이 프로토콜은 컨포칼 회전 디스크 현미경을 사용하여 렌티바이러스 및 아데노바이러스 형질도입 후 1차 쥐 신생아 심근세포를 사용하여 살아있는 세포를 이미징하는 방법을 설명합니다. 이를 통해 살아있는 심근세포의 세포 과정을 자세히 관찰할 수 있습니다.
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방법 논문
차 쥐 신생아 심근 라이브 셀 이미징은 아데노 바이러스 다음과 렌티 바이러스 형질 도입은 공 초점 현미경 디스크를 회전시키는 사용
이 논문에서
요약
초록
그들은 쉽게 하나의 절차에 많은 수에서 고립 될 수 있기 때문에 기본 쥐 신생아 심근 세포는 체외 심장 혈관 연구의 기본에 유용합니다. 인해 현미경 기술의 발전으로는 세포에 대하여 최소한의 광독성 우려 실시간으로 세포 사건을 조사하는 목적으로 생균 이미지를 캡처하는 비교적 용이하다. 이 프로토콜은 세포의 특성을 조절하는 렌티 바이러스 및 아데노 바이러스 전달 다음 공 촛점 회전 디스크 현미경을 사용하여 기본 쥐 신생아 심근 세포 라이브 인터벌 영상을 촬영하는 방법에 대해 설명합니다. 바이러스의 2 종류의 애플리케이션이 쉽게 두 개의 다른 유전자에 대한 적절한 전달 속도 및 발현 수준을 달성 할 수있다. 잘 집중 생균 이미지는 오랜 기간 동안 안정을 유지 초점 현미경의 자동 초점 시스템을 사용하여 얻을 수있다. 이 방법을 적용, 외생 적 엔지니어의 기능일차 배양 된 세포에서 발현 에드 단백질은 분석 될 수있다. 또한,이 시스템은 siRNA를 사용을 통해뿐만 아니라 화학 조절제의 유전자의 기능을 검사하는 데 사용될 수있다.
서론
차 쥐 신생아 심근 긴 시험관 1에 심근 기능을 조사하는 데 사용되었다. 그들은 몇 가지 잘 설립 방법 2-4으로 쥐 새끼에서 분리하기 쉽다. 가장 일반적인 방법은 콜라게나 또는 이전의 세포 격리에 심장의 결합 조직을 소화 트립신을 사용합니다. 연구원은 또한 성인 설치류 5-8뿐만 아니라 신생아 마우스 9,10에서 심근 세포를 분리하는 방법을 개발했습니다.
이 프로토콜은 두 단계의 효소 분해 절차를 이용하는, 신생아 래트 새끼로부터 심근 세포를 분리하는 방법을 설명한다. 트립신은 처음 4 ° C에서 O / N을 사용하고, 37 ℃에서 다음 정제 된 콜라게나된다 4 ° C에서 트립신 O / N과 심장 조직의 배양은 따뜻한 효소 용액 2 연속 배양을 사용하는 방법에 비해 수확 세포에 필요한 단계를 줄일 수 있습니다. 또, 정제 된 CO를 이용하여llagenase 오히려 조 효소보다는, 로트 간 변동 따라서 향상된 재현성을 제공하고, 제거 할 수있다.
특정 단백질의 기능 연구는 종종 아데노 11-13 및 / 또는 14-16 렌티 바이....
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프로토콜
쥐 신생아 심근 1. 격리
- 둘 베코 변형 이글 배지 (DMEM) 및 배지 등의 소 태아 혈청 (FBS) 및 페니실린 / 스트렙토 마이신 (P / S)와 보충 최소 필수 배지 (MEM)를 사용합니다. 분리 후의 제 2 일 동안 섬유 아세포의 성장을 방지하기 위하여 중간에 브로 모데 옥시 우리 딘 (BrdU의)를 추가한다.
| 자료 매체 | FBS | BrdU의 (MM) | P / S (U / ㎖) | |
| 선택 | DMEM | 10 % | 0 | (20) |
| 첫 날 | DMEM | 10 % | 0.1 | 10 |
| 이튿날 | DMEM / MEM | 5 % | 0.1 | 10 |
| 또한 문화 | DMEM / MEM | 5 % | 0 | 10 |
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결과
기술, 렌티 바이러스 부호화 EGFP (강화 된 녹색 형광 단백질) 태그 Cx43 (connexin43에) 또는 세포에서 EGFP-태그 된 단백질을 표현하는 데 사용 된 돌연변이 Cx43 (32), 및 아데노 인코딩 FGFR1DN (섬유 아세포 성장 인자 수용체 1 우성 네거티브를 설명하기 위해 ) 세포 33-35에서 FGF 신호를 종료하는 데 사용되었다. 심근 세포의 분리는 다음과 같은 세 가지 일, 절연은 심근 세포에서 EGFP-태그 된 단백질을 표현하기 위해 렌티 바이러스로 형질 도입 하였다. 그런 렌티 바이러스 형질 도입 3 일 후에, 절연 심근 더욱 세포에서 FGF 신호를 제거하기 위해 아데노 인코딩 FGFR1DN 형질 도입 하였다. 형질 도입 된 외래 유전자를 표현하는 세포에 대한 충분한 시간을 허용 한 후, 회전 디스크 공 초점 현미경은 생균 이미지를 캡처하는 데 사용되었다. 획득 된 영상을 동영상 파일로 재생 및 이미지 분석 소프트웨어를 사용하여 분석된다. 자세한 표상에 대.......
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토론
신생아 쥐에서 분리 된 주요 심근 긴 체외에서 심근의 기능을 연구하는 데 사용되었습니다. 이 프로토콜은 처음 4 ° C에서 트립신 O / N로 소화 한 후 정제 된 콜라게나, 두 단계의 효소 소화 방법을 사용하여 쥐의 새끼에서 신생아 심근의 분리하는 방법을 설명합니다. 정제 된 콜라겐 분해 공정을 이용하는 하나의 장점은 효소의 동일 등급 모두 아이솔레이션을 위해 사용된다는 점이다. 따라서, 고립 셀의 품질과 양을 실험하는 실험에서 일치한다.
세포 배양의 형질 도입의 효율이 높은 관련 실험에 필요한 경우, 아데노 바이러스와 연관된 높은 형질 도입 효율을 고려할 때, 아데노 바이러스를 사용하는 것이 더 낫다. 높은 수준의 형질 도입이 필요하지 않은 경우, 렌티 바이러스 벡터가 사용될 수있다. 아데노 바이러스 또는 렌티 바이러스 벡터를 사용하여 어느 하나의 옵션을 갖는 것은 쉽게 적절한 transd를 실현할 수있다유전자의 다른 유형에 대한 uction과 표현 수준........
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
렌티바이러스 포장에 대한 조언을 해주신 Dr. Alengo Nyamay'antu와 Dr. Ilse Timmerman에게 감사드립니다. 이 연구는 미국심장협회(American Heart Association) 과학자 개발 보조금 10SDG4170137의 지원을 받습니다.
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재료
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| 3.5cm 유리 바닥 배양 접시 | MatTek | P35G-0.17-14-C | TIRF 또는 고해상도 이미지 |
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| 2% 젤라틴 | Sigma | G1393 | |
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참고문헌
- Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Experimental cell research. 53, 1-10 (1968).
- Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E.
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