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방법 논문

마우스에 동종 CD4 T 세포 반응을 연구하기 위해 테일 피부 이식

13.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51724

⸱

2014년 7월 25일

 ,  , 
1Department of Biomedicine, Immunoregulation, University of Basel and University Hospital Basel

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

꼬리 피부 이식은 생쥐의 동종 면역 반응 중 T 세포 의존적 거부 및 내성 유도를 연구하기 위한 강력한 모델입니다. 이 프로토콜의 장점은 경미한 침습적 수술과 수용 마우스를 희생할 필요 없이 모니터링이 용이하다는 것입니다.

초록

동종 항원 인식 중 T 세포 반응과 그 결과에 대한 연구에는 공여자와 숙주 T 세포를 구별하고, 이식편을 쉽게 모니터링하고, 다양한 면역학적 질문에 답하기 위해 시스템을 조정할 수 있는 모델이 필요합니다. Medawar와 동료들은 1955년에 생쥐에서 동종 꼬리 피부 이식을 확립했습니다. 그 이후로 피부 이식 모델은 특정 질문에 답하기 위해 지속적으로 수정되고 조정되었습니다. 꼬리 피부를 사용하면 이 모델을 이식 거부 반응에 쉽게 점수를 매길 수 있고, 광범위한 준비나 깊은 마취가 필요하지 않으며, 모든 유전적 배경을 가진 동물에 적용할 수 있고, 허혈성 괴사를 억제하고, 화학적 및 생물학적 개입이 가능합니다.

일반적으로 CD4+ 및 CD8+ 동종 T 세포는 서로 다른 마우스 균주에서 일치하지 않는 주요 조직적합성 항원을 인식하기 때문에 동종이식편의 거부 반응을 일으킵니다. 피부 이식된 마우스에서 동종 T 세포를 활성화하기 위한 여러 모델이 설명되었습니다. C57BL/6 마우스를 포함한 다양한 마우스 균주에서 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 및 II 분자를 식별하는 것은 T 세포 매개 동종 반응을 이해하고 연구하기 위한 중요한 단계였습니다. 여기에 기술된 꼬리-피부 이식 모델에서, MHC-class II(I-A b) 분자의 항원 제시 홈에 있는 3점 돌연변이(I-A bm12)는 C57BL/6 마우스에서 강력한 동종 CD4+ T 세포 활성화를 유도하기에 충분합니다. C57BL/6 마우스에 대한 I-Abm12 마우스의 피부 이식은 12-15일 이내에 거부되는 반면, syngeneic 이식은 최대 100일 동안 허용됩니다. T 세포(CD3-/- 및 Rag2-/- 마우스)가 없기 때문에 최대 100일까지 피부 이식 수용이 가능하며, 이는 2 x 104 야생형 또는 형질전환 T 세포를 이식하여 극복할 수 있습니다. 채택적으로 전달된 T 세포는 I-Abm12 이식된 Rag2-/- 마우스에서 증식하고 IFN-γ를 생성합니다.

서론

이러한 피부, 심장, 신장 등 고형 장기의 이식은 지금 전 세계적으로 의료 행위 1의 표준 절차입니다. 성공적으로 장기 이식은 기증자의 주요 조직 적합성 항원을 인식받는 사람의 면역 시스템의 활성화에 의해 거부 될 수 있습니다. 따라서 이식 환자는 면역 억제 약물이 치료가 필요합니다. 생쥐 동종 피부 이식은 1955 년에 메다와 동료에 의해 설립 이후 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 및 II로 기술 대상 분자를 식별하는 데 도움이이었다. 그 이후로, 피부 이식 모델은 연속적으로 수정 및 T 세포 서브 세트의 역할 및 이식 거부 2-4을 억제하는 화학적 및 생물학적 개입의 관련성을 연구하도록 채택되었다. 귀 트렁크에서 피부는 준비하기가 더 어렵습니다 꼬리 피부 5보다 저산소증 및 괴사에 더 민감하다; 그러나,이식 절차는 비슷합니다. 또한 꼬리의 피부 이식의 모니터링으로 인해 피부의 특징적인 머리 짜임새에 용이합니다.

이 문서는 CD4 + T 세포 - 매개 동종 이식 거부 반응 및 생쥐의 허용 오차의 다양한 측면의 연구를 허용 MHC 클래스 II 불일치 꼬리 피부 이식에 대한 자세한 절차를 제공합니다. (IA BM12라고 함) MHC 클래스 II 분자 IA B의 자연 3 점 돌연변이는 6-9 C57BL / 6 마우스 8 피부 동종 이식의 거부 반응을 유발하기에 충분하다. IA의 BM12 분자는 다양한 αβ-T 세포 수용체 Vα2Vβ8-TCR 특정 T 세포의 TCR-트랜스 제닉 마우스 (10)를 생성하기 위해 식별 된 구비 C57BL / 6 생쥐 (TCR) 체인과 CD4 + T 세포를 활성화한다. Vα2Vβ8-TCR 특정 T 세포의 대체 송금 면역 결핍 C57B에서 거부 모델을 수립하는 데 사용되어왔다L / 6 Rag2 - / - IA BM12의 피부에 이식 된 쥐.

기증자와받는 사람 사이의 유전 적 차이는 이식 수용과 거부의 결과에 영향을 미칠. 이식의 다른 유형이있다 :자가 이식받는 사람의 개인 자체에서 이식이다; syngrafts 및 동종 이식은 각각 유 전적으로 동일하고 유 전적으로 관련이없는 개인의 이식입니다. 다른 동종 장기 이식의 수용 환자와 마우스 모델 11,3,4의 화학 및 생물 학적 개입에 의해 증명되었다. 기본적인 접근 방식에서, 항 CD3 항체 처리 C57BL / 6 마우스는 IA BM12 꼬리 피부 (게시되지 않은 데이터)의 장기 생존율을 보였다. 세포받는 생쥐에 이식하기 전에 CD4 +와 CD8 + T의 고갈은 MHC 클래스 I 및 II 일치하지 않는 이식 (12 목사)의 수용의 결과. 흥미롭게도, 피부 이식의 거부 반응은 CD4 +의 존재에 따라 달라집니다 T 세포 (12 계). 이 모델에서, 규제 T 세포와 항체 억제와 공동 자극 분자를 차단하여 다른 면역 세포 사이의 특정한 상호 작용을 대상으로하는 것은 허용 (게시되지 않은 데이터)를 유도 할 수 있습니다. 실제로, CD40 및 CD28을 모두 차단하는 것은 장기적으로 피부 이식 허용 오차 13, 14되었다.

꼬리 피부 이식은 다른 장기의 이식에 비해 수행하기 쉬운 모니터링하기 쉽습니다. 또한, 꼬리, 피부 이식을 준비하기 쉽고 다른 피부 조직에 비해 국소 빈혈에 덜 민감하다. 주입 마취제 달리, 이식 동안 마취 가스 (이소 플루오 란)의 사용 절차와 수신자 복구 시간을 모두 단축시킨다. 불완전 상처 치유 및 이식 거부로 이어질 수 꼬리 피부 이식의 컬링은, 조직 접착제의인가에 의해 방지된다. 또한, IA BM12 꼬리 피부 이식 모델은 독점적으로 CD4를 활성화 + (동일한 유전 적 배경) 면역 및 면역 결핍 마우스 모두에서 T 세포는 결과의 해석을 용이.

이 프로토콜은 화학 및 생물 학적 개입을 할 수있는, 신뢰할 수있는 재생 가능한 쉽게 모니터링 마우스 모델에 대해 설명합니다. 이 모델은 테일 피부 이식의 거부와 관용 유도를 조사하기위한 것입니다.

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프로토콜

이 비디오 간행물 및 프로토콜, 모든 동물의 절차는 주립 기관 바젤 슈타 트, 스위스에서 승인 한 동물 프로토콜에 따라 수행 하였다. 무균 조건 가능한 모든 절차를 수행합니다.

수술 1. 준비

  1. 모든 수술 도구를 압력솥 사용하기 전에 거즈.
  2. 따뜻한 패드를 가열 테이블 (재료 / 방법의 테이블)에 수술기구를 구성 할 수 있습니다.
  3. 손가락 스트립 붕대를 엽니 다. (가제가 완전히 포함되어 있는지 확인) 면봉으로 상처 패드에 바셀린을 적용합니다.
  4. 쥐를 달아 진통제 프레 놀핀에게 0.05 ㎎ / ㎏ 체중을 관리 할 수​​ 있습니다. 참고 :이 즉시 이식 후 진통을 제공 할 것입니다.

이식의 꼬리 피부의 2. 준비

  1. CO 2 질식 및 D 당 기증자 마우스 (예를 들어, IA의 BM12)를 안락사절단하기 전에 소독 용액으로 꼬리를 isinfect.
  2. 깨끗한 플라스틱 보드에 검은 줄무늬 아래로 꼬리를 놓고 중간 라인에 걸쳐 길이 방향으로 잘라, 단지 피부 층을 포함하는 표면 절개.
  3. 그립 집게를 사용하여 꼬리의 피부를 당겨.
  4. 10 ㎖ HBSS로 가득 10cm의 세포 배양 접시에 꼬리 피부를 넣습니다.

3. 수술

  1. 투명 유도 상자 3 % 이소 플루오 란 용액 흡입받는 마우스 (예, C57BL / 6)을 마취. 참고 : 마우스가 수술 비행기 마취에 도달하는 것은 3 ~ 5 분입니다. 마취 동안 건조를 방지하기 위해 눈에 수의사 연고를 사용합니다.
  2. 따뜻한 패드에 마우스를 올려 놓고 발가락이 곤란하여 각 동물의 반사 입 마스크와 엉덩이를 통해 1.5 % 이소 플루오 란을 적용합니다.
  3. 받는 사람 생쥐의 등쪽 사이트 (예를 들어, C57BL / 6) 면도 마른 거즈 SW를 사용하여 오염 머리카락을 제거AB.
  4. 무균 용액으로 면도 이식 사이트를 소독.
  5. 배부의 오른쪽 / 중앙 사이트의 집게로 피부를 조이고 약 1 × 0.6 cm의 원형 절개를 만들기 위해 곡선 가위를 사용합니다.
  6. 출혈이 발생하는 경우, 멸균 면봉으로 상처를 청소.
  7. 절개의 크기를 평가하고 메스를 사용하여 꼬리 피부에서 예상 크기의 이식을 잘라.
  8. 이식을 반올림 모서리를 낸다.
  9. 멸균 면봉에 메스, HBSS의 건조 초과에 이식을로드하고받는 사람 마우스의 이식 침대에 배치합니다.
  10. 기증자와 호스트 피부의 중복을 방지하고 독점적으로 접촉 영역에서 조직 접착제를 적용합니다.
  11. 마우스 허리 주위에 주름없이 석고를 적용합니다.
  12. 마우스에 석고를 해결하기 위해 접착제가 아닌 탄력 붕대를 적용 (3 MM은 이동).
  13. 붕대의 상단 복부 사이트의 3mm에 대한 가위로 절개. 주 :이 TR을 피하기위한 것이다복구 단계에서 마우스의 치아 apping.
  14. 마취 입 마스크를 제거하고 깨어 때까지 가열 패드에 이식 된 쥐를 유지합니다.
  15. 완전히 복구 된 경우에만 자신의 새장에 이식 된 쥐를 반환하고 붕대가 너무 꽉되지 않도록 자신의 이동성을 평가합니다.
  16. 다음 수술을 진행하기 전에 70 % 에탄올로 모든 수술기구를 소독.

4. 수술 후 케어

  1. 식수 (4 ㎎ / ㎖)로 해열 함유 시럽을 추가, 7 일 동안을 관리 할 수​​ 있습니다.
  2. 이 복구되면 동물의 방에 마우스를 반환합니다.
  3. 밀접하게 붕대 장소 (1 주)에 시간을 우울증이나 다른 행동 변화 (식사 또는 부동), 비정상적인 모양 (손질의 부족) 또는 자세 (pilo 직립 또는 새우등 자세) 등의 임상 증상에 마우스를 모니터링 할 수 있습니다.

5. 붕대 제거 (6 ~ 7 일 후 이식)

  1. 마취투명 유도 상자 (위 참조)의 3 % 이소 플루오 란 용액을 흡입 thetize 마우스.
  2. 동맥 가위 붕대와 석고를 잘라 조심스럽게 제거합니다. 주 : 이식 사이트의 스트레칭 마십시오.
  3. 임상 증상에 대한 이식 생쥐 (4.3 참조) 모니터 및 피부 이식 (표 1)의 거부에 대한 점수. 주 : 이식 점수 시스템 등의 피부에 비해 꼬리 피부에 다른 머리 질감을 활용합니다. 이식과 거부의 모양은 3 등급으로 분류됩니다. C57BL / 6 마우스의 면역 동종 피부 (MHC II 일치하지 않는, 예를 들어, IA BM12) 이식은 일반적으로 12~15일 포스트 이식 (자신의 데이터와 15 ~ 20)에서 거부됩니다.

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결과

첫 번째 방법에서 C57BL / 6 마우스는 IA의 BM12 동종 이식 및 IA B 형 syngrafts 이식되었다. 붕대를 제거한 후, C57BL / 6 마우스 (그림 1A)의 접촉 영역의 폐쇄하지 않고 상처 치유의 명백한 징후를 접목. 붕대를 제거한 후, CD4 + T 세포 매개 염증, 괴사 영역의 모양 (붉은 반점)과 이식 (그림 1B-C, 못 기호) 13 이후 일 이내에 C57BL / 6 마우스의 IA의 BM12 동종 이식의 거부에지도 syngrafts 동안 최대 100 일 (그림 1B-C, 오픈 기호)에 대한 허용했다. 이러한 데이터는 면역 C57BL / 6 마우스의 IA의 BM12 이식의 급성 거부 반응의 진행을 보여줍니다.

다양한 연구가 MHC 클래스 II 일치하지 않는 꼬리 ...

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토론

피부 이식은 거부하고 T 세포에 따라 허용 공부를위한 널리 사용되는 방법입니다. 피부 이식 모델이 확립 된 이후, 여러 가지 적응 및 변경 사항이 적용되었습니다. 설명 과정에서 IA BM12 꼬리 피부 이식은 마취 가스 (이소 플루오 란)를 사용하여 수행됩니다. 마취 가스의 사용은 이식 된 생쥐에 응력을 감소 실행 및 생쥐 복구 시간을 감소시킨다. 절차는 귀 또는 등쪽 피부 조직보다 말리는 꼬리 피부를 해결하기 위해 조직 접착제를 사용한다. 또한 그것은이 컬링을 줄이고 지느러미 절단 사이트의 꼬리 피부의 위치를​​ 향상으로 가장자리를 절단 및 트리밍 전에 꼬리 피부를 평평하게하는 것이 중요합니다.

이식 거부 또는 수락을 평가하기 위해 그것은 TRA의 득점을 용이하게하기 위해 이식의 중간에 (C57BL / 6 마우스의 예) 검은 줄무늬와 꼬리의 피부를 준비해야합니다머리 질감의 차이에 따라 nsplants.

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공개 사항

저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

감사의 글

이 작업은 SNF 보조금 PPOOA-_119204 및 S.W.R에 대한 PPOOP3_144918의 지원을 받았습니다. 마우스와 기술적 전문성을 제공해 준 E. Palmer와 B.T.H. Hausmann에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
베타딘 표준 솔루션Mundipharma
면봉Carl Roth GmbH31025060
Dafalgan , UPSABristol Myers Squibb UPSA
Hansaplast finger stripsBeierdorf AGREF.76861
Histoacryl tissue adhesiveBraunREF.1050052
Leukotape classic , 2 cm x 10 mBSN Medical SASREF.02204-00
PBS, 인산염 완충 식염수, pH 7.4Invitrogen10010015 GIBCO
멸균 거즈, 5 x 5 cm, 8 plyMaiMedGmbH 21010
좁은 패턴 집게FST11003-12
미세 아이리스 가위 곡선FST14095-11
파인 아이리스 가위 FST14094-11
Mayo 가위FST14010-15
동맥 가위 볼 팁 11.5 cmFST14080-11
조직 겸자FST11021-14
수술용 칼날 No. 20Swann-Morton LTD3006탄소강
수술용 칼날 핸들Swann-Morton LTD
주사기, 1 mlARTSANA일회용
Temgesic, 부프레노르핀ESSEX Chemie AG0.3 mg/ml
조직 배양 접시 10 cm, 60.1 cm2TPP
VaselineVifor SA
웜 패드SolisType 223

참고문헌

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