Method Article

1 채널의 세포 부착 된 패치 클램프 녹음

DOI:

10.3791/51629

⸱

June 9th, 2014

 ,  ,  ,  , 
1Graduate Program in Neuroscience, SMBS, University at Buffalo, SUNY, 2Department of Biochemistry, SMBS, University at Buffalo, SUNY, 3Molecular and Cellular Neuroscience Department, The Scripps Research Institute, 4Department of Biochemistry and Graduate Program in Neuroscience, SMBS, University at Buffalo, SUNY

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

여기에 설명하는 세포 부착 된 패치 클램프 기술로 하나의 이온 채널에서 현재 기록의 장기 복역을 얻기위한 절차입니다. 이 방법은 실시간으로 관찰을 허용, 생물학적 신호를 기초 개폐 채널 입체 형태의 패턴. 이 데이터는 그대로 생체막의 채널 특성에 대해 알려 드리겠습니다.

Abstract

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이온 채널 단백질은 생물의 세포막에 걸쳐 빠른 통신을위한 보편적 인 장치입니다. 그들이 생성하는 이온 플럭스의 시간 서명은 각 채널 단백질뿐 아니라 생성하고 제어하는​​ 메커니즘에 대한 고유 특성에 따라 현재 연구의 중요한 영역을 나타냅니다. 이온 채널 단백질의 동역학 연산에 대한 정보는 단일 분자에 의해 생성 된 전류의 긴 뻗기를 관찰함으로써 수득 될 수있다. 리간드 게이트 이온 채널, NMDA 수용체에 대한 하나의 채널 세포 부착 된 패치 클램프 현재 녹음을 얻기위한 프로토콜이 여기에 설명, 대뇌 피질의 신경 세포 HEK293 세포 또는 기본적으로 발현 된. 또한 메카에 민감한 채널 PIEZO1의 예를 제시하여 관심의 다른 이온 채널에 방법을 적용하는 방법에 대한 지침을 제공합니다. 이 방법은 채널의 전도도 특성 및 OPE의 시간적 순서에 관한 데이터를 제공 할 수 있습니다따라서 건강과 질병에서의 기능을 이해하는 데 도움이 채널의 활성화 메커니즘을 구성하는 N-폐쇄 입체 형태.

Introduction

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생체막 걸쳐 패스트 통신은 일반적으로 채널로 지칭 올리고머 기공 형성하는 막 단백질에 거의 전적으로 의존한다. 이 단백질은 활성화 신호 게이팅 메커니즘 및 전도성 속성에서 크게 다르다. 그 구멍 이온에 선택적인 채널 단백질은 이온 채널로 분류됩니다; 그들의 활성화를 막을 가로 질러 이온 전류를 생성하고, 그 응답은 전기 생리 기법을 사용하여 실시간으로 높은 해상도로 기록 될 수있다. 활성화 신호는 농도 기울기, 기계적 및 전기적 힘 및 온도를 포함하여 화학적 및 물리적 입력의 광범위한 어레이에 걸쳐; 따라서, 추가 리간드에 이온 채널을 분류하면, 게이트 mechanosensitive, 전압 게이트, 또는 열에 민감한 타입. 이 글에서, 프로토콜은 패치 클램프 기술을 사용하여, 리간드 게이트 채널, NMDA 수용체 및 mechanosensitive 채널, PIEZO1에서 1 채널 활동을 기록 할 수 있도록 서술되어있다.0;

패치 클램프 전기 생리학 단일 분자 1, 2의 관찰을 허용하도록 충분히 민감한 첫 번째이자 가장 널리 사용되는 실험 방법이다. 이 절묘한 감도 이외에, 그것은 크게 전기 생리 기록 의무 생물학적 제제를 확장하고 또한 양막에있는 이온 채널의 관찰을 허용했다. 클램핑 전압 및 전류의 기록이 모두 동일 전극....

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Protocol

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1. 세포 배양 및 단백질 발현

  1. HEK293 세포를 10 % 태아 소 혈청 (FBS)이 보충 된 DMEM에서 단층 배양에서, ATCC에 의해 수행 통로를 포함 통로 (22)와 (40) 사이 (ATCC 번호 CRL-1573) 및 5 % CO 2에서 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신 혼합물을 유지 37 ° C. 실험 사이에, 10 ㎖의 최종 부피의 5 ~ 20 배 희석에서 T25 플라스크에 통과 세포. 참고 :이 구절 동안 세포를 사용하여 최적의 인감 형성 및 패치 안정성을 위해 수 유리한 세포의 건강을 보장합니다.
  2. 형질의 경우, 접시 당 세포 현탁액에 ~ 0.5 ~ 0.6 ㎖에 해당 ~ 10 5 세포 / 요리의 밀도, 직경 35 ㎜ 요리 HEK293 세포를 플레이트와 18 ~ 24 시간 동안 2 ㎖ 배지에서 세포를 성장.
  3. 멸균 된 1.5 ㎖의 원심 분리 관에서, (이 순서대로)를 추가하여 네 개의 35mm 요리의 형질 전환 혼합물을 제조 : 각각의 cDNA (GluN1, GluN2A 및 GFP)의 (1) 1 μg을; (2) 315 μL의증류수 (DDH 2 O); (2 - 히드 록시 에틸) -1 - 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES), 침전물을 형성하기 위해 사용된다 현명한 2....

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Results

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재조합 NMDA 수용체

NMDA 수용체 결합과 두 개의 공동 작용제의 수반하는 작업에 응답 글루타민산과 글리신. 그들은 GluN1 서브 유닛과 GluN2 서브 유닛을 바인딩 두 글루타민산 바인딩 두 글리신 heterotetramers로 조립합니다. GluN2 서브 유닛은 뇌에서 가장 널리 전사 형태의 청소년 동물 성인 GluN2B에 GluN2A 4 개의 유전자 (AD)에 의해 이들의 인코딩된다. 때문에 (도 1a) 서브 유닛 조성의 제어뿐만 아니라, 미세하게 연마 된 유리 피펫 (도 1C)를 사용하여 채널에서의 전류를 기록하는 기능을 허용 HEK293 세포 수용체를 발현하는 천연 제제에서 NMDA 수용체 아형의 다양성.

피펫 셀 닿아 일단 테스트 펄스 파형의 진폭의 감소는 클리어 시일을 형성 할 수있는 능력을 나타낸다 (.......

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Discussion

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이온 채널 필드에 연구의 중요한 영역을 열거 나 채널의 게이트 메커니즘을 채널로 연결 이벤트의 순서를 이해하기 위해 최선을 다하고 있습니다. 대부분 채널의 경우,이 프로세스는 복잡하고, 거시적 멀티 채널 신호로부터 도출 될 수없는 여러 운동 단계를 포함한다. 대조적으로, 실험은 단일 채널 레코드의 개방 / 폐쇄 이벤트의 시퀀스를 관찰하는 게이팅 메커니즘에 대한 더 상세한 정보를 생성 할 수있는 설계 될 수있다. 최소 침습 패치 클램프 녹음이 일정 조건에서 수행 될 수 있도록 여기에 설명 된 방법에서, NMDA 수용체에 의해 소유 외부에있는 리간드 결합 도메인이 있습니다. 이 프로토콜은 리간드와 수용체의 속성을 모두에 따라 다른 리간드 게이트 이온 채널을 연구에 적합하기 위해 적응해야 할 수도 있습니다.

단일 채널 활동 기록은 가치있는 두 가지 유형의 정보를 제공한다. 첫째,단일 전류 진폭을 직접 측정 할 수 있으므로, 실험은 채널 컨덕턴스, 투과도 및 선택과 같은 세공 속성에.......

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 논문의 저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

이 작품은 F31NS086765 (KAC)에 의해 지원되었다, F31NS076235 (MAP), 및 R01 NS052669 (GKP) 및 EIA9100012. 저자는 전문 지식과 분자 생물학 및 조직 문화에 대한 지원은 아일린 Kasperek 감사합니다; 제이슨 마이어스 초기 전두엽 대뇌 피질의 신경 세포에서 얻은 데이터를 공유.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
화학 물질: SigmaVarious
Borosillicate GlassSutterBF-150-86-10
명시야 도립 현미경Olympus1x51Nikon에도 유사한 현미경이 있습니다.
광 상자X-cite시리즈 120
액체 광 가이드X-citeOEX-LG15
MicromanipulatorSutter InstrumentsMP-225
오실로스코프TektronixTDS1001
증폭기분자 장치Axon Axopatch 200B
테이블TMC63561
NIDAQ 카드National Instruments776844-01
풀러NarishigePC-10
폴리셔NarishigeMicroforge MF-830
패러데이 케이지TMC8133306
고속 압력 클램프ALA Scientific InstrumentsALA HSPC
압력/진공 펌프ALA Scientific InstrumentsALA PV-PUMPFOR HSP-1
형

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Neher, E., Sakmann, B. Single-channel currents recorded from membrane of denervated frog muscle fibres. Nature. 260, 799-802 (1976).
  2. Hamill, O. P., Marty, A., Neher, E., Sakmann, B., Sigworth, F. J. Improved patch-clamp techniques f....

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Cell attached Patch clampSingle Channel RecordingIon Channel ProteinsNMDA ReceptorPIEZO1 ChannelHEK293 CellsCortical NeuronsVoltage ClampQUB Data AcquisitionFire Polished Pipette

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