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방법 논문

MALDI-TOF 질량 분석기를 사용하여 혈액 배양액에서 그람 음성 박테리아의 빠른 확인

23.6K 조회수

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DOI:

10.3791/51663

⸱

2014년 5월 28일

 ,  ,  ,  ,  , 
1Centre for Infectious Diseases and Microbiology Laboratory Services, Institute of Clinical Pathology and Medical Research, Westmead Hospital, 2Centre for Research Excellence in Critical Infection, Westmead Millennium Institute, Westmead Hospital, 3Sydney Emerging Infectious Diseases Institute, University of Sydney, Westmead Hospital

이 논문에서

요약

단기 (MALDI-TOF) 질량 분석 (MS) 직접 혈액 배양액 행의 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 시간 애플리케이션은 박테리아의 식별을 촉진. 제출 방법은 직접 혈액 배양액에서 그람 음성 박테리아의 식별을위한 신속하고 신뢰할 수있는 방법입니다.

초록

임상 미생물학 연구소의 중요한 역할은 혈류 감염을 일으키는 박테리아의 신속한 식별을 제공하는 것이다. 전통적인 인식은 성숙 고체 한천에 식민지 후 사용할 수있는 식별 신호 혈액 배양액의 하위 문화가 필요합니다. MALDI-TOF MS는 고체 매체에 식민지에 적용 임상 관련 세균의 대부분의 식별을위한 믿을 수있는 빠른 방법입니다. 이 박테리아의 종 식별을 가속화하고 임상 관리를 개선하기 위해 잠재력을 가지고 직접 혈액 배양액에 MALDI-TOF MS의 응용 프로그램이 매력적인 방법입니다. 그러나 극복해야 할 중요한 문제는 제거하지 않을 경우, MS 스펙트럼을 방해 부족하거나 낮은 차별 식별 점수가 발생할 수 있습니다, 혈액 배양 검체에 포함 된 간섭 수지, 단백질과 헤모글로빈의 사전 분석을 제거합니다. 또한 그것은 bacter을 집중하는 것이 필요하다아이오와는 충분한 품질의 스펙트럼을 개발할 수 있습니다. 제시된 방법은 농도, 정화, 및 신호 혈액 배양액에서 박테리아의 조기 발견을 허용 그람 음성 박테리아의 추출을 설명합니다.

서론

때문에 세균에 혈류 감염 (BSI)를 가진 환자는 6-48 % 1에 이르기까지 높은 병원 내 사망률을 계속합니다. 적절한 경험적 항생제의 납품은 생존을 촉진하고 심한 패혈증 환자의 하위 집합으로, 적절한 치료에 대한 각각의 시간 지연은 생존 2,3 감소하는 상관 관계. 따라서, 임상 실험의 주요 목적은 신속하게 탐지, 식별 및 임상 의사 결정을 통보하기 위해 혈액 배양에서 세균의 존재를 전달하는 것입니다. 그것은 미생물 연구소는 최근 그람 염색 4를보고하고시 항생제 치료에 가장 큰 영향을 미치는 것으로 입증되었습니다, 관찰 연구는 것을 보여 주었다 비행 질량 분석의 매트릭스 보조 레이저 탈착 / 이온화 시간 (MALDI-TOF MS) 혈액 배양액에서 직접 수행 그람 음성 박테리아 5에 의한 BSI의 3 분의 1 이상에 처방에 영향을 미친다.

MALDI-TOF MS의 상업 개발은 미생물 6,7의 식별을위한 효과적인 실험실 도구되었다. 이 기술은 지금은 잘 확립되어 고체 미디어 6,8에 고립 된 미생물의 신속하고 정확한 식별을위한 많은 실험실에 통합되었습니다. 혈액 배양하기 때문에 저렴한 비용으로 미생물의 이전 신분을 취득 할 수있는 잠재력을 모두 임상 및 실험실 관리자에게 미생물의 항소에 대해 "긍정적 인"신호를했다 (BC) 국물에 MALDI-TOF MS의 직접적인 응용 프로그램입니다.

까지 그람 음성 박테리아를 성공적으로 식별의 보고서를 식별 표준 표현형 문화 기반의 방법과 비교했을 때 혈액 배양액에 MALDI-TOF MS의 직접적인 응용 프로그램의 임상 적 유용성이 관찰 감도의 넓은 범위에 의해 제한되었습니다 47-98.9 % 9-11. 감도 편차 가능성BC 국물 구성, 초기 세균 농도, 시료 전처리 방법의 변화뿐만 아니라 연구의 인구 9에서 발생하는 그람 음성균의 배열에 관한 것이다. 이러한 다른 발행 프로토콜과 비교하여 여기에서 제시된 방법은 에탄올, 염화 암모늄 또는 추가 (비 행렬) 아세토 니트릴의 사용을 피한다. 따라서 세균 펠릿 전위 표현형 감수성 테스트 방법은 배양액에 이러한 유기체에 직접 적용 할 수 있도록 허용하는 (단백질 추출 시점까지) 실행 가능한 남아있을 것이다. 또한, 제시된 방법은 저렴한 안정적이고 시간 12 '손'최소한의 혈액 배양 그람 염색 결과의 25 분 내에서 사용할 수있는 박테리아 식별과 빠른 것으로 나타났다.

이 방법은 그람 B를 식별하는 양성 혈액 배양액에 직접 적용 포름산 추출을 이용하는 간단한 사내 스핀 용해 프로토콜MALDI-TOF MS 기술 acteria.

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프로토콜

"긍정적"으로 1. 혈액 문화 묽은 수프 깃발

  1. 지속적인 모니터링 배양 장에서 신호 혈액 배양 병을 제거하고 생물 안전 캐비닛에 넣습니다. 참고 : 병이 유해 미생물을 포함 할 수 있으며, 보편적 인 조치가 될 필요가있다. 때문에 샘플링 전염성 에어로졸의 위험, 모든 샘플링 절차는 바이오 안전성 클래스 II 층류 캐비닛에서 수행해야합니다.

2. 그램 얼룩은 준비가되어 있습니다

  1. 지역 기관 프로토콜에 따라 신호 혈액 배양액에서 그람 염색을 준비합니다. 참고 : 그람 음성균이 현미경에서 확인하는 경우 혈액 배양액은 다음의 방법에 따라 처리됩니다. 그람 양성균이 확인 될 때, 유전자 식별 및 저항 마커를 대상으로 다른 분자 방법은 (이 문서에 언급되지 않음) 국물 (13)에 적용된다.
혈청 분리 관에 신고 된 혈액 문화 국물의 전자 "> 3. 전송

  1. 조심스럽게 2 배를 반전시켜 혈액 배양 병을 섞는다.
  2. 생물 안전 캐비닛 내에서 안전 혈액 이송 장치에 10 ML의 주사기를 연결합니다.
  3. 혈액 배양 병에 피 전사 장치를 부착하고 주사기로 배양액 5 ㎖를 철회. 혈청 분리 관에 흡입 된 BC 국물을 전송합니다.

혈액 배양액 4. 집중

  1. 적혈구의 큰 볼륨을 제거 15 분 동안 1,250 XG에서 혈청 분리 튜브를 원심 분리기.
  2. 대기음 즉시 젤 / 액체 인터페이스 위의 버피 코트의 약 1 ㎖를 남겨주의하면서 멸균 전송 피펫을 사용하여 상층 액을 버린다. 주 : 호기성 병 겔 / 유체 인터페이스는 불투명 백색으로 나타나는 튜브의 바닥에 적혈구의 명확한 분리를 보여준다. 반면에, 언제젤 /​​ 유체 인터페이스로 인해 용해 적혈구의 구성 요소가 뜨는에 남은 것에 깊은 붉은 색으로 표시되는 용해성 혐기성 혈액 배양 국물에 적용.

5. 원심 분리 세척 단계를 반복

  1. 부드럽게 멸균 피펫 젤 인터페이스 위 버피 코트 유체의 마지막 1 ㎖를 혼합 한 후 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브로 전체 볼륨을 전송합니다. 30 초 동안 288 XG에 새로운 튜브를 원심 분리기.
  2. 새로운 1.5 ML의 microcentrifuge 튜브에 플라스틱 일회용 1 ㎖ 전송 피펫을 사용하여 상층 액을 전송하고 펠릿으로 튜브를 폐기하십시오. 참고 :주의는 펠릿의 전송을 방지하기 위해 촬영이 단계에서 중요하다. 이 상등액 색소 남아 펠릿 항상 명확하게 볼 수없는 등 혐기성 BC 병에서 처리되는 시료에 특히 중요하다.

잔여 세포의 6. 용해

  1. 원심 분리기 1 분 후 대기음 (및 폐기)에 대한 18,407 XG에 시료 펠렛을 방해하지 않고 가능한 한 작은 잔류 액을 남길 수있는 뾰족한 전송 피펫을 사용하여 상층 액.
  2. 아래로 피펫 팅에 의해 멸균 DNA 분해 효소 및 RNAse가없는 물 1 ㎖에 잔류 펠렛을 Resuspend. 참고 : 일부 작가가 아닌 실행 가능한 박테리아를 렌더링하는 펠렛을 재현 탁 멸균 물 대신 알코올 용액을 사용하는 방법을 설명했다.
  3. 1 분 동안 18,407 XG에서 재현 탁 솔루션을 원심 분리기.

세균 단백질의 7. 추출

  1. 기음과 다시 가능한 한 많은 액체가 제거되었는지 보장 좋은 팁 피펫으로 흡입을 사용하여 상층 액을 버린다.
  2. 10 ㎕의 포름산 (70 % V / V)의 펠렛을 재현 탁. 주 : 피부와 접촉하면 흡입하거나 경우 개미산이 몸에 영향을 줄 수 있습니다. 솔루션을 준비하거나 조작하는 경우는 R입니다직원이 개인 보호 장비뿐만 아니라 연기 캐비닛을 사용하는 것이 ecommended.
  3. 동질적인 재현 탁 솔루션을 보장하기 위해 피펫을 사용하여 잘 섞는다. 물리적으로 펠렛을 방해하기 위해 피펫 팁을 사용하여 더욱 균질 한 용액을 보장하기 위해 필요할 수있다.

MALDI-TOF의 8. 준비 표적 판

  1. 대상 지점 당 제조 된 현탁액을 2 μL 깨끗한 MALDI-TOF의 표적 판을 접종. 실패 읽고 가끔 문제를 극복하기 위해 각 샘플에 대한 3 대상 사이트를 준비합니다.
  2. MALDI-TOF 대상 플레​​이트가 건조하도록 허용합니다. 건조 속도는 플레이트에 걸쳐 공기 유동을 극대화하기 위해 흄 후드의 가장자리에 판을 배치함으로써 증가 될 수있다.
  3. 매트릭스 용액 1 μL (10 밀리그램 / 밀리리터 α-시아 노 -4 - 히드 록 시신 남산 (HCCA), 50 % 아세토 니트릴, 2.5 % 트리 플루오로 아세트산)으로 각각 건조 스폿 오버레이. 참고 :이 콘타에 와서 경우 ​​흡입하거나 경우 매트릭스 솔루션은 몸에 영향을 미칠 수피부 CT. 준비하거나 솔루션을 조작 할 때 그것은 직원이 개인 보호 장비뿐만 아니라 연기 캐비닛을 사용하는 것이 좋습니다.
  4. MALDI-TOF의 표적 판은 전술 한 바와 같이 연기 찬장의 가장자리에 건조하도록 허용합니다. 균일 한 준비가 접시에 목표 지점을 각각 채워 확인합니다.

질량 분석기에 9. 장소 MALDI-TOF 표적 판

  1. MALDI-TOF 질량 분석기에 MALDI-TOF 대상 플레​​이트를 삽입합니다. 판 스프링이 장착 된 플레이트와 같은 높이 앉아되어 있는지 확인합니다. 참고 : 모든 대상 지점이 건조 될 때까지 표적 판을 삽입하지 않습니다.
  2. 고무 씰이 필요한 진공 상태를 생성 할 수 있도록 보풀, 먼지와 머리카락 청소 해주십시오.
  3. MALDI-TOF 단계 뚜껑을 닫은 후 기기 전면의 "IN / OUT"버튼을 누릅니다. 뚜껑은 지금 잠그고 필요한 진공이 생성 될 수 있습니다.

10. MALDI-TOF MS Spectra 취득

  1. MALDI Biotyping 및 FlexControl 소프트웨어를 엽니 다.
  2. 타이핑 소프트웨어 내에서 "파일"이라는 제목의 드롭 다운 메뉴에서 "새 분류"를 선택합니다. 프로젝트의 이름을 누른 다음 "새"를 선택합니다. 타이핑 소프트웨어에서 설치를 완료하려면 "다음"을 선택합니다.
  3. 제어 소프트웨어 창에서 표적 판의 화면의 그래픽을 확인합니다. 마우스 왼쪽 버튼을 누른 상태에서 접종 장소 위로 마우스를 이동하여 사용중인 MALDI-TOF 목표 지점을 선택합니다.
  4. 선택된 대상 위치의 아무 곳이나 클릭 한 다음 드롭 다운 메뉴에서 "분석 물을 추가"를 선택하고 마우스 오른쪽 버튼을 사용합니다.
  5. 대상 지점의 각각에 대해 "ID"열 혈액 문화 식별 정보를 추가하고 "다음"완료되면 클릭합니다.
  6. 상업 "분류법"스펙트럼 데이터베이스를 선택하고 "다음"을 선택합니다. 참고 보ratories 참조 스펙트럼의 개수를 증가시키는 실내 또는 상용 데이터베이스 추가로 이용할 수있다.
  7. "마침"을 클릭하고 MALDI-TOF MS는 스펙트럼을 생성하기 시작합니다. 참고 : MALDI-TOF 설정 제조의 설정 (선형 긍정적 인 모드, 60 Hz에서 레이저 주파수, 20 kV의 가속 전압 16.7 kV의의 IS2 전압, 170 나노초 추출 지연 및 2,000-20,137 M / Z 범위)에 따라했다.
  8. MALDI 제어 소프트웨어가 피크를 생성하는 데 실패하는 경우에, 스펙트럼의 설명서 취득 (방법은 설명하지) 수행 될 수있다.

MALDI-TOF MS 점수의 11. 포스트 분석의 해석

  1. 스펙트럼 획득 및 분석이 완료되면, 각 대상에 대한 식별 목록을 확장 타이핑 소프트웨어를 종 식별 옆에있는 "+"버튼을 선택합니다.
  2. 상위 5가 비슷한 경우주의, 상위 5 식별을 공부한다. 점수가 동일한 대상의 ≥ 1.7과 불협화음의 상위 5 세대자리가 혼합 된 배양액의 가능성을 제기했다. 참고 : MALDI-TOF 기술이 혼합 된 배양액의 검출별로 감도를 가지고 있습니다. 배양액은 혼합 된 종을 포함한다 예를 들어, 높은 신뢰 점수 혼합 종 중 단 하나를 위해 식별 될 수있다.
  3. 점수 ≥ 2.0, 목표 지점에서 가장 높은 경기를 언급 할 때 종을보고합니다.
  4. 목표 지점에 가장 높은 점수가 1.7 ≥하지만 <2.0 만 세대를보고됩니다. 상위 5 식별의 추가 조건이 조화 된 경우, 다음 종 수준으로보고합니다.

MALDI-TOF 표적 판 12. 제거

  1. 모든 스펙트럼은 MALDI-TOF 시스템의 "IN / OUT"버튼을 눌러 완료되면.
  2. MALDI-TOF 표적 판 소켓을 열고 MALDI-TOF 대상 플레​​이트를 제거합니다.
  3. 재사용 가능한 MALDI-TOF 대상 플레​​이트, 알코올을 사용하여 깨끗한 모든 대상 지점을 사용하여 깨끗하고 건조되면 RT에 MALDI-TOF 판을 저장하는 경우.

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결과

생성 MALDI-TOF MS 스펙트럼은 스펙트럼의 통합 참조 데이터베이스에 비교된다. 로그 점수는 가능성 속 수준으로 식별 (그림 1)과 종의 가능성이 식별 ≥ 2.0 (그림에 필요한 점수 ≥ 1.7의 권고와 시험 분리 및 참조 데이터베이스 분리 사이의 일치의 신뢰에 대한 할당 2). 타이핑 소프트웨어에 의해 일치하는 점수 ≥ 1.7와 제 5 식별 (그림 1) 12 일치 종 수준으로보고. 3이 경우 대장균과 세라의 혼합 종의 혈액 배양액을 분석 한 결과를 보여줍니다 그림 마르세 센스. 상위 5 일치 스펙트럼 불일치 있습니다합니다. 그것은 이전에 혼합 장군은 혼합 된 배양액 (12)의 약 30 %가이 방법에 의해 식별 될 것으로 증명되었다. 그것은 혼합 국물이 가능하다는 것을 인...

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토론

후 원심 분리 단계가 분리 된 구성 요소를 리믹스하지 충분한주의 수행 혈액 배양액에 MALDI-TOF MS를 적용 할 때 그것은 중요합니다. 그것은 MALDI-TOF 스펙트럼을 간섭 스파이크를 생성 할 수있다 헤모글로빈 등 혈액 배양 성분 및 인간 세포 단백질을 제거하는 것이 특히 중요하다.

MS는 종 ≥ 2.0의 점수를 잘라 속 식별을위한 ≥ 1.7 추천 제조 있지만, 다른 보고서는 BC 국물 10,12,14-18에 적용 할 때 구현 될 수있다 낮은 로그 점수 (≥ 1.4 ≥ 1.6에이 범위)를 제안했습니다. 임상 미생물학 실험실에서 낮은 MS 식별 점수의 구현은 해당 지역의 규제 및 검증 절차에 따라 고려되어야한다.

때때로별로 스펙트럼은 두 일치하지 않는이 방법에 의해 생성 된, 또는 L로보고됩니다신뢰 점수 아야. 각각의 분리에 대해 중복 또는 세중 반점을 수행하면 하나의 자리가 실패 할 때 실험을 반...

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공개 사항

저자는 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
BACTEC 플러스 에어로빅/F 미디엄 Becton Dickinson; BD, 프랭클린 레이크, 뉴저지, 미국442192
BACTEC Lytic/10 Anaerobic/F MediumBecton Dickinson; BD, 프랭클린 레이크, 뉴저지, 미국442265
BACTEC Peds Plus MediumBecton Dickinson; BD, 프랭클린 레이크, 뉴저지, 미국442194
Vacutainer - 혈액 전달 장치Becton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA364880바늘 찔림 부상의 위험을 줄이는 일회용 샘플링 장치
Vacutainer SST 5.0 ml, Advance plusBecton Dickinson; BD, 프랭클린 레이크, 뉴저지, 미국367954세럼 분리 튜브
주사기 10mlBecton Dickinson; BD, Franklin Lakes, NJ, USA302143
이송 피펫Samco, USA222-20S
이송 피펫 (파인 팁)Samco, USA232-20S
마이크로 원심분리기 튜브(2.0 ml)Eppendorf, Hamburg, Germany0030.120.094
멸균수(DNAse 및 RNAse 없음)Life Technologies, Carlsbad, California, USA10977-015
포름산Sigma-Aldrich, St. Louis, Missouri, USAF0507
매트릭스 솔루션 Bruker Daltonics, 독일 브레멘28507410 mg/ml &알파;-시아노-4-하이드록시신남산, 50% 아세토니트릴, 2.5% 트리플루오로아세트산
Benchtop microflex LT MALDI-TOF MSBruker Daltonics, 독일BioTyper 3.1(Build 65) 및 FlexControl 3.3(Build 99) 소프트웨어 활용
브레멘

참고문헌

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  16. Martiny, D., Dediste, A., Vandenberg, O. Comparison of an in-house method and the commercial Sepsityper™ kit for bacterial identification directly from positive blood culture broths by matrix-assisted laser desorption-ionisation time-of-flight mass spectrometry. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 31 (9), 2269-2281 (2012).
  17. Moussaoui, W., et al. Matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry identifies 90% of bacteria directly from blood culture vials. Clin Microbiol Infect. 16 (11), 1631-1638 (2010).
  18. Novel,, et al. improved sample preparation for rapid, direct identification from positive blood cultures using matrix-assisted laser desorption/ionization time-of-flight (MALDI-TOF) mass spectrometry. J. Mol. Diagn. 13 (6), 701-706 (2011).
  19. Fothergill, A., Kasinathan, V., Hyman, J., Walsh, J., Drake, T., Wang, Y. F. Rapid Identification of Bacteria and Yeasts from Positive-Blood-Culture Bottles by Using a Lysis-Filtration Method and Matrix-Assisted Laser Desorption Ionization-Time of Flight Mass Spectrum Analysis with the SARAMIS Database. J. Clin. Microbiol. 51 (3), 805-809 (2013).

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