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방법 논문

쥐의 폐 전이의 미세 혈류 속도의 자동 측정

8.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51630

⸱

2014년 11월 30일

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1Division of Plastic, Maxillofacial, and Oral Surgery, Duke University Medical Center, 2Department of Radiation Oncology, Duke University Medical Center, 3Department of Cardiology, University of Colorado Denver, 4Department of Physical Chemistry, University of Mainz

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

폐쇄 흉부 폐폐 생체 내 현미경을 사용하여 자동화된 방식으로 쥐의 흉막 표면 전이에서 미세순환 혈류 속도를 측정하는 방법을 제시합니다. 이 모델은 설치류의 폐 전이에 대한 생리학적 연구를 수행하기 위한 광범위한 도구로 사용될 가능성이 있습니다.

초록

폐는 전이성 질환의 주요 표적 기관이기 때문에 폐 전이의 생리학을 연구하기 위한 동물 모델이 매우 중요합니다. 그러나 현미경으로 폐에 접근하기 어렵기 때문에 미세순환 수준에서 동적 방식으로 폐 전이를 조사할 수 있는 방법은 현재까지 거의 없습니다. 여기에서는 폐흉 폐창과 혈류 속도 및 방향의 자동 분석을 사용하여 쥐의 표재성 폐 전이의 미세 순환을 기능적으로 이미지화하고 정량화하기 위해 생체 내 현미경 검사 방법이 제시됩니다. 이 방법의 유용성은 약리학적 개입에 대한 반응으로 혈류 속도의 증가를 측정하고 고형 종양의 잘 알려진 구불구불한 혈관 구조를 이미지화하는 데 입증되었습니다. 이것은 폐쇄형 흉부 모델에서 폐 전이에 대한 생체 내 현미경 검사의 첫 번째 시연입니다. 침습성이 최소화되고 상대적으로 쉽고 실용성이 높기 때문에 이 기술은 폐종양 연구를 전문으로 하는 실험실에서 널리 사용될 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다.

서론

폐는 전이성 질환의 가장 중요한 표적 기관 중 하나이며, 이 질환은 화학요법과 방사선 요법으로 성공적으로 치료하기 어렵기 때문에 완치법은 여전히 드물다1,2. 미국소 저산소증(microregional hypoxia), 확산 제한(diffusion limitation), 비효율적인 종양 혈관 구조(misefficient tumor vasculature)와 같은 고형 원발성 및 전이성 종양의 특정 병태생리학적 및 미세순환적 특징은 항암 치료에 대한 저항성에 크게 기여한다3,4. 미세혈관 혈류와 같은 매개변수의 미시적 규모와 동역학적 특성으로 인해, 살아있는 동물의 종양에 대한 생체 내 현미경 검사는 이 분야에서 매우 중요한 연구 도구가 되었다5. 활활기내 현미경 검사 모델이 열린 흉곽 내의 전이성 폐를 포함하여 다양한 장기 부위의 종양에 적용되었지만, 생리학적으로 보존된 폐쇄형 흉부 환경에서 폐 전이 연구를 위한 프로토콜은 아직 개발되지 않았습니다6,7. 이러한 노력은 특히 폐의 전반적인 기능에 영향을 미치지 않고 흉곽에 외과적으로 접근해야 할 필요성 때문에 방해를 받는다7-9. 최근에는 살아있는 쥐의 가슴이 가까운 환경에서 형광 생체 내 현미경 검사를 사용하여 폐 미세순환 혈류를 이미지화하는 방법이 도입되었습니다10. 이 프로토콜은 컴퓨터 분석을 사용하여 주입된 형광 표지된 적혈구의 혈류 속도를 체계적으로 정량화하는 동시에 동물을 생리학적으로 안정적으로 유지하고 폐의 무결성을 보존할 수 있습니다11. 본 연구에서는 면역이 저하된 쥐의 흉막 표면에서 꼬리 정맥이 접종된 폐 전이의 미세순환 혈류를 이미지화하고 정량화하기 위해 이 기술을 어떻게 수정할 수 있는지 보여줍니다. 이 모델은 또한 폐쇄형 흉부 치바이탈 현미경 환경에서 전이성 폐 종양을 연구한 최초의 모델입니다.

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프로토콜

참고 :이 프로토콜에 설명 된 모든 동물 관련 절차 이전에 듀크 대학 기관 동물 관리 및 사용위원회 (DUIACUC)에 의해 승인되었습니다.

1. 암 세포 배양 및 사출

  1. 형광 표지 된 전이성 암 세포를 배양 (예를 들어 인간의 MDAMB231-GFP 유방암 세포, 박사 패트리샤 STEEG, NCI 및 YFP 표지 마우스 육종 세포, 박사 데이빗 커쉬, 듀크 대학 의료 센터, 방사선 종양학 부서의 선물에서 선물) 적절한 배양 배지 (예 : 둘 베코 변형 이글 중간 10 % 소 태아 혈청과 1 % 페니실린 / 스트렙 트 아비딘 (DMEM)) 37 ° C에서 약 90 % 컨 플루 언트 될 때까지.
  2. , 세포를 Trypsinize PBS로 2 회 반복한다, 계산 한 다음, 27 G 바늘과 주사기를 사용, 동물 당 5 백만 세포에서 이소 플루 란 - 마취 10 주 오래 된 여성 누드 쥐의 꼬리 정맥로를 주입. 수술 수준 anesthesIA는 발가락 핀치에 반응의 부족에 의해 확인됩니다.

전이 사용 MicroCT 2. 모니터링

  1. 전이 직경 직경으로 약 2mm의 존재를 검출하기 위해, 마이크로 - CT / 마이크로 조사기를 사용하여 래트를 일주일에 한 번 검사. 이전 12 설명한 바와 같이 마이크로 CT를 의뢰한다.
    1. 이미징 이전에 3 % 이소 플루 란 마취에 따라 쥐. 발가락 핀치에 의해 깊은 마취를 확인합니다.
    2. 마취 개시 후 신속 촬상 챔버 촬상 크래들 래트를 전송 및 2.5-3 %의 이소 플루 란 - 공기 혼합물에 노즈 콘 통해 연결. 영상 크래들에 외부 위치 제어 및 레이저 구분 기호를 사용하여, 그 가슴이 MicroCT 스캐너의 광자 빔에 위치하는 방식으로 크래들에 쥐의 위치를​​ 조정합니다. 감마선에서 조사를 보호하기 위해, 영상 실의 문이 닫혀 있는지 확인합니다.
    3. 다시 사용하여 동물의 위치를​​ 제어컬러 비디오 카메라. 저해상도 CT 이미징 테스트 실행을 수행하고 흉강의 XYZ 치수의 시야를 조정하기 위해 생성 된 화상을 사용한다.
    4. 이미지 쥐의 40 KVP에서 2mm 알루미늄 필터를 사용하여 흉부, 2.5 mA, 7 FPS에서 0.008 복셀과는 케이지에 동물을 반환합니다. 한 동물의 이미지를 잘 작성하지 최근 15 또는 20 분 소요됩니다. 완전히 회복 될 때까지 다른 동물의 회사에 수술을 한 동물을 반환하지 않습니다. 이 흉골 드러 누움을 유지하기 위해 충분한 의식을 회복 할 때까지 무인 동물을 방치하지 마십시오.
    5. 흉부 내 혈관에 의해 설명 될 수없는 무선 비교적 불투명 오브젝트의 외관을 확인하여 전이 (도 1a)

3. 윈도우 상공 회의소 수술

  1. 마취, 활력 징후 및 꼬리 정맥 카테터
    1. 전이성 질환의 존재와 동물을 선택합니다. 복강 D와 동물을 주입50 ㎎ / ㎏ 펜 토바 비탈의 OSE. 진행하기 전에 발가락 핀치에 의한 수술 수준의 마취를 확인합니다.
      주 : 마취 프로토콜은 각각의 실험 장치와 일치해야합니다. 용이 한 재 투여 선택권을 제공하는 동안은 펜 토바 비탈, 긴 절차 깊은 마취를 유도하기 위하여, 긴 작용 마취제 여기 선택되었다. 그러나, 과다 복용에 동물의 손실은 펜 토바 비탈 마취 일반적인 문제입니다. 펜 토바 비탈보다 더 큰 정도의 자율 반사 신경을 보존 또 다른 옵션은 그러나 단 하나의 재 투여주기 허용 자일 라진 (xylazine) 또는 medetomidine, 같은 진정제와 함께 케타민입니다.
    2. 클리퍼를 사용하여, 전이성 질환이 있고, 목 영역에서 본체의 측면에 동물을 면도. 피부의 모든 남아있는 느슨한 머리를 닦아냅니다. 탈모 제거한 후 마르지 않도록, 눈 연고 수의학 적용.
      참고 : 무 흉선 누드 쥐 requi 잔류 머리를 가질 수있다수술 절차를 진행하기 전에 입술 제거. 이 수술 절차 및 이미징을 방해 할 수 있으므로 그것은 철저하게 모든 머리를 제거하는 것이 매우 중요합니다.
    3. 37 ° C의 물 순환 가열 패드에 배치되는 금속 접시에 앙와위에서 동물을 고정합니다. 앞과 뒤의 사지 테이프와 함께 접시에 고정되어 있습니다.
      주 : 제어 및 수술 및 실험 절차 전반에 걸쳐, 맥박 산소 측정기를 사용하여 심장 요금과 동맥혈 산소와 같은 생체 신호를 기록하는 데 유용합니다.
  2. 기관 삽관
    1. 기관에 길이 복부 근육의 중앙값 분리 하였다 횡 자궁 피부 절개를, 먼저, 동물의 환기를 위해 카테터를 배치하기 위해서는.
    2. 기관의 등쪽을 통해 봉합하는 통로를 만들 날카로운 집게 반복 개방에 폐쇄 조치를 사용합니다.
    3. t의 기관에 작은 절개를합니다그 복부 측면 약 두 번째 및 세 번째 기관 링 사이, 반원형보다는. 기관 카테터의 고정을 사용하려면, 등의 표면에 노출 된 기관의 충분히 긴 부분을 남겨주세요.
    4. 기관에 2.5-3.0 mm "Y"기관 캐뉼라를 삽입하고 4-0 모노 필라멘트 봉합사 조입니다. 양성 폐 압력을 유지하기 위해 캐 뉼러 물의 6cm로 채워진다 만료 덕트에 접속 병 압력 순환 호흡기에 연결되어 있는지 확인. 실험적으로 달리 언급되지 않으면, 유입 가스는, 산소 100 %이어야한다.
    5. 25 ~ 27 G 바늘 카테터를 삽입하고 쥐의 꼬리 정맥 중 하나에 헤파린 식염수로 가득하고, 테이프를 제자리에 고정합니다.
      주 : 반복 꼬리 정맥 내로 헤파린 염수 소량 주입 과정 전반에 걸쳐 꼬리 정맥 카테터의 개방성을 보장. 또한, 오로 - 기관 내 삽관은 기관의지도를 즉마취 된 동물의 입을 통해 및 기관에 후두 과거 튜브는 여기에 설명되어있는 기관 절개 절차에 대한 가능한 대안이다. 그러나,이 방법은 기관의 손상을 방지하고, 또한 식도 우발적 삽관을 배제하기 위해 특별한 훈련과 경험을 요구한다.
  3. 폐 윈도우의 응용 프로그램
    1. 무딘 절개를 이용하여 피부를 분리 한 후 절개를 생성 의해, 전이성 질환이있는 가슴 측으로부터 피부를 제거한다.
      참고 : 피부 절제와 초연 이후 제거 할 수 있습니다
    2. 오버레이 근육 (pectoralis, 앞 톱니와 넓은 등의 dorsi)의 2 층 해부,하지만 그대로 늑간 근육을 두어 진행합니다. 일반적으로 두 개의 인접한 갈비뼈의 일부를 제거하여, 직경 약 1.5 cm의 흉강에 구멍을 만듭니다. 이상적으로, 6, 7 R의 영역에 천공을 찾습니다IBS.
    3. 절골술 :
      1. 폐 표면에 출혈과 손상을 최소화하기 위해 긴밀하게 절삭 가공시에 톱니 수술 집게로 절단 할 수있는 리브를 개최합니다. 수술 용 가위를 이용하여 외부를 가리키는 나머지 갈비뼈의 뾰족한 측 떠나 약 45 °의 각도로, 제 리브의 내측부를 잘랐다.
      2. 이어서, 다시 폐 표면 손상을 방지하기 위해, 바깥쪽으로 가리키는 갈비뼈의 뾰족한 측 남게 유사한 방식 갈비뼈의 측면을 자른다.
      3. 다음 늑간 근육을 잘라 적출 조각을 제거, 인접 리브에 대해이 절차를 반복합니다. 이 과정 중, 폐 표면 및 흉곽 사이의 기계적 상호 작용을 최소화하는 방법으로 폐의 압력을 유지한다. 적절하게 인공 호흡기에 영감 압력을 조절하여이 작업을 수행합니다.
    4. 창 삽입 :
      1. 인 커버 글라스로 구성, 사용자 정의 만든 폐 창을 삽입플렉시 소켓 (그림 1B)에 연결합니다. 아교 접착 또는 진공 그리스의 매우 작은 양을 적용하여 소켓 첨부 창. 전이 표면이 확대 윈도우의 중심에 위치하도록하는 방식으로 윈도우를 삽입한다. 필요한 경우, 각각의면에 구멍을 약간 크게함으로써 윈도우의 중심에 미세 전이를 가지고 삽입 구멍을 조정한다.
        참고 : 흉막 표면에 전이성 질환은 균열을 따라 주로 나타나는 폐 표면의 다른 핑크 - 투 - 연어 색 건강한 부분 내에서 명확하게 인식 할 수있는 흰색 점 또는 지역으로 식별 할 수 있습니다. 미세 전이가 흉막 외부의 다른 영역에서 발생할 수 있지만, 조사 세포주 거의 항상 전이성 질환, 방사선 학적 검출 할 수있게되면, 천공 영역에 미세 전이를 표면화 표시.
      2. 천공 소켓 내로 삽입하고, (L)의 내장 흉막과 직접 접촉을 생성 한 후웅은 4.0 모노 필라멘트 봉합사 (도 1C)를 사용하여, 주변 늑간 근육 창틀의 가장자리를 봉합. 탈출과 도장을 만들 잔여 공기를 돕기 위해 인공 호흡기에 영감 압력의 약간의 증가를 사용합니다.
        주 : 쥐의 호흡률 그것은 70 ~ 90 BPM 사이의 호흡 속도를 조정하기를 권장 등 마취, 흥분하거나 불안 상태, 영감 공기의 산소 농도 (FIO 2)의 상태에 따라 크게 달라질 수있다. 영감 압력은주의 조정해야하지가 약보다 이상으로 설정 될 수있다. 8cm는 H 2 O (0.6 mmHg로), 폐 표면의 손상을 방지한다.
    5. 형광 현미경, 자동 온도 조절 (전기) 난방 담요에 위치하는 강판에 Z 방향의 운동 (그림 1D)를 제거하기 위해 설계된 맞춤 설계된 제한 수단에 동물을 배치합니다. 동물의 몸을 제어직장 서미스터를 사용하여 온도. 동물의 제한 수단의 나사를 조정하고 인공 호흡기에 영감 압력은 측면 운동의 최적 제어를 달성하기 위해.
      참고 : 양자, dorso - 복부 및 cranio-꼬리 : 포유 동물에서 자연 호흡은 폐의 움직임과 가슴 확장의 세 가지 방향을 포함한다. 최대한 자연스러운 호흡 운동을 유지하기 위해, 필요한 정도까지 Z 방향 압축을 최소화하는 것이 중요하다. Z 차원 구속 혈류 및 다른 매개 변수에 영향을 미칠 수있는 아티팩트를 도입 할 가능성을 가지고 있기 때문에, 동일한 동물에 반복 된 일련의 측정 동안 일정 상태를 유지하는 것이 바람직하다.

4. 이미징 및 측정 미세 혈류의

  1. 심장 구멍을 통해 적혈구를 수집하고 전술 한 바와 같이, DII (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3- = 3 = 테트라 메틸 indocarbocyanine 과염소산 염)로 레이블 10.
  2. 윈도우 챔버 수술 완료되기 전에 유리 창에 제 1 패스 접착 효과를 피하기 위해, 쥐의 꼬리 정맥에 표시된 적혈구의 300 μl를 주입한다. 정맥 내로 공기의 도입이 더 주입을 억제하므로, 주사기 또는 카테터 내의 공기 방울을 제거한다.
  3. 이미지 혈액의 온도를 냉각 -40 ° C 칩에 현미경 CCD 카메라와 흐름, 약 100 배 전체 해상도 (10 배 현미경 목적으로 즉, 10 배 전 카메라의 눈). 표준 로다 민 / TRITC 필터 세트 (여기 450-490 nm의 방출> 515 nm의)를 사용합니다. 결과 이미지 시퀀스의 실제 프레임 속도 및 픽셀 해상도를 기록한다. 스택 당 기록 최소 200 (이상적으로 약 300) 이미지는 유속의 성공적인 분석을 보장합니다.
  4. 식염수 IP의 약 1 ml의 모든 시간을 주입하여 동물의 유체 손실을 보충.
    참고 : 개입을 포함 실험 설정, 예를 들어,암전 폐 혈류 속도를 수정 약물은 폐 전이성 암 혈류 속도의 반복 측정이 필요하다. 이러한 확장 실험을 위해, 충분한 유체와 동물을 보충하는 것이 중요하다.
  5. 꼬리 정맥에 3N의 KCl 3 ml를 주입하여 동물을 안락사
  6. 모든 혈액 흐름에 대한 유속 그레이 스케일과 컬러 인코딩지도 (10, 11)를 추적 만듭니다 게시, 공개적으로 사용할 수 matlab에 기반 컴퓨터 알고리즘을 사용하여 이미지 스택을 평가합니다. 그 후, 혈액 세포의 어떤 움직임을 나타 내기 활성 혈관을 즉 없습니다 값을 임계 화 한 후, 같은 이미지 J 같은 상용 또는 공개 된 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 생성 된 그레이 스케일 이미지를 평가합니다.

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결과

고형 종양의 혈관은 굴곡의 큰도, 높은 intervascular 거리 (13)을 보여주는 일반 혈액 공급이 크게 다르지 알려져있다. 정상적인 폐 미세 (도 2A, 상부 패널)에 비해 따라서, 실험적인 폐 및 유방암 전이 육종 혈류 트랙 부정형 intervascular 큰 갭 (도 2A, 저급 두 개의 패널)을 갖는다. 이전의 연구에서는 폐 윈도우 방식의 능력은 정상 폐에서 열 혈류 속도의 변화를 자동으로 측정을 수행하는 것으로 입증되었다. 폐 윈도우 방법은 또한 폐 전이 혈류 속도의 증가를 측정 할 수 있는지 여부를 조사하기 위하여, 교감 신경 흥분제 에페드린 최근 건강한 폐의 미세 혈관 순환을 증가시키는 것으로 밝혀졌다 텔린 차단제 센탄의 약물 조합,(다른 곳에서 검토중인 데이터)를 여기에 적용되었다. 이 연구에서, 상기 방법의 능력 에페드린의 조합으로 투여에 의한 마우스 육종의 폐전 혈류 속도의 증가 (20 ㎎ / kg) 및...

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토론

생체 내에 모델 현미경 전산 혈액 흐름 분석을 사용하여 미세 순환 혈류 및 쥐의 폐 전이에서 다른 동적 공정에서 화상 변경 가능하다 제시된다. 다른 방법은 설치류의 개방 ribcages에 노출 폐에 현미경을 수행하기 위해 존재하지만,이 모델은 폐쇄 가슴 속에서 가슴 벽의 구멍을 통해 이미지 폐 전이에 처음이다. 이 방법을 사용하여, 가능성은 폐 전이의 미세 순환 혈류에 의한 약리학 적 변화를 측정하기 위해 도시된다.

두 가지 기본적인 방법은 화상에 폐 표면에 직접 접촉하여, 자발적인 혈류 관류 살아있는 설치류 폐 존재 : 오픈 가슴 모델 인해 호흡 및 심박동에 폐의 일정한 운동의 문제를 해소 흡입 윈도우를 적용​​하여 폐의 표면에, 심폐 복합체의 나머지시키면서하는 것은 특급과와 오픈 가슴 공동 7, 14 내 계약. 이 방법은 우수한 실험에 대한 액세스를 제공하는 동안 그대로 폐 (8)의 조건과 비교했을 때, 열린 가슴 조건 및 흡입 창 ...

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공개 사항

저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

Timothy McMahon 박사와 Siqing Shan 박사의 과학적 조언에 감사드립니다. 발표자들은 David Kirsch 박사와 Patricia Steeg 박사에게 각각 형광 표지된 쥐 육종과 전이성 MDAMB-231 세포를 아낌없이 선물해 준 것에 대해 감사를 표합니다. 이 연구는 미국 국방고등연구계획국(DARPA)의 프라임 어워드 번호 N66001-10-C-2134와 듀크 대학 메디컬 센터의 방사선 종양학과에서 부분적으로 자금을 지원받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
음선상 누드 쥐Charles RiverStrain 코드 316여성 10주 된 음선상 누드 쥐
micro-CT/micro-Irradiator 정밀 X-ray Inc.Xrad 225CxMicroCT를 사용하여 전이
DiI (1,1 = -dioctadecyl-3,3,3 =, 3 = -tetramethyl-indocarbocyanine perchlorate)Sigma Aldrich468495-100MG100 ul 포장 적혈구와 200 proof 에탄올, 2 ml의 5 % 포도당 용액 2 ml를 물에 넣고 식염수 설치류 인공 호흡기로 최대 10 ml 최종 부피를 채웁니다
장치는 기흉 적용 후 양의 폐압을 유지하는 데 중요합니다
: Zeiss Axioskop 형광 현미경, 정립생체 내 이미징을위한Zeiss Axioskop
Andor CCD 카메라혈류의 실시간 이미징을위한AndoriXonEM 885
맥박 산소 측정기StarrLife, MouseOx,맥박 산소 측정기
형광 현미경ZeissAxioskop형광 현미경
.형, 현미경, , CCD 카메라, , ,

참고문헌

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