후각 수용체 활성화 패턴 악취 ID를 인코딩하지만, 포유 동물의 후각 수용체 리간드 취제를 식별 발행 데이터의 부족은 악취 코딩의 광범위한 정보 모델의 개발을 방해한다. 이 프로토콜은 후각 수용체 리간드 및 수용체 활성화의 정량 높은 처리량의 식별을 용이하게하는 방법을 설명한다.
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이 논문에서
요약
초록
취기 약 1,000 쥐 400 인간의 수용체의 가족이 냄새 물질의 수천을 인식 할 수 있도록, 후각 수용체 활성화의 독특하고 중복 패턴을 만들 수 있습니다. 악취 물질 리간드는 인간의 수용체 1-11 미만 6 %에 발표되었다. 데이터의 부족은 일부 기능 이종 시스템에서이 수용체를 발현하는 어려움 때문이다. 여기서, 우리는 루시퍼 라제 리포터 분석을 이용하여 후각 수용체 활성화의 높은 처리량 평가 하였다 Hana3A 세포 후각 수용체 패밀리의 대부분을 표현하기위한 방법을 설명한다. 이 분석은 후각 수용체의 패널에 대하여 취기 (1)의 화면 패널에 사용될 수있다; (2) 용량 반응 곡선을 통해 취제 / 수용체 상호 작용을 확인; (3) 수용체 변이체 구비 수용체 활성화 수준을 비교한다. 우리의 샘플 데이터에서 328 후각 수용체 (26)의 냄새 물질에 상영되었다. 다양한 응답 점수 후각 / 수용체 쌍 SELEC했다테드 및 용량 반응 시험. 이 데이터는 화면이, 악취 물질에 대한 선의의 진실 반응이, 즉 수용체를 용량 반응 실험을 통과 할 후각 / 수용체 쌍에 대해 풍부하게 할 수있는 효과적인 방법임을 나타냅니다. 따라서, 이러한 높은 처리량 루시페라아제 분석법은 포유 동물의 후각 시스템 악취 코딩 모델 향해 후각 수용체-필수적인 단계를 특성화하는 효과적인 방법이다.
서론
포유 동물의 후각 시스템은 탐지 및 취기 수천 차별을 허용 악취 자극의 광대 한 수에 응답 할 수있는 능력을 갖는다. 후각 (논리합)는 후각 상피 (12)에서 후각 감각 뉴런에 의해 표현 분자 센서이다. 포유 동물의 냄새를 인식 취기에 의한 관찰 보고서의 차등 활성화를 통해 발생하고 또는 유전자 가족은 대략 1,000 쥐 400 인간의 수용체 12-16으로 광범위하다. 후각 신경 세포 및 이종 세포에서 관찰 보고서의 이전 기능 분석은 다른 냄새 물질은 고유 한 인식하는 것으로 나타났습니다하지만, 관찰 보고서 10,17-20의 앙상블을 겹쳐있다. 관찰 보고서에 리간드를 매칭 후각 코드와 후각의 실행 가능한 모델을 구축하기위한 핵심을 이해하는 것이 중요합니다. 인해 취기 및 논리합 모두의 다수뿐만 아니라 이종 시스템에서 논리합을 표현하는 어려움이 데이터는 F에서 큰폭 결석왔다ield; 참으로, 인간의 관찰 보고서 미만 6 % 게시 된 리간드 1-11있다. 이 프로토콜은 취제 / OR 상호 작용을 특성화하는 루시페라아제 분석의 사용을 설명한다. 이 분석은 논리합의 높은 처리량 특성화 취제 / OR 상호 작용을 이해뿐만 아니라 악취 코딩 모델을 개발에 필수적인 작업을 가능하게한다.
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프로토콜
Hana3A 세포의 1. 문화
- 10 % (v / v) FBS가 최소 필수 배지 (MEM)를 보완하여 M10 미디어를 준비합니다.
- 문화 유지
- M10 미디어의 세포를 유지한다. 참고 : RTP1L, RTP2, REEP1, 및 G의 발현 벡터는 Hana3A 세포에 퓨로 마이신 내성을 부여 αolf하지만,이 항생제와 세포를 유지하는 것이 상당히 분석 결과에 영향을주지 않습니다.
- 1시 8분 10 CM 요리 2-3 일마다의 비율로 서브 컬쳐.
- 5 % CO 2와 37 ° C에서 알을 품다.
형질 2. 도금 세포
- Hana3A 세포의 100 % 합류 10cm 접시에서 대기음 매체.
- 10 ㎖의 PBS를 추가 접시를 소용돌이, 그리고 PBS를 흡입하여 세포를 씻으십시오.
- 0.05 % 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 3 ㎖를 추가하고 세포가 (약 1 분) 해리까지 기다립니다.
- 5 ㎖ M10를 추가하여 트립신을 비활성화하고 약 10 배 &를 triturating에 의해 세포 대단히 짧은 시간을 휴식# 160; 10....
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결과
기본 화면이 100 μM의 농도에서 26 냄새에 328 관찰 보고서를 테스트했다. 이 냄새의 농도를 효과적으로 알려진 리간드 (10)와 관찰 보고서의 큰 비율을 활성화하기 위해 입증되었습니다. 먼저 정규화 루시퍼 라제 활성은 레 닐라 루시퍼 라제 판독함으로써 반딧불 루시페라아제 판독 나누어 계산 하였다. 다음으로,베이스 라인 값은 각 웰 (그림 1)에 대한 표준화 된 루시 페라 제 수치의 냄새 컨트롤의 정규화 루시 페라 제 수치를 차감하여 계산 하였다. 용량 반응 곡선은 48 악취 물질에 대해 수행 / 또는 쌍을 무작위로베이스 라인 값의 범위에 걸쳐 분포하고, 그림 1의 색 막대로 표시된. 관찰 보고서가 1 ㎜에 1 nm의에 걸쳐 악취 물질의 7 농도로 처리하고, 결과 응답이 맞는지했다 비선형 회귀를 이용하여 S 자형 곡선. 이 세 가지 기준을 충족하는 경우 악취 물질 / OR은 작용제 간주되었다 : (1) 표준 오차의logEC <.......
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토론
악취 물질 ID는 후각 수용체 활성화 패턴에 의해 인코딩되어 있지만 수용체가 활성화되고 어느 정도에하는 등의 수용체 활성화 패턴은, 인간의 후각 수용체 1-11 미만 6 % 알려져있다. 후각 수용체를 특성화하기위한 노력이 후각 수용체 가족 17,23,24,33,34의 서브 세트 만에 자신의 노동 집약적 인 방법이나 적용에 의해 제한되었다. Hana3A 이종 발현 시스템은 시험 후각 수용체의 대부분의 강력한 발현을 지원하고 후각 수용체 활성화 19,26,27을 모니터링하는 cAMP에 응답하여 루시퍼 라제 리포터 시스템과 함께 사용될 수있다. 96 - 웰 포맷이 분석의 성능은 상호 작용을 확인하기 위하여 취제 / 후각 수용체 쌍 및 투여 량 - 반응 곡선에 대한 가능성 후보를 결정하고, 수용체 활성화 수준 AF 얼마나 평가하는 스크린을 포함하여 높은 처리량 실험 디자인의 수를 지원인트라 및 인터 - 특정 변형에 의해 인해 영향받은. 화면에 높은 활성 값으로 악취 물질 / .......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
이 작품은 R01 DC013339, R03 DC011373, 루스 L. 키르 국가 연구 서비스 상 T32 DC000014에 의해 지원되었다. 작품의 일부는 NIH-NIDCD 코어 부여 P30의 DC011735 자금에 의해 부분적으로 지원되는 모넬 화학 감각 수용체 신호 코어를 사용하여 수행 하였다. 저자는 데이터 수집에 대한 도움 C. Sezille 감사합니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Hana3A 세포 | 요청 | ||
| RTP1S-pCI | 요청 | ||
| M3-R-pCI | 요청 | ||
| pCRE-luc | 애질런트 | 219076 | LUC |
| pSV40-RL | Promega | E2231 | RL |
| Minimum 필수 매체, Eagle | Sigma Aldrich | M4655 | MEM |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | FBS |
| PBS (Ca2+ 및 Mg2+) | Cellgro | 21-040-CV | a href="http://cellgro.com/products/balanced-salt-solutions/phosphate-buffered-saline/phosphate-buffered-saline-1x-2.html">PBS |
| Trypsin (0.05% Trypsin EDTA | )Life Technologies | 25300 | 트립신 |
| CD293 | 라이프 테크놀로지 | 11913-019 | CD293 |
| 96-well PDL white/clear plate | BD BioCoat | 356693 | plates |
| Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Lipofectamine |
| 반딧불이 루시페라제 기질, 반딧불이 루시페라제 담금질제/Renilla 루시페라제 기질: Dual-Glo Assay | Promega | E2980 | 듀얼 글로 |
| 시너지 S2 | BioTek | SLAD | a href="http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy2_multimode_microplate_reader.html">BioTek S2 |
| 마이크로플레이트 리더 소프트웨어: Gen5 데이터 분석 소프트웨어 | BioTek | Gen5 | Gen5 |
| BIOSTACK | BioTek | BIOSTACK2WR | BioStack |
| Multiflo | BioTek | MFP | MultiFlo |
| 300 μ l GripTips | Integra | 4433 | GripTips |
| >12.5 μ l GripTips | Integra | 4414 | GripTips |
| 300 μ l GripTips ViaFlo96 | Integra | 6433 | XYZ 팁 |
| 12.5 μ l GripTips 384 XYZ | Integra | 6403 | XYZ 팁 |
| 384ViaFlo | Integra | 6030 | 384ViaFlo |
| TE 버퍼 | Macherey Nagel | 740797.1 | |
| DMSO | 시그마 알드리치 | D2650-100ML | DMSO |
| Forskolin | Enzo Life Sciences | BML-CN100-0010 | FOR |
참고문헌
- Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (199....
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