정적 점착 분석은 T 림프구 및 다른 세포 유형 간의 상호 작용을 모델링하는 데 사용될 수있는 강력한 도구이다. 상호 작용 플레이트 판독기가 직렬 세척 다음 부착 세포의 수를 정량화하는 데 사용되는 반면, 부착 분자로 코팅 된 웰에 표지 된 T 세포를 주입함으로써 생성된다.
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이 논문에서
요약
초록
T 림프구의 접착 염증과 항원 제시 세포와 면역 시냅스의 형성 사이트로 이동을 포함하여 다수의 T 세포 기능이 필요합니다. T 세포는 인테그린, 파트너 세포 나 세포 외 매트릭스에서 표적 분자와 상호 작용하는 막 횡단 단백질의 이종이 쌍으로 이루어지는 세포 접착 분자의 수준의 접착 성을 제어함으로써 조절 된 접착을 달성. 가장 눈에 띄는 T 세포 인테는 그 대상 세포 접착 분자 (ICAM) -1 소단위 αL 및 β2, 구성, 림프구 기능 관련 항원 (LFA) -1이다. 접착 성을 제어하는 T 세포의 능력은 각각의 인테그린의 궁합 상태를 조절하는 능력에서 유래. 인사이드 아웃 신호는 세포 내부 신호가 인테그린의 외부 도메인이 활성화 된 상태를 가정하는 원인이된다 과정에 대해 설명합니다. 이러한 복잡한 현상에 대한 우리의 지식의 대부분은 기계 론적 기반으로연구는 체외 모델 시스템의 단순화에서 수행. 여기에 설명 된 T 림프구 접착 분석은 T 세포가 정적 조건 하에서, 표적 분자에 부착 허용하고 점착성을 정량화하는 형광 플레이트 판독기를 이용하여 우수한 공구이다. 이 분석은 림프구에 작용 접착 자극 또는 억제 물질을 정의뿐만 아니라 관련된 시그널링 이벤트 특성화에 유용왔다. LFA-1에 여기에서 설명하지만 - ICAM-1 매개 접착; 이 분석은 용이하게 다른 접착제 상호 작용 (- 피브로넥틴 예 VLA-4)의 조사를 허용하도록 구성 될 수있다.
서론
T 림프구의 접착은 면역 반응 1에 근본적인 과정이다. 그것은 주사 항원 표적 세포 (2)와 림프절 내의 세포 (APC)를 제시하고, 면역 시냅스 형성 (IS)에 대한 내피 세포가 모세관 벽 장식과 T 세포 상호 작용을 위해 요구된다. 이러한 요구 사항은 기능과 역학적으로 구별된다. 림프구의 혈관 외 유출의 과정은 chemoattraction, 압연, 밀착성, 그리고 윤회로 구성되어 있습니다. 접착 성을 굳게하기 위해 롤링의 전환이 빠르게 G 단백질 결합 수용체의 신호에 응답하는 T 세포를 필요로합니다. 이 응답은 롤링 셀 3을 느리게하고 체포 인테 리간드 상호 작용을 얻을 수 있습니다. 인테 욕망의 즉각적인 변화는이 과정을 매개한다. 마이그레이션은 '프론트 엔드'에서 유착의 형성과 '후부'에서 유착의 파손 동적 상호 작용의 betweenTcells과 내피 세포가 필요합니다성형 및 4를 깨는 사이의 분 정도의 간격으로. IS는 inminutes를 형성하지만, 시간 6에 그대로 유지해야합니다.
흥미롭게도, 하나의 접착 분자는 인테그린 회원 림프구 기능 관련 항원 (LFA) - 1,이 모든 과정 5....
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프로토콜
1. 마이크로 웰스에게 코팅
참고 :이 단계의 목표는 T 세포 LFA-1에 대한 리간드 역할을하는 ICAM-1과 코트 폴리스티렌 표면에 있습니다.
- 다음과 같은 솔루션을 준비 :
- 재현 탁하여 코팅액을 제조 재조합 ICAM-1 칼슘 (1 mm의 풍부한 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 용액 (137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 10 mM의 나 2 HPO 4, 2 ㎜ KH 2 PO 4, 산도 7.4)와 염화칼슘), 마그네슘 (MgCl2를 2 nm의 2). ICAM-1의 최종 농도가 0.7 ㎎ / ㎖의 원액으로 만든 및 -80 ° C 냉동고에 보관 10 ㎍ / ㎖, 있는지 확인하십시오.
- 0.5 %의 인간 (또는 소) 혈청 알부민 (HSA / BSA), 2 mM의 MgCl2를, 1 mM의 염화칼슘과 PBS를 풍부하게하여 접착 솔루션을 준비합니다.
- PBS에 2 mM의 MgCl2를 1 mM의 염화칼슘을 추가하여 세척 솔루션을 준비합니다. 37 모든 솔루션을 따뜻하게사용....
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결과
아래의 항-CD3 항체의 다양한 농도로 자극 일차 T 세포를 사용하여 접착 분석의 예이다. 그것은 씻지 않은 세포의 형광 (즉, 전체로드)를 알고 있으면 유용합니다. 비자극 세포는 대조군 역할을하고 PMA 처리 된 세포는 항-CD3 항체에 대한 양성 대조군 있습니다. 코팅되지 않은 우물에서 도금 세포는 ICAM-1에 대한 제어 역할을합니다. 비자극 세포의 비율은 10 % ~ 5 % 사이에있는 동안 전형적인 실험에서 부착 PMA 처리 된 세포의 비율은 50 ~ 40 % 사이이다. 세포 접착 성을 정량화하는 다른 방법은 비자극 세포의 이상 각 조건에서 형광 강도의 계산 배 증가입니다.
표 1은 CFSE의 형광 강도가 일차 T 세포 용해 항 CD3 항체의 상이한 투여로 자극 및 ICAM-1 코팅 된 웰에 도금 표지 나타낸다.도 1은 대표적인 IM을 도시유사한 실험의 나이. 세포는 부정적인 말초 혈액에서 선.......
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토론
LFA-1의 활성화 및 T 세포 접착 (12)에 신호를 연구하는 몇 가지 분석이있다. 유동 세포 계측법은 절곡 또는 LFA-1 확장 하나에 선택적으로 결합 모노클로 날 항체를 사용하여 살아있는 세포에 LFA-1의 궁합 상태를 측정하는 데 사용된다. 이 방법의 한계 중 하나는 계정에 인테그린 '갈망을하지 않는다는 것입니다. 마이그레이션 분석은 유용한 도구입니다 있지만 특정 시점에서 순대 접착을하지 마이그레이션을 측정합니다. T 림프구의 이동 (예 : 피부 과민성 모델)을 연구하는 마우스 모델 그러나이 모델의 활용은 인성 및 실행하는 복잡한 생리 학적으로 적합하다. 여기에 설명 된 정적 접착 분석의 주요 장점은 간단한 방식으로 욕망과 친 화성을 모두 측정 할 수있는 기능입니다. 이 방법의 또 다른 장점은 신속하고 정확하게 세포의 작은 수를 검출하는 능력이다. 다른 방법과 비교하면 manip 훨씬 용이ulate 세포와 우리가 설명하는 하나의 기능 분석에서 다른 시약을 취급합니다. 또한, 부.......
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
Hirschil 신뢰, 마이클 Saperstein 의료 학자 연구 자금 및 NYU 화이트 헤드의 교제는이 작업을 지원했다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 플레이트 리더 | BioTek | Synergy H1 하이브리드 | |
| 멀티채널 피펫 | Fisher | 21-377-829 | |
| 광학 바닥이 있는 96웰 마이크로플레이트 | Corning Costar | 3603 | |
| 재조합 ICAM-1 | R& D Systems | ADP4-050 | |
| Anti-CD3 항체 | Ancell | 144-020 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| CFSE | Molecular Probes | C1157 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| DPBS containing calcium and magnesium | Gibco | ||
| 말초 림프구 | 예: 마우스 또는 인간 | ||
| 염화마그네슘 | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| 염화칼슘 | Sigma-Aldrich | 499609 | |
| Open Gen 5 소프트웨어 | BioTek | 버전 2.01 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| 15 및 50 ml 원심 분리기 튜브 | Fisher | 352099, 352070 | |
| 일회용 플라스틱 파스퇴르 피펫 | Fisher | 13-711-7M | |
| T-75 배양 플라스크 | Fisher | 50-754-1366 | |
| RosetteSep T 세포 enricment kit | StemCell Technologies | 15061 |
참고문헌
- Dustin, M. L., et al. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., et al. GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., et al....
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재인쇄 및 허가
