이 원고는 행동 패러다임에 따라 설치류의 특정 뇌핵에서 유도된 전사 프로그램의 분석을 위해 포괄적인 프로파일링을 적용하는 프로토콜을 설명합니다. 본 명세서에서, 이 접근법은 미세유체 qPCR 어레이를 활용하여 급성 코카인 노출 후 마우스의 측좌핵(NAc)에서 유도된 유전자를 프로파일링하는 맥락에서 설명됩니다.
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이 논문에서
요약
초록
뇌와 장기 기억의 통합 경험의 인코딩은 유전자 전사에 따라 달라집니다. 인코딩 환경에서 특정 유전자의 기능을 확인하는 것은 분자 신경의 주요 목적 중 하나이다. 또한, 고유의 동작으로 정의 유전자의 기능적 연관 신경 정신 질환의 기초를 이해하는 의미를 갖는다. 강력한 전사 프로그램의 유도는 다양한 행동 조작을 다음 쥐의 뇌에서 관찰되었다. 어떤 유전 요소가 다른 행동 다음 조작과 다른 뇌 핵에서 반복되는 사용되는 반면, 전사 프로그램은 전체적으로 자극 유도하고 그들이 1,2 연구되는 구조에 고유하다.
이 책에서, 프로토콜은 행동 조작에 대한 응답으로 쥐의 뇌 핵에서 강력하고 포괄적 인 전사 프로파일에 대해 설명한다.프로토콜은 급성 코카인 경험을 다음 중격 의지 핵에서 유전자 발현의 역학 분석의 맥락에서 설명된다. 생체 내 환경에서 정의 된 이후, 타겟 신경 조직은 해부; RNA를 정제 한 후, 다수의 표적 유전자의 광범위한 분석을 qPCR에 전사와 미세 유체 어레이의 이용을 역방향. 이 프로토콜은 이러한 작은 뇌 샘플 또는 하나의 세포로 종합적인 분석 출발 물질의 양을 제한하는 (50 ~ 500 유전자를 주소)에 맞도록한다.
프로토콜은 복수의 평행 한 샘플 분석 (예를 들어 단일 세포, 약학 다음 동적 분석, 바이러스 또는 행동 섭동)에 가장 유리하다. 그러나, 프로토콜은 또한 마이크로 어레이 또는 RNAseq하여 전체 게놈 연구에 앞서 샘플의 특성 및 품질 보증을 위해 제공뿐만 아니라, 전체 게놈 연구로부터 얻어진 데이터를 검증 할 수있다.
서론
뇌의 역동적 인 조직은인지 적, 행동 적 유연성을 제공합니다. 경험은 뇌 3 뉴런 간의 연결의 구조 및 강도의 변형을 통해 인코딩된다. 이러한 "경험에 의존하는 가소성"시냅스 구조와 강도 (4)의 수정을 위해 필요한 단백질을 제공하는 유전자 발현의 특정 패턴의 유도의 결과이다. 장기 기억의 형성을 매개 유전자 조절 네트워크의 식별은 전사 프로그램의 지배적 인 요소의 식별을위한 기억 형성뿐만 아니라, 타겟을 조절하는 근본적인 원리에 대한 통찰력을 제공 할 것으로 기대 분자 신경의 중앙 신조 신경 및 신경 정신 질환의 치료. 전사 프로그램 개발에 중요한 다른 캐릭터의 유전자를 인코딩하는 각각의 시간적 정의 파도 펼쳐시그널링 이벤트 1,2의 결과의 구현 ifferent 단계. 이 유도 된 유전자의 전체 보완을 식별하고, 그들의 유도의 역학에 따라 잠재적 기능에 대한 통찰력을 얻을 수 있도록, 자세한 시간 척도에 전사 역학을 해결하는 것이 중요하다.
마약 중독은 뇌 5,6의 신경 회로에 약물 남용의 긴 지속 효과에 의한 경험에 의존하는 가소성의 강력한 형태입니다. 약물에 초기, 급성 노출은 중독의 개발과 만성 사용으로의 전환으로 이어질 수 있습니다. 콘텍스트 정보는 중....
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프로토콜
참고 :이 프로토콜은 예루살렘의 히브리 대학의 동물 관리 지침을 따른다.
ACSF 솔루션의 1 준비
- 물 또는 염화나트륨의 적절한 첨가 ~ 300 mOsm / L에 삼투압을 가져, 표 1에 설명 된대로. ACSF 솔루션을 준비 DDH 2 O 1 L (> 18 MΩ 순도)를 확인합니다.
2 장비와 룸 설정
코카인 - 유도 된 운동 동작의 모니터링 장치는 내부 광원, 팬과 카메라 (또는 적외선 센서)와 유선 행동 챔버 (50 X 45cm)로 구성하고, 내측 스펙스 상자 (30 × 30 ㎝)에 장착 어떤 쥐들은 운동을 모니터하는 동안 자유롭게 이동할 수있다. 행동 테스트는 일반 명 / 암주기, 조명 전에 1 시간에 불이 들어오고 나서 1 시간 사이에 떨어져 수행해야합니다. 동물은 매일 같은 시간에 지속적으로 훈련되어야한다.
- 모니터링 및 마우스의 전위 동작을 기록하기위한 적절한 시스템에 카메라 또는 적외선 시스템을 연결합니다.
- 후각 큐 편향을 방지하기 위해 적절한 소독을 보장하기 위해, 마우스 기능 및 / 또는 냄새를 제거하는 시....
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결과
이 프로토콜을 적용하여 얻어진 결과의 결정적 품질은 다수의 파라미터에 의존한다. 적절한 실험 계획 실험 쥐에 최소한의 외란이 발생할 것 같은 테스트 경험 (이 예제는 코카인에 노출의)는 자신의 최근 역사에서 가장 지배적 인 경험이 될 것입니다, 따라서 강력하고 특정 전사 될 것 프로그램.도 1은 핵 쥐 해부 및 분석 중격 의지되는 코카인 경험 다음 시점을 정의하고, 코카인에 대한 행동 감작 실험 계획을 설명한다. 다음 중요한 점은 분석을위한 적절한 조직 절제에 대해 정확한 경계를 정의하는 것이다. 2 관상 및 시상 섹션에서 중격 의지 핵의 경계를 설명도. NAC 조직의 얇은 여백 영역 탁에서 제외되어 바람직 절개는 수행되어야프로파일 링 갖추고 있습니다. 이것은 일관된 NAC 프로파일, 환원 변동과 주변 조직의 포함으로 인한 아티팩트에 대한 가능성을 보장한다.
작은 뇌 핵의 해부와 같이 .......
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토론
행동 패러다임 아래의 뇌 조직에서 유전자 발현의 성공적인 특성화에 따라 달라집니다 : 행동 패러다임 동안 마우스의 1) 취급에주의; 관심의 조직 2) 신속하고 정확한 해부; 3) RNA 안전 조치 RNA의 무결성을 보장하기 위해; 4)주의 프라이머 및 실험 레이아웃의 계획뿐만 아니라 qPCR에 분석을위한 준비 세부 사항에 대한 정밀도와 관심.
기재된 절차의 목적은 환경에 의해 유도 된 행동 전사 이벤트 동력학을 특성화하는 것이다; 따라서,주의 깊은 관심이 마우스에 의해 경험 행동 패러다임 실제로 연구자가 의도 한 환경을 나타낸다는 것을 보장하기 위해 필요하다. 예를 들어, 심지어 코카인으로 행동 감작 같은 간단한 패러다임에서, 마우스의 경험이 많은 교란 요인에 의해 영향을받을 수있다 : EX 이전 홈 케이지 마우스의 사전 경험periment; 실험 방에 전사하는 방법; 실험 실내에서 빛, 소리와 냄새 노출; 실험자에 의해 처리 경험; IP 주입으로 인한 통증 / 불편; 신규 .......
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공개 사항
우리는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 이스라엘 과학 재단 보조금 (ISF # 393/12), 이스라엘 연구 우수 센터 보조금 (I-CORE 1796/12), 독일-이스라엘 재단 보조금 (GIF # 2299-2291.1/2011) 및 마리 퀴리 경력 통합 보조금 (FP7-PEOPLE-2013-CIG #618201)의 지원을 받았습니다. 프로젝트의 초기 단계는 AC에 대한 AXA 박사후 연구원의 자금 지원을 받았습니다. 우리는 Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences에서 제공하는 관대한 창업 자금에 감사드립니다.
Citri 연구실 구성원의 비판적 읽기는 대단히 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Virusol | Oriek Medical | J29D | |
| Isoflurane, USP 100% | MINRAD INC | NDC 60307-110-25 | |
| RNeasy plus 범용 미니 키트 | QIAGEN | 73404 | |
| QIAshredder | QIAGEN | 79654 | |
| 고용량 cDNA 역전사 키트 | Invitrogen | AB-4368814 | |
| TE 버퍼 | Invitrogen | 1355656 | |
| Behavior Chamber (MDF; 50 x 45 cm) | 자체 조립 | ||
| 내부 방풍 상자 (30 x 30 cm) | 자체 조립 | ||
| 카메라 및 비디오 레코더 | Campden Inst. | CMD-80051 | |
| 미디어 레코더 소프트웨어 | Noldus | NDS-NMR3-00M | |
| 홍채 가위 | FST | FST-14062-09 | |
| Vibratome | Campden Inst. | 7000SMZ-2 | |
| 바이오분석기 | Agilent Technologies | The Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1852048 | |
| Inverted microspoon spatula | Bochem Instrument GmbH | 3213 | |
| Biomark HD Reader | Fluidigm | BMHD-BMKHD | |
| 96.96 유전자 발현을 위한 동적 어레이 칩 | Fluidigm | BMK-M-96.96 |
참고문헌
- Amit, I., et al. A module of negative feedback regulators defines growth factor signaling. Nature genetics. 39, 503-512 (2007).
- Citri, A., Yarden, Y. EGF-ERBB signalling: towards the systems level. Nature reviews. Molecular cell biology. ....
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재인쇄 및 허가
