T 림프구에있는 인테그린 활성화의 연구에 대한 정적 접착 분석

Summary

정적 점착 분석은 T 림프구 및 다른 세포 유형 간의 상호 작용을 모델링하는 데 사용될 수있는 강력한 도구이다. 상호 작용 플레이트 판독기가 직렬 세척 다음 부착 세포의 수를 정량화하는 데 사용되는 반면, 부착 분자로 코팅 된 웰에 표지 된 T 세포를 주입함으로써 생성된다.

Abstract

T 림프구의 접착 염증과 항원 제시 세포와 면역 시냅스의 형성 사이트로 이동을 포함하여 다수의 T 세포 기능이 필요합니다. T 세포는 인테그린, 파트너 세포 나 세포 외 매트릭스에서 표적 분자와 상호 작용하는 막 횡단 단백질의 이종이 쌍으로 이루어지는 세포 접착 분자의 수준의 접착 성을 제어함으로써 조절 된 접착을 달성. 가장 눈에 띄는 T 세포 인테는 그 대상 세포 접착 분자 (ICAM) -1 소단위 αL 및 β2, 구성, 림프구 기능 관련 항원 (LFA) -1이다. 접착 성을 제어하는​​ T 세포의 능력은 각각의 인테그린의 궁합 상태를 조절하는 능력에서 유래. 인사이드 아웃 신호는 세포 내부 신호가 인테그린의 외부 도메인이 활성화 된 상태를 가정하는 원인이된다 과정에 대해 설명합니다. 이러한 복잡한 현상에 대한 우리의 지식의 대부분은 기계 론적 기반으로연구는 체외 모델 시스템의 단순화에서 수행. 여기에 설명 된 T 림프구 접착 분석은 T 세포가 정적 조건 하에서, 표적 분자에 부착 허용하고 점착성을 정량화하는 형광 플레이트 판독기를 이용하여 우수한 공구이다. 이 분석은 림프구에 작용 접착 자극 또는 억제 물질을 정의뿐만 아니라 관련된 시그널링 이벤트 특성화에 유용왔다. LFA-1에 여기에서 설명하지만 - ICAM-1 매개 접착; 이 분석은 용이하게 다른 접착제 상호 작용 (- 피브로넥틴 예 VLA-4)의 조사를 허용하도록 구성 될 수있다.

Introduction

T 림프구의 접착은 면역 반응 ^1에 근본적인 과정이다. 그것은 주사 항원 표적 세포 ^(2)와 림프절 내의 세포 (APC)를 제시하고, 면역 시냅스 형성 (IS)에 대한 내피 세포가 모세관 벽 장식과 T 세포 상호 작용을 위해 요구된다. 이러한 요구 사항은 기능과 역학적으로 구별된다. 림프구의 혈관 외 유출의 과정은 chemoattraction, 압연, 밀착성, 그리고 윤회로 구성되어 있습니다. 접착 성을 굳게하기 위해 롤링의 전환이 빠르게 G 단백질 결합 수용체의 신호에 응답하는 T 세포를 필요로합니다. 이 응답은 롤링 셀 ^3을 느리게하고 체포 인테 리간드 상호 작용을 얻을 수 있습니다. 인테 욕망의 즉각적인 변화는이 과정을 매개한다. 마이그레이션은 '프론트 엔드'에서 유착의 형성과 '후부'에서 유착의 파손 동적 상호 작용의 betweenTcells과 내피 세포가 필요합니다성형 및 ^4를 깨는 사이의 분 정도의 간격으로. IS는 inminutes를 형성하지만, 시간 ^6에 그대로 유지해야합니다.

흥미롭게도, 하나의 접착 분자는 인테그린 회원 림프구 기능 관련 항원 (LFA) - 1,이 모든 과정 ⁵ 필수적이다. LFA-1가 면역 글로불린 수퍼 패밀리의 다양한 구성원과의 상호 작용을 통해 부착을 매개한다. LFA-1로 가장 높은 선호도가 가장 광범위하게 연구 리간드는 세포 간 접착 분자 (ICAM) -1입니다. 비 활성화 순환 림프구 따라서 세포 표면에 LFA-1 및 ICAM-1-코팅 된 표면에 부착 할 수없는 낮은 선호도를 표현한다. LFA-1 궁합 변수와 같은 G 단백질 결합 수용체 활성화, 사이토킨 자극 및 T 세포 수용체 (TCR)에 의해 매개되는 신호와 같은 여러 시그널링 이벤트에 의해 조절된다. LFA-1은 세포 외 공간에 세포 내 활성을 전달의 결과 선호도가 높은 포름 티ICAM-1의 hrough의 상호 작용. 이 통로는 ^{7 신호} 내부 아웃이라고한다. 마찬가지로, 세포 외 공간에서 LFA-1을 통해 신호는 외부에서 신호라고합니다.

인사이드 - 아웃 및 신호 외부 -에 참여 폭포 신호 세포는 현재의 연구의 주요 초점이다. 작은 GTPase의 RAP1는 최근 그 TCR 내고 ^{8 신호} 사이토 카인의 공통 신호 내부 아웃의 핵심 구성 요소로 떠오르고있다. T 세포 접착이 지배적 부정적인 RAP1 ^9의 발현에 의해 차단되는 반면 인테 활성화에 RAP1의 중요한 역할은, RAP1의 과발현은 T 세포의 인테 의존 접착을 자극 발견에 의해 강조 표시됩니다. RAP1으로 인테 규제에 대한 우리의 이해의 이러한 발전은 체외 도구로 사용하여 수행되었다. 그 중 여기에 설명 된 정적 접착 분석이다.

이 방법의 전반적인 목표는 T를 연구하는 것입니다ICAM-1 코팅 표면에 세포 접착. 구체적으로는 객관적으로 측정하고 다른 조건에서 실시간으로 살아있는 세포에서의 카운터 리간드쪽으로 LFA-1 친화력을 정량화하는 데 사용됩니다. 이 기술은 T 세포와 상호 작용하는 세포 표면을 모방하는 ICAM-1로 코팅 폴리스티렌 웰을 사용한다. 많은 전술 정적 T 세포 부착 분석법 실험적 복잡한되었습니다. 주로 T 세포에 필요한 이러한 분석은 방사성 레이블 T 세포 접착 용 기판 등의 세포 외 기질 (extracellular matrix)을 만들 배양 소 각막 세포를 이용, 또는 T 세포 접착 ^(10)을 촉진하기 위해 확장 된 기간 동안 비 생리적 인 T 세포 자극을 요구한다. 많은 다른 분석 시스템 ^(11)에서 이용되는 것처럼, 계측법 및 현미경 흐르게 비해 접착 배양 다음 T 세포를 정량화하는 형광 측정의 사용은 정량보다 민감하고 정확한 방법이다. 또한, 단일 세포 microscop인테그린 지역화 IC 분석은 형광 측정과 동일한 방식으로 광범위한 인구 기반 분석을 허용하지 않는다. 활성화 상태 별 LFA-1 항체가 상업적으로 사용할 수 있지만,이 항체는 여기에 설명 된 방법에 상대적으로 낮은 감도를 제공합니다. 대체 기술을 통해 가장 큰 장점은 단순하고 동시에 여러 실험 조건을 검사 할 수있는 기능입니다. 특정 응용 프로그램에 대해이 방법을 고려할 때, 하나는 T 세포가 부정적으로 선택한 갓 격리 및 형광 마커로 표시되어야 함을 고려한다.

Protocol

1. 마이크로 웰스에게 코팅

참고 :이 단계의 목표는 T 세포 LFA-1에 대한 리간드 역할을하는 ICAM-1과 코트 폴리스티렌 표면에 있습니다.

1. 다음과 같은 솔루션을 준비 :
   1. 재현 탁하여 코팅액을 제조 재조합 ICAM-1 칼슘 (1 mm의 풍부한 인산염 완충 생리 식염수 (PBS) 용액 (137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 10 mM의 나 ₂ HPO _4, 2 ㎜ KH ₂ PO _4, 산도 7.4)와 _{염화칼슘),} 마그네슘 (MgCl2를 2 nm의 _2). ICAM-1의 최종 농도가 0.7 ㎎ / ㎖의 원액으로 만든 및 -80 ° C 냉동고에 보관 10 ㎍ / ㎖, 있는지 확인하십시오.
   2. 0.5 %의 인간 (또는 소) 혈청 알부민 (HSA / BSA), 2 mM의 _MgCl2를, 1 mM의 _{염화칼슘과} PBS를 풍부하게하여 접착 솔루션을 준비합니다.
   3. PBS에 2 mM의 _MgCl2를 1 mM의 _{염화칼슘을} 추가하여 세척 솔루션을 준비합니다. 37 모든 솔루션을 따뜻하게사용하기 전에 C를 °.
2. 세척 용액 50 μL와 24 우물을 씻으십시오. 이 씻지 않은 우물, 긍정적 인 (PMA 처리 된 세포), 마이너스 (코팅 우물) 컨트롤이 포함됩니다. 각 조건은 적어도 세 개의 우물 (세중)을 설정하십시오.
3. 각 웰에 코팅 용액 50 μl를 추가합니다. 코팅되지 않은 제어 우물에 추가하지 마십시오. 37 ° C의 배양기 안에서 한 시간 동안 배양한다.
4. 팁은 웰의 바닥을 터치 할 수 있도록하지 않고, 부드럽게 도포 액을 대기음. 세척 용액을 50 μL로 한 번 씻는다.
5. 접착 액의 50 μl를 추가하고 37 ° C의 배양기 내에서 한 시간 동안 마이크로 플레이트를 품어.
6. 대기음 부드럽게 50 μL 세척 용액을 한 번 씻어. 그러나 그것은 하룻밤 4 ℃에서 보관하는 것이 가능하고, 같은 날에 플레이트를 사용하고, 다음 날을 사용합니다.

혈액에서 2. T 세포 분리

1. 50 μL / ㎖ O에 인간의 T 세포 농축 칵테일을 추가F 전체 혈액 (항응고제 3 ㎖ (헤파린, EDTA 또는 구연산) 전체 혈액에 대한 예를 들어, 칵테일 150 μl를 추가합니다). 잘 섞는다.
2. 실온에서 20 분 배양한다.
3. 50 ㎖ 원심 분리 튜브에 3 ㎖의 혈액을 처리하고 실온에서 1 % D-글루코스와 충실 (칼슘 및 마그네슘)없이 PBS의 동일 부피를 추가한다. 파스퇴르 피펫으로 가볍게 섞는다.
4. 원심 분리 관에 15 ㎖의 피콜-Paque PLUS를 추가합니다.
5. 조심스럽게 림프구 분리 매체에 혈액 샘플을 희석 6 ㎖의 레이어.
6. 휴식 떨어져 20 ° C에서 20 분 400 XG에 원심 분리기.
7. 인터페이스에 방해받지 림프구 계층을 떠나 깨끗한 파스퇴르 피펫을 사용하여 상위 계층을 그립니다. 플라즈마의 상위 계층은 나중에 사용하기 위해 저장 될 수 있습니다. 깨끗한 파스퇴르 피펫 깨끗한 원심 분리기 튜브에 림프구 층을 전송 사용.
8. 림프구에 PBS의 3 권 (9 ㎖)에 추가합니다. 부드럽게하여 세포를 일시 DRA날개 그들과 파스​​퇴르 피펫 중.
9. 20 ℃에서 5 분 400 XG에 원심 분리기
10. 뜨는을 제거합니다. 림프구는 이제 응용 프로그램에 적합한 매체에서 일시 중단해야합니다. 20 ㎖의 T-75 플라스크에 배양 세포를 이동 10 % FBS, 1 % 페니실린 / 스트렙토 마이신을 함유하는 RPMI 1640 매체.

세포의 3. 준비

참고 : 세포가 형광 시약으로 표시되어야하는 전제 조건이다. 이 프로토콜에서 발현하는 세포가 수용 가능한 대안 카르복시 플루오 레세 인 숙신 에스테르 (CFSE), 그러나 녹색 형광 단백질 (GFP)을 사용합니다.

1. 혈구를 사용하여 2.4 × 10 ⁶ T 세포 (각 웰에 1 × 10 ^5)를 계산합니다.
2. 혈청 (혈청 기아) 부족 배양 배지에서 세포를 Resuspend. 37 ° C의 배양기에서 2 시간 동안 세포를 품어.
3. 5 분 (400 XG)에 대한 세포를 원심 분리기. 미디어를 대기음1 ml의 PBS에 재현 탁.
4. 1:1000 희석 (5 mm로 만들어 주)에 CFSE를 추가합니다. 빛으로부터 덮고 실온에서 13 분 동안 배양한다.
5. 37 ° C PBS 10 ㎖를 첨가하여 반응을 중지하고 5 분 400 XG에 스핀.
6. 예열 접착 용액 (50 μL 당 1 × 10 ⁵ 세포)의 1.2 ml의 세포 펠렛을 다시하면 일시 중지합니다.

셀의 4. 자극

주 : 접착을 개시하기 위해, 세포가 자극되어야한다. 다음 실험에서 세포를 항-CD3 항체를 사용하여 가교 결합 TCR을 통해 자극 그러나 수용성 SDF-1의 대안이 될 수있다. 실험의 목적에 따라 다양한 약리 시약은 세포 접착에 미치는 영향을 연구하기 위해 자극 전 또는 동안 첨가 될 수있다. 포르 미리 스테이트 아세테이트 (PMA)는 두 번째 메신저 디아 실 글리세롤 (DAG)와 구조적으로 유사하고, 따라서 여러 키나제를 활성화 포르 볼 에스테르입니다하류 TCR (주로 단백질 키나제 C)들; 여기로는 양성 대조군으로 사용된다.

1. 37 ° C로 마이크로 따뜻하게
2. 8 빈 1.5 ML 튜브 (각 튜브에 150 μL), 각 조건에 대해 하나의 튜브에 세포를 나눈다.
3. 그에 따라 세포 치료 :
   1. 긍정적 인 제어를 제공하기 위해 10 NG / ML에서 PMA와 함께 하나의 튜브를 자극한다. 자극에 대한 제어 ( "자극 없음"), 씻지 않은 컨트롤을로드 ( "아니오 세척"), 및 ICAM-1 코팅 제어 ( "코팅") 역할을하는, 처리되지 않은 세 개의 튜브를 유지합니다.
   2. 항-CD3 항체의 다양한 농도 (0.1, 1, 5, 10 ㎍ / ml)로 네 개의 튜브를 자극한다. 지연하지 않고 다음 단계로 진행합니다.
4. 또한 각 빈에 자극을 세포 믹스의 나누어지는 50 μL. 웰 당 세포의 마지막 수는 1 × 10 ^5이다.
5. 15 분 동안 37 ° C의 배양기에서 마이크로 플레이트를 놓습니다.
   참고 : 일부 T 세포 라인이 짧은 stimula을 필요로 기 시간. 이 시간 동안, 세포는 웰의 바닥에 정착되고 표적 리간드에 밀착.

5. 세탁 멀리 비 부착 세포

주 :이 단계의 목적은 리간드 - 코팅 표면과 단단히 접촉을 형성 할 수 없었던 세포를 제거하는 것이다. 같은 물리적 힘이 모든 우물에 적용되어 있는지 확인하기 위해이 단계를위한 멀티 채널 피펫을 사용합니다. 이는 부착 세포의 비율의 계산을 돕기 위해 씻지 표시된 대조군 웰을 유지하는 것이 중요하다.

1. 각 우물에 따뜻한 접착 용액 150 μl를 추가합니다. 우물에서 매체를 제거하기 전에 몇 초 동안 부드럽게 판을 흔들어. 끝으로 우물의 바닥을 만지​​지 마십시오.
2. 이 과정을 세 번 반복합니다. 버퍼를 안팎으로 피펫 팅 할 때 피펫의 방향을 변경합니다.

6. 자기편 세포의 비율을 결정

_content "> 주 :이 단계에서 형광 플레이트 판독기 내에서 각 웰의 형광 강도를 측정하기 위해 사용되는 강도가 부착 세포의 수와 직접적인 상관 관계에있다..

1. 플레이트 리더를 켭니다. 바탕 화면에 바로 가기 아이콘을 클릭하여 플레이트 리더 소프트웨어를 엽니 다.
   1. "작업"메뉴에서 새로운 프로토콜을 설정하는 "새"를 클릭합니다.
   2. "작업"메뉴에서 "읽기"옵션을 선택합니다. "형광 강도"를 클릭하고 "확인"탭을 누르십시오.
   3. 드롭 다운 메뉴에서 "여기 파장 485"과 "방출 파장 528"를 선택합니다. "확인"탭을 누르십시오.
   4. "눈"옵션 메뉴에서 "바닥"을 선택하고 "확인"탭을 누르십시오. 다시 "작업"메뉴로 이동하여 37 ° C로 온도를 설정하고 "확인"을 클릭합니다.
   5. 플레이트 리더로 ​​마이크로 플레이트를 삽입하고"실행"을 클릭합니다. 결과는 엑셀 스프레드 시트로 내보낼 수 있습니다.
2. 다음과 같은 공식을 사용하여 부착 세포의 비율을 계산 : 자기편 세포의 백분율 = (세척 우물에서 읽을 평균 형광 강도) / (씻지 않은 세포에서 읽을 평균 형광 강도) × 100 %.

Results

아래의 항-CD3 항체의 다양한 농도로 자극 일차 T 세포를 사용하여 접착 분석의 예이다. 그것은 씻지 않은 세포의 형광 (즉, 전체로드)를 알고 있으면 유용합니다. 비자극 세포는 대조군 역할을하고 PMA 처리 된 세포는 항-CD3 항체에 대한 양성 대조군 있습니다. 코팅되지 않은 우물에서 도금 세포는 ICAM-1에 대한 제어 역할을합니다. 비자극 세포의 비율은 10 % ~ 5 % 사이에있는 동안 전형적인 실험에서 부착 PMA 처리 된 세포의 비율은 50 ~ 40 % 사이이다. 세포 접착 성을 정량화하는 다른 방법은 비자극 세포의 이상 각 조건에서 형광 강도의 계산 배 증가입니다.

표 1은 CFSE의 형광 강도가 일차 T 세포 용해 항 CD3 항체의 상이한 투여로 자극 및 ICAM-1 코팅 된 웰에 도금 표지 나타낸다.도 1은 대표적인 IM을 도시유사한 실험의 나이. 세포는 부정적인 말초 혈액에서 선...

Discussion

LFA-1의 활성화 및 T 세포 접착 ^(12)에 신호를 연구하는 몇 가지 분석이있다. 유동 세포 계측법은 절곡 또는 LFA-1 확장 하나에 선택적으로 결합 모노클로 날 항체를 사용하여 살아있는 세포에 LFA-1의 궁합 상태를 측정하는 데 사용된다. 이 방법의 한계 중 하나는 계정에 인테그린 '갈망을하지 않는다는 것입니다. 마이그레이션 분석은 유용한 도구입니다 있지만 특정 시점에서 순대 접착을하지 마이그레이션을 측정합니다. T 림프구의 이동 (예 : 피부 과민성 모델)을 연구하는 마우스 모델 그러나이 모델의 활용은 인성 및 실행하는 복잡한 생리 학적으로 적합하다. 여기에 설명 된 정적 접착 분석의 주요 장점은 간단한 방식으로 욕망과 친 화성을 모두 측정 할 수있는 기능입니다. 이 방법의 또 다른 장점은 신속하고 정확하게 세포의 작은 수를 검출하는 능력이다. 다른 방법과 비교하면 manip 훨씬 용이ulate 세포와 우리가 설명하는 하나의 기능 분석에서 다른 시약을 취급합니다. 또한, 부...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
플레이트 리더	BioTek	Synergy H1 하이브리드
멀티채널 피펫	Fisher	21-377-829
광학 바닥이 있는 96웰 마이크로플레이트	Corning Costar	3603
재조합 ICAM-1	R& D Systems	ADP4-050
Anti-CD3 항체	Ancell	144-020
PMA	Sigma-Aldrich	79346
BSA	Sigma-Aldrich	A2058
CFSE	Molecular Probes	C1157
RPMI	Gibco	11875-093
DPBS containing calcium and magnesium	Gibco
말초 림프구	예: 마우스 또는 인간
염화마그네슘	Sigma-Aldrich	M8266
염화칼슘	Sigma-Aldrich	499609
Open Gen 5 소프트웨어	BioTek	버전 2.01
Ficoll-Paque PLUS	GE Healthcare	71-7167-00
15 및 50 ml 원심 분리기 튜브	Fisher	352099, 352070
일회용 플라스틱 파스퇴르 피펫	Fisher	13-711-7M
T-75 배양 플라스크	Fisher	50-754-1366
RosetteSep T 세포 enricment kit	StemCell Technologies	15061