방법 논문

방법은 자발적인 특성화 및 놀라게 유도 로코을의 로테 논에 의한 파킨슨 병 모델에서합니다 초파리

DOI:

10.3791/51625

⸱

2014년 8월 17일

 ,  , 
1Department of Biology, Colby College

이 논문에서

요약

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파킨슨 병은 운동력 결함을 일으키는 중추 신경계의 도파민 성 뉴런의 변성으로 인한 신경 퇴행성 장애이다. 로테 논 모델 초파리 파킨슨 병. 이 논문은 로테 논으로 인한 자연 및 놀라게 유도 모두 운동 부족의 특성이 분석을 간략하게 설명합니다.

초록

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파킨슨 병은 주로 흑질에서, 중추 신경계에서 도파민 성 뉴런의 변성으로 인한 신경 퇴행성 장애이다. 질병은 인간의 강성, 떨림과 치매로 제시 모터 결함을 발생합니다. 로테 논은 미토콘드리아의 전자 전달계의 기능을 억제함으로써 산화 적 손상을 일으키는 살충제. 또한 초파리 파킨슨 병을 모델링하기 위해 사용된다. 파리 그들을 놀라게되는시 위쪽으로 올라 강요 고유의 부정적인 geotactic 응답을 가지고있다. 그것은 로테 논들이 아래쪽으로 도청 한 후 상승 할 수있는 파리의 능력을 방해 조기 사망률과 운동 결함을 유발한다는 설립되었습니다. 그러나, 자발적인 움직임에 로테 논의 효과는 잘 설명되지 않는다. 이 연구에서 로테 논에 의한 결함의 특성을이 민감한 재현성, 높은 처리량 분석을 설명단기 초파리 운동 및 장기 자발적인 운동을 놀라게은 유도. 이러한 분석법은 편리 운동력 결함 치료제의 효능을 다른 초파리 모델을 특성화하도록 구성 될 수있다.

서론

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운동력 결핍은 파킨슨 병의 주요 증상이며 크게 흑색질 (1)의 도파민 뉴런의 열화에 의해 야기된다. 로테 논은 초파리 2-6 파킨슨 모터 적자를 모델로 광범위하게 연구 된 케톤 살충제입니다. 로테 논은 궁극적으로 세포의 죽음 (7)의 원인이되는 산화 적 인산화 경로를 차단하여 산화 적 손상이 발생합니다. 도파민 뉴런은 주로 모터 2,7 기반 화학 물질의 효과를 만들고, 로테 논 독성에 더 쉽다. 파리에서 파킨슨 병 증상을 유도함으로써, 우리는 더 나은 질병을 이해하고 6,8-11이. 초파리들이 유지 보수가 용이, 유전자 취급 용이하기 때문에 이러한 효과를 연구하기위한 좋은 모델을 제공 증상을 개선하고 급속한 수명을 가질 수있다.

몇몇 연구 로테 논 단기 놀라게 유도 일으키는 것으로 나타났다초파리 언제 파리에서 운동 결함 로테 논 - 보충 식품에서 유지, 그들은 놀람 2-6 후 느린 부정적인 geotactic 응답을 보여줍니다. 컨트롤 실험 빨리 바이알 장치에서 위쪽으로 오르는 그들의 실패 놀라게 유도 운동력 결함을 나타낸다.

장기간에 로테 논의 효과는, 자발 운동은 잘 초파리 활동 모니터 (댐)이 성공적 초파리 생체 리듬 운동을 모니터링하는데 사용되어왔다. 설명 12,13 연구되지 않는다. 파리는 DAM에로드 된 각각의 튜브에 배치됩니다. 이 장치는 비행 적외선 빔을 중단 횟수를 카운트 적외선 센서가 장착된다. 이 카운트는 교란 운동 및 활동 12,13의 척도로 사용될 수있다. DAM에 파리를 배치하여 자신의 장기 운동에 로테 논의 효과가 특징으로 할 수있다. 이 연구는 MEAS에 대한 방법을 설명합니다URE 단기 나은 로테 논 매개 모터 결함의 영향을 이해하기 위해 운동과 장기 자발 운동 놀라게는 유도. 그들이이 운동 결함을 반대 할 수있는 다른 화합물의 연구를 위해 수 있기 때문에 파킨슨 병을 흉내 낸 운동 부족의 특성이 중요하다.

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프로토콜

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1 초파리 놀라게 유도 로코의 분석

  1. 약물 치료
    1. 원하는 번호를 고정화하는 차분한 (약 8 ~ 12) 1-3 일 된 남성 CO 2를 사용하여 약물이 첨가 된 음식을 포함하는 유리 병에 수송 파리. 참고 : 또 다른 마취 예를 들면, 에테르, 얼음 계산 및 처리를 가능하게하기 위해 파리를 마취하는 데 사용할 수 있습니다.
    2. 25 ° C에서 파​​리 (파리를 방지하기 위해 식품에 갇히지) 수평으로 유리 병 20 분 (또는 복구까지)에 대한 진정을 복구 한 후 12 시간 어둠 속에서 똑바로 유리 병을 배치 할 수 있도록 허용, 12 시간 빛 인큐베이터 실험의 나머지.
  2. 실험 세트 최대
    1. 영구 마커 튜브 주위에 원을 표시하여 6.33 cm의 세 동일한 섹션으로이 두 병 설정을 나눈다.
    2. 약물 노출 3 일 후에, 전송은 바이알 바닥에 마취없이 빠르게 날아 가기 바이알을 놓고입구에. 분명 테이프와 함께 병을 두 개 테이프입니다.
    3. 파리 15 분 동안 새로운 환경에 적응할 수 있도록해야합니다.
    4. 장소 흰색 배경에 튜브 및보기에 타이머 이중 유리 병 장치로부터 적절한 거리에 디지털 카메라를 설정합니다. 장치 전체가 하나의 액자에 표시됩니다 확인하고 모든 파리는 초점이있다. 실험 사이의 일관성을 유지하기 위해 프레임들, 카메라 및 바이알의 위치를​​ 표시한다.
  3. 모바일 분석
    1. 분명히 카메라 뷰에서 재판 번호, 약물 치료, 그리고 타이머를 표시합니다.
    2. 단단히 카운터에 세 번 두 번 유리 병 장치를 누르고 모든 파리는 유리 병의 바닥에 떨어질 있는지 확인합니다. 동시에 타이머를 시작합니다.
    3. 매 5 초마다 1 분 동안, 장치의 사진을 촬영. 참고 : 또는 비디오 캡처 및 측정을위한 적절한 간격으로 일시 중지 될 수있다.
    4. 파리 1 분 동안 방해받지 않고 복구 할 수 있습니다.
    5. 각 시험 사이에 1 분 복구 시간을 2 번 이상 반복합니다. 주 : 각 장치는 데이터 수집을 완료 5 분 소요. 시험 사이에 도청 비슷한 힘을 유지한다. 다수의 (적어도 3) 장치는 동시에 쉽게 취급 할 수있다.
  4. 데이터 분석
    1. 사진을 검토하고 시간이 지남에 따라 각 섹션에서 파리의 수를 기록한다. 시간이 지남에 따라 각 섹션에서 파리의 비율을 계산합니다. 주 : 예를 들어, 일 3, 5에 대한 관심이 또는 세 시점에서 같은 파리이 전체 절차를 반복하고, 너무 많은 파리를 보상하기 위해 원래 시험 수를 확장하는 것이 가능 실험을하는 동안 죽을 7 경우 사망률. 데이터를 비교하기 위해 적절한 통계 분석을 사용합니다.

2 초파리 자발적 로코의 분석

  1. 음식 준비
    1. 탈 이온수 15 ml의 물과 함께 원하는 로테 논 인스턴트 초파리 배지 3g 재구성(또는 관심의 다른 약물) 복​​용.
    2. 식품 혼합물 회사 (약 5 분)가되면, 조심스럽게 제조 업체에 높은 약 1cm 투명 튜브 (5mm X 65mm)를 공급하는 음식을로드합니다. 조심스럽게 음식을 수직으로 튜브를 삽입하고이 관 내부의 음식을 제거 할 수 있습니다 때까지를 왜곡하여 튜브로 음식을 주입 약물을 추가합니다. 참고 : 진공을 만들기 위해 튜브의 구멍에 손가락을 배치하는 것이 도움이된다. 음식은 공기 방울을 포함하거나 파리가 붙어 될 수 요철이 없어야합니다.
  2. 실험 설정
    1. 음식 가까운 튜브의 끝 부분에 플라스틱 캡을 배치합니다. 강제로 푸시 경우가 바이알에 기포를 생성 할 수 있기 때문에, 가능한 한 작은 플라스틱 튜브에 캡을 밀어.
    2. 침착 한 일일 세 남자는 CO 2를 사용하여 조심스럽게 한 남성이 페인트 브러시와 각 튜브에 비행 삽입 날아갑니다. 원하는 시험의 수에 따라 반복한다.
    3. 연결손 큰 상점에서 롤백 할 수있는 작은 목화 공을 가진 음식에서 튜브 먼의 끝은 면봉을 샀다.
    4. 파리 15 분간 수평으로 튜브 복구하고 모든 파리가 살아 있고 활성화되어 있는지 확인 할 수 있습니다. DAM에 튜브를 삽입하고 모든 튜브 댐 같은 상대적인 위치에 있는지 확인하십시오. 주 : 바이알의 중간에 모니터링 영역으로 이들을 배치, 또는 튜브의 단부가 모니터링되고, 그래서 측으로 모든 튜브를 밀어하는 것이 가능하다. 참고 :이 방법에 변화를 설명을 참조하십시오.
  3. 데이터 수집
    1. 12 시간 어둠 속에서 DAM을 배치, 12 시간 빛 인큐베이터는 25 ° C로 설정합니다. 데이터 수집 시스템에 DAM을 연결합니다. DAM 소프트웨어를 열고 환경 설정을 선택 빈 길이에 따라 10 분에. 데이터 수집을 시작하고 프로그램이 칠일에 대한 데이터를 수집 할 수 있습니다. 주 : 필요한 경우 빈 길이를 조정할 수있다.
    2. 데이터 분석
      참고 : 프로세스데이터는 장기 자발 운동을위한 수단으로 분당 카운트를 얻었다.
      1. 선택 입력 데이터를 클릭하여 열기 DAM 파일 스캔 프로그램 및 액세스 모니터 데이터입니다.
      2. 해당 모니터 범위를 선택하고 10 분 간격으로 빈 길이를 선택합니다.
      3. 출력 파일 형식에서 채널 파일을 선택합니다. 기본적으로 다른 모든 옵션을 둡니다.
      4. 스캔 데이터를 클릭하고 지정된 폴더에 저장합니다.
      5. 생체 데이터 분석 소프트웨어의 데이터 가져 오기가 분당 카운트를 얻었다. 참고 : 데이터 분석 Clocklab 소프트웨어는 일반적으로 사용하십시오. 다른 옵션도 사용할 수 있습니다.

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결과

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초파리 놀라게 유도 로코의 분석

야생형, 캔톤-S는, 파리는 30 초 (도 1) 이후 두 번 바이알 장치의 각각 단지 약 88 % 및 상부 및 하부 부분에있는 파리의 5 %와 강력한 geotactic 부정적인 반응을 보였다. 125 μM 3 일간 250 μM의 로테 노출 파리 상부 섹션 및 하부 섹션 파리의 수가 약간 증가 파리의 수가 약간 감소 하였다. 500 μM의 로테 논에 노출 파리는 파리 (그림 1)를 제어에 비해 바닥 부분에서 상단 부분에 적은 수의 파리보다 파리에 의해 입증 부정적인 geotactic 응답 하였다 (p <0.05 ANOVA, 페로 니 쌍의 현명한 비교)에 중요한 결함을 보여 주었다. 때문에 신속하게 장치에 오를 수 없다는 부정적인 geotactic 응답이 결함은 놀람 인에서 결함을 나타낸다하였으므로 운동력.

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토론

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본 연구에서는 파킨슨 병 로테 논 유도 초파리 모델에서 장기 자발 운동 단기 놀라게 유도 운동 모두를 측정하기위한 두 가지 방법을 설명한다. 하나는 또한 파킨슨 질환 등을 모델링하는 것으로 알려진 기타 약리학 적 제제, 파라콰트 14, 파킨슨 씨병 등의 유전 모델, 알파 - 시누 클레인 돌연변이 체 (15), 및 운동에 영향을주는 질환의 다른 플라이 모델에 노출 날아간 이러한 운동 특성을 측정 할 수있다. 두 방법 모두 대체 방법 및 수정이 고려 될 수있다. 파리는 CO 2 효과는 벗겨 수 있도록 데이터 수집 예를 지연에 대한 CO 2 마취의 제한을 완화 할 수 얼음을 사용하여 마취 할 수 있습니다.

파리 이동도 편차를 보여 주기성 때문에 놀라게 유도 식 이동 분석법에서, 그것의 데이터를 동시에 수집하는 것이 중요실험 ...

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공개 사항

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저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

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저자는 배경 음악을 제공하기 위해, 비디오 처리 및 에릭 토마스, 음악학과, 콜비 대학과 기술 지원을, Qiuli 왕, 언어 리소스 센터, 콜비 대학에게 감사의 말씀을 전합니다. 이 프로젝트는 연구 자료, INBRE을위한 국가 센터 (P20RR016463-12), 일반 의료 과학 국립 연구소 (P20의 GM103423-12)에서 보조금에 의해 지원되었다, 보건 및 과학 사업부 그랜트, 콜비 대학 (STA)의 국민 연구소. JL과 LWM 여름 학술 기금, 콜비 대학에서 보조금에 의해 지원되었다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
표준 좁은 바이알Genesee Scientific32-120
로테논시그마R8875냉동고에 보관하고, 각 실험마다 새로 만드십시오
디메틸 설폭사이드 (DMSO)SigmaD8418로테논
용 용매 인스턴트 드로소필라 매체Carolina Biological 화학식 4-24
초파리 활성 모니터(DAM)TrikineticsDAM2trikinetics.com
DAM 튜브Trikinetics튜브 5 X 65mm
로테논 + 식품 레시피(125mM 용량)1ml DMSO에 25mg 로테논을 용해시켜 DMSO에서 62.5mM 로테논 원액을 만듭니다. 125mM 용량의 경우 물 5ml에 DMSO에 10mM 로테논 스톡을 첨가합니다.
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참고문헌

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재인쇄 및 허가

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