마우스에 동종 CD4 T 세포 반응을 연구하기 위해 테일 피부 이식

요약

꼬리 피부 이식은 생쥐의 동종 면역 반응 중 T 세포 의존적 거부 및 내성 유도를 연구하기 위한 강력한 모델입니다. 이 프로토콜의 장점은 경미한 침습적 수술과 수용 마우스를 희생할 필요 없이 모니터링이 용이하다는 것입니다.

초록

동종 항원 인식 중 T 세포 반응과 그 결과에 대한 연구에는 공여자와 숙주 T 세포를 구별하고, 이식편을 쉽게 모니터링하고, 다양한 면역학적 질문에 답하기 위해 시스템을 조정할 수 있는 모델이 필요합니다. Medawar와 동료들은 1955년에 생쥐에서 동종 꼬리 피부 이식을 확립했습니다. 그 이후로 피부 이식 모델은 특정 질문에 답하기 위해 지속적으로 수정되고 조정되었습니다. 꼬리 피부를 사용하면 이 모델을 이식 거부 반응에 쉽게 점수를 매길 수 있고, 광범위한 준비나 깊은 마취가 필요하지 않으며, 모든 유전적 배경을 가진 동물에 적용할 수 있고, 허혈성 괴사를 억제하고, 화학적 및 생물학적 개입이 가능합니다.

일반적으로 CD4⁺ 및 CD8⁺ 동종 T 세포는 서로 다른 마우스 균주에서 일치하지 않는 주요 조직적합성 항원을 인식하기 때문에 동종이식편의 거부 반응을 일으킵니다. 피부 이식된 마우스에서 동종 T 세포를 활성화하기 위한 여러 모델이 설명되었습니다. C57BL/6 마우스를 포함한 다양한 마우스 균주에서 주요 조직적합성 복합체(MHC) 클래스 I 및 II 분자를 식별하는 것은 T 세포 매개 동종 반응을 이해하고 연구하기 위한 중요한 단계였습니다. 여기에 기술된 꼬리-피부 이식 모델에서, MHC-class II(I-A b) 분자의 항원 제시 홈에 있는 3점 돌연변이(I-A ^bm12)는 C57BL/6 마우스에서 강력한 동종 CD4+ T 세포 활성화를 유도하기에 충분합니다. C57BL/6 마우스에 대한 I-A^bm12 마우스의 피부 이식은 12-15일 이내에 거부되는 반면, syngeneic 이식은 최대 100일 동안 허용됩니다. T 세포(CD3^-/- 및 Rag2^-/- 마우스)가 없기 때문에 최대 100일까지 피부 이식 수용이 가능하며, 이는 2 x 10⁴ 야생형 또는 형질전환 T 세포를 이식하여 극복할 수 있습니다. 채택적으로 전달된 T 세포는 I-A^bm12 이식된 Rag2^-/- 마우스에서 증식하고 IFN-γ를 생성합니다.

서론

이러한 피부, 심장, 신장 등 고형 장기의 이식은 지금 전 세계적으로 의료 행위 ^1의 표준 절차입니다. 성공적으로 장기 이식은 기증자의 주요 조직 적합성 항원을 인식받는 사람의 면역 시스템의 활성화에 의해 거부 될 수 있습니다. 따라서 이식 환자는 면역 억제 ^약물이 치료가 필요합니다. 생쥐 동종 피부 이식은 1955 년에 메다와 동료에 의해 설립 이후 주요 조직 적합성 복합체 (MHC) 클래스 I 및 II로 기술 대상 분자를 식별하는 데 도움이이었다. 그 이후로, 피부 이식 모델은 연속적으로 수정 및 T 세포 서브 세트의 역할 및 이식 거부 ^2-4을 억제하는 화학적 및 생물학적 개입의 관련성을 연구하도록 채택되었다. 귀 트렁크에서 피부는 준비하기가 더 어렵습니다 꼬리 피부 ^5보다 저산소증 및 괴사에 더 민감하다; 그러나,이식 절차는 비슷합니다. 또한 꼬리의 피부 이식의 모니터링으로 인해 피부의 특징적인 머리 짜임새에 용이합니다.

이 문서는 CD4 ⁺ T 세포 - 매개 동종 이식 거부 반응 및 생쥐의 허용 오차의 다양한 측면의 연구를 허용 MHC 클래스 II 불일치 꼬리 피부 이식에 대한 자세한 절차를 제공합니다. (IA ^{BM12라고<....}

프로토콜

이 비디오 간행물 및 프로토콜, 모든 동물의 절차는 주립 기관 바젤 슈타 트, 스위스에서 승인 한 동물 프로토콜에 따라 수행 하였다. 무균 조건 가능한 모든 절차를 수행합니다.

수술 1. 준비

1. 모든 수술 도구를 압력솥 사용하기 전에 거즈.
2. 따뜻한 패드를 가열 테이블 (재료 / 방법의 테이블)에 수술기구를 구성 할 수 있습니다.
3. 손가락 스트립 붕대를 엽니 다. (가제가 완전히 포함되어 있는지 확인) 면봉으로 상처 패드에 바셀린을 적용합니다.
4. 쥐를 달아 진통제 프레 놀핀에게 0.05 ㎎ / ㎏ 체중을 관리 할 수​​ 있습니다. 참고 :이 즉시 이식 후 진통을 제공 할 것입니다.

이식의 꼬리 피부의 2. 준비

1. CO ₂ 질식 및 D 당 기증자 마우스 (예를 들어, IA의 ^BM12)를 안락사절단하기 전에 소독 용액으로 꼬리를 isinfect.
2. 깨끗한 플라스틱 보드에 검은 줄무늬 아래로 꼬리를 놓고 중간 라인에 걸쳐 길이 방향으로 잘라, 단지 피부 층을 포함하는 표면 절개.
3. 그....

결과

첫 번째 방법에서 C57BL / 6 마우스는 IA의 ^{BM12 동종} 이식 및 IA ^{B 형} syngrafts 이식되었다. 붕대를 제거한 후, C57BL / 6 마우스 (그림 1A)의 접촉 영역의 폐쇄하지 않고 상처 치유의 명백한 징후를 접목. 붕대를 제거한 후, CD4 ⁺ T 세포 매개 염증, 괴사 영역의 모양 (붉은 반점)과 이식 (그림 1B-C, 못 기호) 13 이후 일 이내에 C57BL / 6 마우스의 IA의 ^{BM12 동종} 이식의 거부에지도 syngrafts 동안 최대 100 일 (그림 1B-C, 오픈 기호)에 대한 허용했다. 이러한 데이터는 면역 C57BL / 6 마우스의 IA의 ^{BM12 이식의} 급성 거부 반응의 진행을 보여줍니다.

다양한 연구가 MHC 클래스 II 일치하지 않는 꼬리 .......

토론

피부 이식은 거부하고 T 세포에 따라 허용 공부를위한 널리 사용되는 방법입니다. 피부 이식 모델이 확립 된 이후, 여러 가지 적응 및 변경 사항이 적용되었습니다. 설명 과정에서 IA ^BM12 꼬리 피부 이식은 마취 가스 (이소 플루오 란)를 사용하여 수행됩니다. 마취 가스의 사용은 이식 된 생쥐에 응력을 감소 실행 및 생쥐 복구 시간을 감소시킨다. 절차는 귀 또는 등쪽 피부 조직보다 말리는 꼬리 피부를 해결하기 위해 조직 접착제를 사용한다. 또한 그것은이 컬링을 줄이고 지느러미 절단 사이트의 꼬리 피부의 위치를​​ 향상으로 가장자리를 절단 및 트리밍 전에 꼬리 피부를 평평하게하는 것이 중요합니다.

이식 거부 또는 수락을 평가하기 위해 그것은 TRA의 득점을 용이하게하기 위해 이식의 중간에 (C57BL / 6 마우스의 예) 검은 줄무늬와 꼬리의 피부를 준비해야합니다머리 질감의 차이에 따라 nsplants.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
베타딘 표준 솔루션	Mundipharma
면봉	Carl Roth GmbH	31025060
Dafalgan , UPSA	Bristol Myers Squibb UPSA
Hansaplast finger strips	Beierdorf AG	REF.76861
Histoacryl tissue adhesive	Braun	REF.1050052
Leukotape classic , 2 cm x 10 m	BSN Medical SAS	REF.02204-00
PBS, 인산염 완충 식염수, pH 7.4	Invitrogen		10010015 GIBCO
멸균 거즈, 5 x 5 cm, 8 ply	MaiMed	GmbH 21010
좁은 패턴 집게	FST	11003-12
미세 아이리스 가위 곡선	FST	14095-11
파인 아이리스 가위 FST		14094-11
Mayo 가위	FST	14010-15
동맥 가위 볼 팁 11.5 cm	FST	14080-11
조직 겸자	FST	11021-14
수술용 칼날 No. 20	Swann-Morton LTD	3006	탄소강
수술용 칼날 핸들	Swann-Morton LTD
주사기, 1 ml	ARTSANA		일회용
Temgesic, 부프레노르핀	ESSEX Chemie AG		0.3 mg/ml
조직 배양 접시 10 cm, 60.1 cm2	TPP
Vaseline	Vifor SA
웜 패드	Solis		Type 223