특성이 서로 다른 전위 전자 상자성 공명 스펙트럼에 그려, 측정된다. 시료 대 전위 신호 세기의 플롯은 보조 인자의 중간 점 전위를 측정하기 위해 네른스트 식을 이용하여 분석한다.
서론
그것은이 행성, 광합성, 질소 고정 호흡으로 생명에 가장 기본적인 화학 공정은 유기 및 무기 산화 환원 보조 인자를 포함하는 다양한 범위의 큰 단백질 복합체에 의해 촉매되는 타격이다. 이는 전체 단백질의 약 30 %가 하나 이상의 금속 보조 인자를 포함하는 것으로 추정되었다. 1,2- 식별 및 산화 환원 보조 인자 직접 전기 화학 (예, 단백질 막 볼타) 또는 산화 환원 적정을 사용하여 확립 될 수 특성화. 두 가지 기술은 자연과 적용의 상호 보완 적이다. 전압 전류는 전극 표면과 반응 할 수있는 중간 전위 보조 인자의 전자 이동 반응 속도의 빠른 결정을 제공한다. -3,4- 보통 이것은 사이토 크롬 C 또는 페레 독신과 같은 전자 전달 단백질에 대해 잘 작동한다. 그리고 그것은 때때로 전극 표면에 고정화 된 더 복잡한 단백질 작동합니다. 자세한 지식단백질의 보조 인자의 특성은 전압 전류가 보조 인자 (cofactor)의 신원에 대한 직접적인 정보를 제공하지 않으므로, 사용할 수 있습니다. 산화 환원 적정을 실행하는 것이 더 힘든하고 단백질 mg의 양을 필요로한다. 그러나, 이들은 중간 전위와 보조 인자의 신원에 관한 정보를 제공한다. 또한,도 5의 여러 단백질 공동 인자가 모니터링 될 수있는 단일의 적정.
산화 환원 적정의 원리는 산화 환원 활성 단백질 또는 효소 또는 화학적으로 산화 환원된다는 것이다. 위해 공동 인자가 사용되는 환원제 또는 산화제 산화 환원 매개체와 반응되었는지 확인합니다. 이러한 산화 환원 매개체는 또한 용액의 전위를 측정 할 수 있도록 전극과 반응. 산화 환원 매개체는 버퍼로서 작용하여 단백질 전극과 보조 인자 사이에 평형. 화학적 원하는 값 전위 poising 후, 샘플은 AW 액상 질소에서 빠르게 동결 흡인되고분광 기술을 추가 분석을 AIT. EPR 분광법은 정량적 상자성 금속 중심 또는 유기 라디칼을 측정하는데 사용될 수있다이 점에서 특히 유용하다.
산화 환원 적정은 두 방향으로 수행 할 수 있습니다 낮은에서 높은 또는 높은에서 낮은 중간 잠재력. 선택은 연구중인 보조 인자의 안정성에 따라 달라집니다. 종종 낮은 전위에서 시작하고 잠재력을 증가 단계적하는 산화제를 추가하는 것이 현명하다. 이것은 산화 적정 호출되고 여기에 설명된다. 여기서 우리는 사카로 미세스 세 레비 시아 Nar1로부터 단백질을 함유하는 철 - 황 클러스터의 산화 환원 적정을 나타낸다. 이 단백질은 세포질 철 - 황 클러스터 생합성 기계 (CIA 경로)에, 비계 단백질로, 가능성이 참여하고있다. 6,7
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프로토콜
설치 및 솔루션 1. 준비
- 100 mM 트리스, pH가 8.5에서 250 mM의 NaCl을 10 % 글리세롤을 포함하는 완충 용액을 준비합니다. 아르곤으로 플러싱 버퍼의 배기. 혐기성 챔버로 버퍼를 소개합니다.
- 두 부분에서 버퍼를 나눈다. 한 부분 (버퍼)가 1 mM의 DL-디티을 추가하려면 1 밀리미터 L 시스테인 (DTT, M은 154.25 g / 몰 R). 다른 부분 (버퍼 B)는 환원제가 포함되어 있지 않습니다.
- 산화제 및 환원제 솔루션을 준비합니다. 1 ML의 2의 솔루션, 20, 200 mM의 페리 시안화 칼륨을 확인 (FIC, M은 329.26 g / 몰 R) 및 혐기성 버퍼 B.에서 온산 나트륨 (SD, M은 174.11 g / mol 인 R)의
- 다음과 같이 매개 믹스를 준비합니다
- B 버퍼는 아래의 산화 환원 매개 제 및 50 mM의 NaCl을 각각 160 μM 추가 : N, N, N ', N'테트라 메틸 -p- phenylendediamine (TMPD, M은 237.17 g / 몰, R, E '0 0.276 V) 2,6- 디클로로 페놀 인도 페놀(DCIP, M은 290.08 g / 몰, E R, 메틸렌 블루 (M r에 '(0 0.055 V, 페나 ethosulphate 0 0.217 V)를 PES, M은 334.4 g / 몰, E R') 319.85 g / 몰, E ' 0 0.011 V), 레조 루핀 (resorufin) (M 연구 235.17 g / mol이고, E '0 -0.051 V) Indigodisulphonate (M 연구 466.35 g / mol이고, E'0 -0.125 V), 2- 히드 록시 -1,4- naphtaquinone ( R의 M 174.15 g / mol이고, E '0 -0.145 V), 안트라 퀴논 -2- 술폰산 (M 연구 328.28 g / mol이고, E'0 -0.225 V) Phenosafranin (M R 322.8 g / 몰, E '0 -0.252 V), Safranin O (M r에 350.84 g / 몰, E '0 -0.280 V), 중립 빨간색 (M r에 288.8 g / 몰, E'0 -0.340 V), 벤질 비올로 겐 (M R 409.4 g / 몰, E '0 -0.350 V) 및 메틸 비올로 겐 (M은 257.16 g / mol이고, E, R'을 0 -0.440 V).
- 중재자를 보호하기 위해 알루미늄 호일에 병을 감싸빛으로부터의.
- 준비 10 ㎎ / ㎖ S. cerevisiae의 연쇄상 구균-태그 Nar1 단백질 버퍼 A. 익스프레스 S.에서 (181 μM, M은 55.2 kDa의 R) E.에서 cerevisiae의 Nar1 대장균은 연쇄상 구균 단백질로서 태깅 pET24A 발현 벡터를 이용. 연쇄상-tactin 크로마토 매체 (IBA)를 사용하여 혐기성 챔버에서 단백질을 정제 및 악타 청정기 (GE 헬스 케어)으로 단백질 정제 시스템을 사용하여 정제.
- 다음 혐기 챔버에서 산화 환원 적정 설치 준비 :
- Ag / AgCl 기준 전극과 적정 용기에 백금 와이어 전극을 연결한다. V.까지 MV에서 측정 할 수있는 전압계에 두 전극을 연결
- 작은 교반 막대를 삽입합니다.
- 자석 교반기 위의 적정 용기를 놓습니다.
- 완충액 B, 즉, 72 μM의 최종 단백질 농도를 최대 2 ㎖, 각각 38 μM의 매개체로 혼합 용액 및 단백질 용액으로 적정 용기를 채우기중재자. 주 : 단백질 농도에 의존하고 필요한 매개체가 조정되어야 세 용액의 양 농도.
- 30 분 동안 저어 전압계에 전환합니다.
- 10 깨끗한 석영 유리 EPR 튜브를 준비합니다. 혐기성 챔버 내에 도입 관.
- 액체 질소로 작은 (200 ㎖ 년경) 액체 질소 듀어를 입력합니다.
2. 산화 환원 적정을 수행
- 용액의 전위가 안정 될 때까지 기다립니다. 주 :이 실제로 전위가 분당 1 mV 미만 드리프트 것을 의미한다.
- 전압계에 의해 주어진 잠재력을합니다.
- 200 μL의 첫 번째 샘플을 그리고 EPR 튜브에 주입.
- 고무 마개로 튜브를 캡과 혐기성 챔버에서 튜브를 제거합니다.
- 다음과 같이 액체 질소에 튜브를 고정 :주의! 이것은 그렇지 않으면 관이 끊어집니다, 천천히 수행해야합니다.
- 먼저 t을 삽입액체 질소에서의 IP 튜브.
- 치찰음의 소리가 될 수있을 때까지 기다립니다. 참고 :이 10 초까지 걸릴 수 있습니다.
- 샘플 파트가 완전히 잠기도록 천천히 튜브의 나머지 부분을 삽입한다.
- -0.6 V로 용액의 전위를 낮추기 위해 적정 용기 내의 용액에 2 mM의 SD 용액의 작은 분취 1-2 μl를 추가
참고 : 10 개 이상의 μL 첨가되어야한다면, 20mM의 용액으로 전환. 그것이 특정 전위 값 포이즈 매우 어렵 기 때문에, 전압계에 기록 된 실제 값이 적어 및 적정 곡선을 구성하는 데 사용된다. - 단계 2.3-2.5의 설명에 따라 샘플을 그린다.
- 전압계에 의해 주어진 실제 가능성을합니다.
- 가능성이 약 50 MV 증가 할 때까지 산화제를 추가합니다. 2 mM의 FIC 용액의 작은 분취 1-2 μl를 첨가하여 시작한다. 이상 10 μL를 추가해야 할 경우, 20mM의 용액으로 전환.
- 호를 참고와트 솔루션의 대부분이 추가되었습니다. 주 : 이것은 적정 기간 동안 시료 희석을 교정 할 필요가있다.
- 단계 2.3-2.5의 설명에 따라 샘플을 그린다.
- 전압계에 의해 주어진 실제 가능성을합니다.
- 반복 덮여있다 -0.6 V 0.2에 V에서 잠재적 인 범위까지 2.9 및 2.12 단계를 모두 10 EPR 튜브 200 μL 각을 채워집니다.
주 : 모든 출금 볼륨이 감소됨에 따라, 전극의 위치는 조정될 필요가 간섭없이 교반 용액과의 양호한 접촉을 가질 수있다. 이 마지막 샘플의 취하하므로 그 시료의 전위가 덜 정확할 수있다 후의 전위를 측정하기 어려울 수도있다. - EPR 측정이 일어날 때까지 선택적으로, 액체 질소에 냉동 EPR 샘플을 저장합니다.
EPR 분광학 및 데이터 분석을 사용하여 3. 측정 적정 샘플
- 다른의 기록 EPR 스펙트럼적정 샘플은 다음과 같습니다 :
- <10-5 막대에 석영 저온 유지 장치를 대피 높은 진공 펌프를 사용합니다.
- EPR 자석의 물 냉각에 전환합니다. EPR 구멍을 통해 건조한 공기의 흐름을 엽니 다.
- 자석 전원과 EPR의 컴퓨터 스위치.
- 주파수 보정 프로그램을 실행합니다. EPR 측정 매개 변수를 설정합니다. 액체 헬륨 듀어에 저온 유지 장치를 연결합니다. 9-16 K.에 캐비티 쿨
- 공동의 EPR 샘플을 소개합니다. EPR 스펙트럼을 기록합니다.
- 다른 EPR 종을 확인하고 신호를 정량화하는 가장 좋은 스펙트럼을 사용합니다. 외부 구리 표준 용액의 스펙트럼 스펙트럼과 비교 더블 통합하여 EPR 정량을 달성 10 mM의 CuSO / 2 M 차아 염소산 나트륨 4 10분의 4 mM의 염산. (8)
- 다음 적정 곡선을 확인 :
- 파라에 대한 특징 g 값에 EPR 신호 진폭 플롯가능성에 대한 관심의 자기 종.
- 스핀에 EPR 신호 진폭 스케일을 변경 / 분자 규모를 단계 3.2에서 EPR 정량을 사용하여.
- 산화제 또는 환원제의 첨가로 인해 발생한 희석 각 샘플의 신호 진폭을 수정한다.
- Ag / AgCl 기준 전극의 전위에 대한 중간 점 전위를 수정한다.
주 : (포화 된 KCl을 포함) Ag / AgCl 기준 전극은 25 ° C에서의 표준 수소 전극 (SHE) 대 0.194 V의 중간 점 전위를 갖는다. 전압계의 전위는 -0.6 V 년경 읽으면 따라서, SHE을 참조 전위는 -0.4이다 V.
- 다음과 같이 네른스트 식에 맞는 신호 :
종은 그 감소 된 상태에서 상자성은 다음과 같습니다
상자성가 오에있는 종xidized 상태 :
중간 상태에서 상자성하는 종의 경우 :
이러한 방정식은 하나의 전자가 전송 된 산화 환원 반응에 유효하므로 N = 1.
볼트의 E는 = 가능성
E의 m = 볼트에 중점 가능성
F = 패러데이 상수 = 96,480 C · 몰 -1
R = 기체 상수 = 8.314 J · K -1 · 몰 -1
켈빈 T는 = 온도
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결과
Nar1 : 사카로 미세스 세 레비 시아에서 단백질 Nar1를 포함하는 철 - 황 클러스터의 산화 환원 적정 세 가지 보조 인자의 확인 결과 [3Fe-4S] 클러스터, [4Fe-4S] 클러스터와 단핵 철 센터 (그림 1) . EPR 신호는 자신의 g-값 특징 : 대한 [3Fe-4S] + g Z 2.01 g 크로스 오버 2.00 (그림 1B); 대한 [4Fe-4S] +, G z를 2.02 g y를 1.93, g X 1.82 (그림 C) 및 단핵구의 Fe 3+ g 4.3 및 9.7 (그림 1A)를 참조하십시오. [4Fe-4S] + 클러스터의 EPR 신호가 Nar1에 대해보고 된 내용과 매우 유사 이전. 6,9
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토론
13 산화 환원 매개체의 시리즈에서 -0.45 SHE 대 +0.3 V (표 1 및도 3)의 범위로 용액의 산화 환원 평형을 허용한다. 그럼 위의 이러한 잠재력 아래의 모든 매개체 중 하나를 완전히 줄어들거나 완전히 산화 따라서 단백질의 산화 환원 반응의 센터와 더 이상 평형은 발생하지 않을 수 있습니다. 때때로 산화 환원 적정 만 좁은 범위 11 측정 될 수 있도록, 두 개 또는 세 개의 매개로 수행 문헌 이것은, 중요한 개념이다. 산화 환원 매개체는 보조 인자의 중간 점 전위의 약 ± 50 MV의 범위 내에서 중간 전위가 있으면 이러한 산화 환원 적정 만 신뢰할 수있는 결과를 줄 것이다. 다른 매개체의 중간 전위의 온도 의존성이 결정되고있어, 그 산화 환원 적정 짹이 80 ° C. 증발시켜 12만큼 높은 온도에서 수행 될 수있다 나타났다배급량 용액 가장 단백질 함유 용액과 호환 뉴졸 광유의 층을 추가로 방지 할 수있다.
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
이 작품은 재정적으로 화학 디자인 (NRSC-촉매)에 의해 제어 네덜란드 국가 연구 학교 겸용, 촉매에서 연구비에 의해 지원되었다. 박사 HY Steensma과 라이덴 대학에서 박사 GPH 반 Heusden는 S의 재조합 발현과의 지원 인정 cerevisiae의 Nar1.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 기준 전극 (Ag/AgCl) | 복사계 | ||
| 화학 물질 | Sigma-Aldrich | ||
| EPR 분광계 | Bruker | ||
| N,N,N',N' -테트라메틸-p-페닐렌데디아민(TMPD) &미드도트; (HCl) 2< / sub> | 637-01-4 | ||
| 2,6- 디클로로 페놀 인도 페놀 (DCIP), 나트륨 염 | 620-45-1 | ||
| 페나 진 에토 설페이트 (PES) | 10510-77-7 | ||
| 메틸렌 블루 | 122965-43-9 | ||
| 레 소리 루핀, 나트륨 염 | 34994-50-8 | ||
| 인디고 디설포 네이트 (인디고 카민) | 860-22-0 | ||
| 2- 하이드 록시 -1,4- 나프 타퀴논 | 83-72-7 | ||
| 안트라 퀴논 -2- 설포 네이트 Na + < / sup > H 2 < / sub>O | 153277-35-1 | ||
| 페노 사프라닌 | 81-93-6 | ||
| 사프라닌 O | 477-73-6 | ||
| 중립 적색 | 553-24-2 | ||
| 벤질 바이올로겐 | 1102-19-8 | ||
| 메틸 바이올로겐 | 1910-42-5 |
참고문헌
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