조직 해리 차동 여과 이식 미토콘드리아의 신속한 분리 및 정제

요약

포유 동물 조직 생검에서 미토콘드리아의 신속한 분리를위한 방법을 설명한다. 쥐 간 또는 골격근 제제 상용 조직 dissociator 균질화하고, 미토콘드리아는 나일론 메쉬 필터를 통한 여과에 의해 미분을 분리 하였다. 대안적인 방법을 사용하여 100 분간 - 미토콘드리아 분리 시간은 60 비교 <30 분이다.

초록

차동 원심 분리 및 / 또는 피콜 구배 원심 분리를 사용하여 이전에 기술 된 미토콘드리아 분리 방법은 완료 60-100 분을 필요로한다. 우리는 상업적 조직 dissociator 및 차등 여과하여 포유류의 조직 검사에서 미토콘드리아의 신속한 분리를위한 방법을 설명한다. 이 프로토콜에서 수동 균질화는 조직 dissociator의 표준화 균질화 사이클로 대체됩니다. 이 균일하고 쉽게 수동 균질화 달성되지 않은 조직의 일관성 균질화 수 있습니다. 티슈 해리 다음, 균질 반복 원심 분리 단계를 제거 나일론 메쉬 필터를 통해 여과된다. 그 결과, 미토콘드리아 절연은 30 분 미만으로 수행 될 수있다. 이 분리 프로토콜은 0.18 ± 0.04 g (습 중량) 조직 샘플에서 약 2 × 10 ¹⁰ 실행 가능하고 호흡 능력 미토콘드리아를 얻을 수 있습니다.

서론

미토콘드리아는 적혈구를 제외한 체내 모든 세포에 존재하는 세포 및 중요한 대사 과정 ^1-4의 다수에 관여한다. 때문에 이러한 많은 기능의 미토콘드리아 손상이 해로운 영향 ^삼을 수 있습니다. 미토콘드리아 기능 부전 여러 미토콘드리아 분리 방법을 조사하기 위해서 설명되었다. 1940 ^5-8로 미토콘드리아 격리 날짜의 최초의 공표를 차지한다. 제 문서화 시도가 저속 ^5,8에서 염 용액에 원심 분리 박격포 간 조직을 분쇄하여 미토콘드리아 아이솔레이션을 보여 주었다. 나중에, 다른 그룹은 원래의 절차에 따라 팽창 차등 원심 ^6-8에 기초하여 조직 분획을 보여 주었다. 이러한 초기 방법은 종종 균질화, 및 / 또는 차등 원심 ^{9-15 통합} 현재 기술의 기초를 형성. homogenizati의 수단계와 원심 분리 프로토콜마다 다릅니다. 이러한 반복적 인 단계들은 미토콘드리아 분리를 위해 시간을 증가시키고, 궁극적으로 생존 능력을 감소시킨다. 제대로 ^{10,16 제어하지} 않을 경우 또한, 수동 균질화는 미토콘드리아 손상과 일치하지 않는 결과가 발생할 수 있습니다.

최근에, 우리는 심근 조직 ^{(17, 18)에}

프로토콜

준비

1. 한 M K-HEPES 원액을 (KOH와 7.2 산도를 조정) 준비합니다.
2. 0.5 M K-EGTA 주식 솔루션 (KOH 8.0의 산도를 조정) 준비합니다.
3. 한 M KH ₂ PO ₄ 원액을 준비합니다.
4. 한 M _MgCl2를 원액을 준비합니다.
5. 균질화 완충액 (pH 7.2) 300 MM의 크로스, 10 mM의 K-HEPES 및 1 ㎜ K-EGTA를 준비합니다. 4 ℃에서 보관하십시오.
6. 호흡 버퍼 250 MM의 자당을 준비, 2 mM의 KH ₂ PO _4, 10 mM의 _MgCl2를, 20 mM의 K-HEPES 완충액 (pH 7.2) 및 0.5 mM의 K-EGTA (산도 8.0). 4 ℃에서 보관하십시오.
7. 의 NaCl 80g,의 KCl 2g, 나 ₂ HPO _4의 14.4 g, 1 L 더블 증류수 H ₂ O (산도 7.4)에 KH ₂ PO ₄ 2.4 g을 용해시켜 10 배 PBS 원액을 준비합니다.
8. 1 L 더블 증류수 H ₂....

결과

티슈 해리 및 차등 여과를 이용하여 미토콘드리아 격리에서 절차 단계를 개략적 인 그림이도 1에 도시된다. 전체 절차 시간을 30 분 미만이다.

조직 샘플은 6mm 생검 펀치를 사용하여 수득 하였다. 조직의 무게는 0.18 ± 0.04 g (습 중량)이었다. 입경 계수에 의해 결정으로서 단리 미토콘드리아의 수는 2.4이었다 × 10 ¹⁰ ± 0.1 × 10 ¹⁰ 골격근 미토콘드리아 간 제제 2.75 × 10 ¹⁰ ± 0.1 × ¹⁰ 10 미토콘드리아 (도 2A). 비교 미토콘드리아의 수는 혈구에 의해 결정되었다 허용합니다. 0.11로 혈구에 의해 결정되는 미토콘드리아 수가 과소 평가 된 ¹⁰ × 10 × 10 ± 0.04 ¹⁰ 골격근위한 미토콘드리아 0.34 X 간 제제 미토콘드리아 ¹⁰

토론

성공적으로 미토콘드리아 생존을 유지하기 위해 얼음에 모든 솔루션과 조직 샘플을 유지하는 것이 필수적입니다이 프로토콜을 사용하여 미토콘드리아를 분리합니다. 얼음에서 유지하더라도, 절연 미토콘드리아는 ¹⁹ 시간에 걸쳐 기능적 활성의 감소를 나타내는 것이다. 우리는 솔루션 및 추가가 미리 준비하는 것이 좋습니다. 우리는 - 무게 사전 및 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 4 밀리그램 분량 씩 서브 틸리를 저장하고 -20 ° C에 저장합니다. 마찬가지로 BSA는 미리 무게를 -20 ° C에 저장할 수 있습니다 1.5 ml의 미세 원심 분리 튜브에 20 mg을 분취에 저장됩니다. 튜브를 사용 직전는 -20 ° C에서 제거되고 서브 틸리 및 BSA는 미토콘드리아 분리 과정에 사용하기 위해 균질화 완충액 1 ㎖에 용해시킨다.

골격 근육 조직에서 두 생검 펀치는 6mm 생검 펀치 치료 개입 ^(17)에 대한 임상 적 및 외과 적 치료에 사용하기 위해.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
설탕	시그마 알드리치	84100
HEPES	시그마 알드리치	H4034
EGTA	시그마 알드리치	E4378
substilsin A	시그마 알드리치	P5380
BSA	시그마 알드리치	A7906
KH2PO4	Sigma 알드리치	P5379
MgCl2	Sigma Aldrich	M8266
NaCl	Sigma Aldrich	S6191
KCl	Fisher Scientific	P2173
Na2HPO4	Fisher Scientific	S374
ATPlite 발광 분석 시스템, 1,000 분석 키트	Perkin Elmer
50 ml 원뿔 튜브	BD	352098
40 μ m 나일론 필터	BD	352340
GentleMACS C 튜브	Miltenyl Biotech	120-005-331
1.5 ml Eppendorf 튜브	Fisher Scientific	05-408-129
6mm 생검 펀치	Miltex	33-36
10 μ m Pluristrainer	Pluriselect	43-500-10-03
Eppendorf Centrifuge 5415C	Marshall Scientific	EP-5415C
GentleMACS 분리기	Miltenyl Biotech	130-093-235
96-웰 플레이트, 조직 배양 처리	VWR	82050-732
Rotomax 120 오비탈 쉐이커	Heidolph	544-41200-00
Synergy H4 하이브리드 멀티모드   마이크로플레이트 리더	BioTek
Multisizer 4 쿨터 카운터	Beckman Coulter	A63076
Oxytherm 시스템	Hansatech Instruments
Hemacytometer	Fisher Scientific	267110

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