이 프로토콜에 기재된 삼차원 배양법 분지 기관에 자신의 상당한 팽창, 분화 및 형태 발생을 포함한 분산 배아 마우스 췌장 전구 세포로부터 췌장 개발 되풀이되었습니다. 이 방법은 영상, 틈새 시장의 기능 장애 및 조작에 대한 의무입니다.
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방법 논문
분산 된 마우스 배아 전구 세포에서 생체 췌장 기관 형성에
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이 논문에서
요약
초록
췌장은 포도당 항상성을 조절하고 소화 효소를 분비하는 필수 기관입니다. 췌장 배발생에 대한 연구는 줄기세포에서 췌장 세포를 생산하는 프로토콜의 개발로 이어졌습니다 1. 전체 배아 기관은 여러 발달 단계에서 배양될 수 있습니다 2-4. 이러한 배양 방법은 약물을 테스트하고 개발 과정을 이미지화하는 데 유용했습니다. 그러나 장기의 확장은 매우 제한적이며 장기가 평평해지기 때문에 형태 형성이 충실하게 재현되지 않습니다.
우리는 해리된 마우스 배아 췌장 전구 세포의 효율적인 확장을 가능하게 하는 3차원(3D) 배양 조건을 제안합니다. 배양 배지의 구성을 조작함으로써 주로 초기 상태에서 팽창하는 췌장 전구 세포로 구성된 속이 빈 구체 또는 더 성숙한 확장 전구 세포로 진행하고 내분비, 아시나르 및 관 세포로 분화하고 배아 췌장을 닮기 위해 자발적으로 자기 조직화하는 복잡한 오가노이드를 생성할 수 있습니다.
우리는 여기에서 시험관 내 과정이 자연 췌장 발달의 많은 측면을 요약한다는 것을 보여줍니다. 이 배양 시스템은 세포가 어떻게 협력하여 장기를 형성하는지 조사하는 데 적합하며, 초기의 복잡성을 소수의 전구 세포로 줄임으로써 장기를 형성합니다. 췌장의 3D 구조를 재현한 모델이므로 상피 구조의 편광 및 분기를 포함한 형태 형성을 연구하는 데 유용합니다. 또한 강성과 같은 틈새의 기계적 신호에 대한 반응 및 세포의 장력에 미치는 영향을 평가하는 것도 적절합니다.
서론
장기 문화는 생체 내 연구에서 복잡하지만 관련성이 높은 사이의 간격 및 세포 라인 모델의 편리하지만 대략적인 시뮬레이션을 다리에 유용한 모델을 제공합니다. 췌장의 경우, 내분비와 외분비 세포 시뮬레이션 세포주가 변형 되더라도 췌장 전구 세포로 완전히 동등한 어떠한 세포주도 없다. 성인 전체 췌장을 배양 할 수 없습니다; 절연 내분비 아일렛 세포 증식없이 몇 주 동안 유지 될 수 있으며, 조직 조각은 몇 시간에서 5 시험 관내에서 유지 될 수있다. 배아의 췌장 문화가 널리 개발을 연구뿐만 아니라 사용되었습니다뿐만 아니라 8을 처리하는 이미지로, 상피 - 간엽 상호 작용 4,6,7을 조사하기 위해 화학적으로 그 9 방해 할 수 있습니다. 두 기관 배양 방법이 주로 사용된다 : 첫 번째는 conve입니다 피브로넥틴 코팅 플레이트 2에 췌장 꽃 봉오리를 배양에 구성촬상 목적 더욱 편리 할; 두 번째 옵션은 문화에 가장 형태 형성을 유지 공기 - 액체 인터페이스 3,4에서 필터에 대한 기관입니다. 매우 유용하지만, 이러한 방법은 평탄화의 어느 정도 이어질; 정상적인 발달에 비해 시작 인구가 췌장 세포 및 중간 엽 세포의 모든 유형을 포함하는 복잡한 같이 선조의 팽창은 매우 제한된다.
문화 능력과 분산 일차 전지를 확장 계보 관계를 연구하고 고립 된 세포 유형 (10)의 고유 특성을 발견 할 가치가있다. 스기야마 등. 11 췌장 전구 세포 및 피더 레이어에 문화에 3 ~ 5 일 일부 기능 문자를 유지 내분비 전구 세포를 유지할 수 있습니다. 조상의 자연 / 줄기 세포하지만 neurosphere를 12, 13 mammospheres에 가깝다 Pancreatospheres는 성인 독도 및 유관 세포에서 확장되었습니다이러한 분야를 생성하는 것은 명확하지 않다. 또, 생리 현상과는 대조적으로, pancreatospheres 일부 뉴런에게 14,15을 함유 하였다. 분야는 최근 배아 췌장 전구 세포 (16, 17)과 좋은 시조 확장 이후의 분화와 pancreata 18 재생에서 생산하지만, 형태 형성을 요점을 되풀이하는 데 실패했다.
소형 기관에 자체 조직으로 분산 종종 정의 세포에서 3D 모델은 최근 번성하고 소장 (19, 20), 배 (21), 간 (22), 전립선 (23)과 기관 등의 여러 장기의 개발 또는 성인 매출을 시뮬레이션 한 24. 광섬유 컵 25, 26 또는 뇌 부위 (27)의 경우와 같이 몇몇 경우에, 형태 형성 발달과 분화는, ES 세포로부터 3D로 효과적으로 요약되었다.
여기, 우리 DES그들은 차별화 자체 구성 할 수 있습니다 3D 리겔 비계에서 해리 다 능성 췌장 전구 세포를 확장하는 방법을 cribe.
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프로토콜
이 프로토콜은 쥐 E10.5에서 파생 된 췌장 organoids 상피 췌장 세포를 해리 성장하는 것을 목표로하고있다.
이 프로토콜은 동물 실험에 대한 윤리적 승인을 필요로합니다.
E10.5 마우스 배아에서 지느러미 췌장 버드 1. 해부
- 가위로 복부를 열고 배아 일 (E) 10.5 초과 임신 쥐를 희생, 두 자궁 뿔을 제거하고 차가운 인산 완충 생리 식염수 (PBS) 또는 둘 베코 가득 10cm 페트리 접시에 배치 수정 필수적인 매체 (DMEM)을 얼음에 보관. 세포 파종에 희생에서 전체 실험은 세포 손상을 방지하기 위해 60 ~ 90 분에 이루어집니다.
- 작은 가위를 사용하여 개별 배아 세그먼트로 자궁을 분리합니다. 차가운 PBS와 35mm 페트리 접시에 하나의 배아를 전송하고 위의 조명과 해부 현미경을 시각화. 해부 집게와 주변 근육, 탈락과 노른자 SA를 제거C와 배아를 노출합니다. 다시 차가운 DMEM 매체에 배아를 놓습니다. 태아 간단 3 ㎖ 플라스틱 전송 피펫 / 적기를 사용하여 전송 될 수있다. 계속하기 전에 유사한 방식으로 모든 개인 배아를 분리합니다.
- PBS에 깨끗한 35mm 페트리 접시에 배아를 놓습니다.
- 앞다리를 제거하는 얇은 집게 (0.05 mm 폭)를 사용합니다. 조심스럽게 척수 지역에서 소화 기관 (그림 1)을 분리 개방에 집게를 삽입합니다. 선택 사항 : 더 편리하게, 위를 참조하십시오 아래 노른자 줄기 아래 마음과 꼬리 영역으로, 태아의 상체를 제거합니다.
- 위, 간, 소장을 찾습니다. 집게를 사용하여 소장에 위장에서 소화 기관을 분리하고 (그림 1) 얼음에 차가운 DMEM에 배치합니다. 지느러미 췌장 꽃 봉오리는 위장 등쪽, 후부 (그림 1)가 포함되어 있습니다.
- 시미에있는 모든 개인 위장관 분리계속하기 전에 고맙다 방식. 배아 유전자형을해야 할 경우, 절개시에 꼬리를 수집하고 얼음에 차가운 DMEM과 24 웰 플레이트에서 다른 잘되는 모든 개인 위장관을 유지합니다.
- 차가운 PBS에 깨끗한 35mm 페트리 접시에 한 위장관 놓습니다. 이제 해부 현미경 등의 췌장 봉오리를 시각화하고 해부 시야에서 아래에서 조명을 사용합니다. 이러한 조건은 볼륨의 시각화를 최적화합니다. 전해 날카롭게 텅스텐 바늘 또는 20 G 주사기 바늘을 사용하여, 상피 주위 가급적 간엽 가진 췌장 새싹 (도 1)을 격리.
- 2 ~ 3 분 동안 차가운 디스 파제 용액 (1.25 ㎎ / ㎖)를 포함하는 배양 접시에 고립 된 꽃 봉오리를 전송합니다. 이 시점에서 전송이 가장 편리하게 입 통제 유연한 튜브에 부착 불꽃 뽑아 50 μL 유리 모세관을 수행 할 수 있습니다. 대안 적으로, 그러나 더 RI 함께새싹을 잃을 SK는 적절한 플라스틱 팁을 10 μL 자동 피펫 (Pipetman)를 사용합니다.
- 미세한 제어 췌장 봉오리 흡입과 배출을 수행합니다. 다시 PBS에서 췌장 봉오리를 넣어. 또한 유리 모세관 (그림 1)를 사용하여 바늘과 부드러운 열망을 가진 중간 엽에서 분리 된 췌장 봉오리를 청소합니다.
- 전체 중간 엽을 제거 할 때, 차가운 PBS에서 췌장 싹 씻어; (60 - 웰 미니 트레이 차가운 DMEM 10 μL로 가득) 개인 우물에서 차가운 DMEM 각 봉오리를 전송합니다. 그것은 조직이 매우 끈적하게하는, 디스 파제에서 중간 엽을 제거하지 않는 것이 중요합니다.
분산 된 세포의 2. 도금 및 문화
- 세정 10 ㎕의 PBS로 가득 60도 미니 트레이의 원추형의 우물에 불꽃 뽑아 유리 모세관 모든 배아에서 해부 상피를 전송합니다.
- 트립신 0.05 %의 10 μL에 꽃 봉오리로 이동ND는 4 분 동안 37 ° C에서 배양 할 수 있습니다. 10 μL의 DMEM + 10 % 소 태아 혈청 (FCS)와 우물에 새싹 전송하여 트립신을 불 활성화.
- 피펫 풀러으로 뽑아가는 모세 혈관을 통해 흡인 세포 현탁액을 떼어 놓다. 이것은 세포를 해리 상하 피펫 팅하면서이 단계에서 기포를 방지하는 것이 중요하다. 췌장 organoids 최적 ~ 15 세포의 작은 그룹에서 시작하기 때문에 부분적인 분리는 (그림 1)를 추천합니다.
- 개별 처리로 인한 차이를 최소화하기 위해 에펜 도르프 튜브에 몇개의 배아 세포를 해변. 1:3 비율로 냉장 마트 리겔에서 세포 현탁액을 희석. 나누어지는 96 - 웰 플레이트, 8 μL / 잘 또는 영상에 최적화 된 접시에 (아래 참조)이 혼합물.
- 리겔은 두껍게 할 수 있도록 5 분 동안 37 ° C에서 접시를 품어. 선택의 매체의 70 μL로 우물을 채우기 (organoid 또는 구, 탭보기 참조레 1, 2), 37 ° C에서 5 % CO 2, 95 %의 공기를 포함하는 습한 환경에서 떠나
- 매 4 일째 매체를 교체합니다. 매일 성장하는 췌장 식민지를 모니터링 및 이미징하여 프로세스를 문서화합니다.
- 이전에보고 된 28 또한 작은 분자 또는 단백질, 간섭 실험을 위해이 단계에서 배지에 첨가 할 수있다.
표 1 : Organoid 매체.
| 소재의 이름 | 주식 집중 | 최종 매체에 집중 | 주식의 볼륨 |
| 페니실린 - 스트렙토 마이신 | 100 % | 1 % | 50 μL |
| 녹아웃 혈청 교체 (보충) | 100 % | 10 % | 500 μL |
| 2 - 머 캅토 에탄올 | 14.3 M | 0.1 ㎜ | 1 μL |
| 포르 미리 스테이트 아세테이트 (PMA) | 16 μM | 16 nM의 | 5 μL |
| Y-27632 (ROCK 저해제) | 50 mM의 | 10 μM | 1 μL |
| EGF | 50 ㎍ / ㎖의 | 25 NG / ML | 2.5 ㎕의 |
| 재조합 인간 1 R-spondin | 250 ㎍ / ㎖의 | 500 NG / ML | 10 μL |
| - 또는 - | |||
| 재조합 마우스 R-spondin 1 | 250 ㎍ / ㎖의 | 500 NG / ML | 10 μL |
| 재조합 인간 FGF1 (aFGF) | 100 ㎍ / ㎖의 | 25 ㎍ / ㎖의 | 1.25 μL |
| 헤파린 (Liquemin) | 2500 U / ㎖ | 2.5 U / ㎖ | 2 μL |
| 권장binant 인간 FGF10 | 100 ㎍ / ㎖의 | 100 NG / ML | 5 μL |
| DMEM/F-12 | 4,412.25 μL | ||
| 합계 | 5,000 μL |
표 2 : 구 매체.
| 소재의 이름 | 주식 집중 | 최종 매체에 집중 | 주식의 볼륨 |
| 페니실린 - 스트렙토 마이신 | 100 % | 1 % | 50 μL |
| B27의 X50 (보충) | 100 % | 10 % | 100 μL |
| 재조합 인간 FGF2 (bFGF를) | 100 ㎍ / ㎖의 | 64 NG / ML | 3.2 ㎕의 |
| Y-27632 (ROCK 저해제) | 50 mM의 | 10 μM | 1 μL |
| DMEM/F-12 | 4845.8 μL | ||
| 합계 | 5000 μL |
Organoid 개발의 진행 상황 3. 영상
- 이미지 organoids 하나를 매일 또는 시간 경과 현미경 형광 시간 경과 현미경을 사용하여. 시간 경과 영상의 경우, XY (Z) 자동 거꾸로 형광 현미경을 사용합니다.
- 4 - 웰 플레이트 또는 2-5 ML 매체로 채워진 유리 바닥 접시에 3 μL의 예금 작은 방울. 배 장거리 목적으로 이미지. 참고 : 형광 트레이서을 표현 형질 전환 마우스를 사용할 수 있습니다. 예를 들어 영화 1은 Pdx1 - Ngn3-ER TM-IRES-nGFP + 마우스 4에서 organoids의 초기 확장. 핵 GFP 개별 개체 만 유사한 원리는 형광 막과 세포를 추적하는 데 적용 할 수있는 세포를 추적 할 수 있도록 사용자가 그러한MT / MG 마우스 29로.
- 초점이 감도을 방지하고 수동으로 정의 된 위치에 3 일 이상 1 사진 / 시간을 취할 수있는 소프트웨어 제어 자동화를 설정하는 세포를 파종 한 후 시간 경과 영상 3 시간을 시작합니다. 각 위치에 대한, 형광 마커의 발현을보고, 미분 간섭 대비 (DIC) 이미지뿐만 아니라, GFP 신호를 획득.
조직학에 대한 Organoids 4. 복구
- 얼음에 96 - 웰 플레이트를 배치하고 얼음 차가운 PBS로 교체, 매체를 제거합니다. 이것은 부분적으로 리겔을 해중합.
- 조심스럽게 전체 아키텍처를 방해하지하기 위해 1000 μL 팁을 사용하여 주변의 리겔을 제거, 각 organoid를 대기음. 얼음 차가운 PBS로 잘 각 organoid을 전송합니다. 얼음에 플레이트를 유지합니다. 리겔 직접 고정도 가능합니다.
- 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA)로 15 분 동안 organoid 고쳐 자당에 냉동 보존 및 젤라틴에 포함. 각 처리organoid 이전 (요한슨 등., 2007) 4 기술로 저온 절편 제작 및 조직학에 대한.
PCR 및 생화학을위한 Organoids 5. 복구
- 얼음에 96 - 웰 플레이트를 놓고 매체를 제거합니다. 세포의 RNA를 안정시키고 보호하기 위해 잘 당 RNAlater의 60 μl를 추가합니다.
- 부분적으로 얼음을 해중합하여 각 아니라 기계적에서 젤을 방해. 전체 아키텍처를 중단 또는 200 μL 팁으로 기계적으로 젤을 방해하여 (리겔 포함) 전체를 잘 복구 할 수 있도록 1000 μL 팁을 사용하여 개별 organoids를 복구 하나. 이는 RNAse 무료 끈적 에펜 도르프 튜브에 잘 콘텐츠를 전송하기 위해 1000 μL 팁을 사용하여 얼음에 보관.
- 60 μL의 RNAlater에 우물을 세척하고 같은 에펜 도르프 튜브에 남아있는 내용을 추가합니다.
- 4 ℃에서 500 ~ 1,000 XG에서 5 분 튜브를 스핀
- 만 20 ~ 30 μl를 떠나, 뜨는을 제거함께 펠릿과 튜브 RNAlater의. 생화학의 경우, 가능한 한 건조 샘플을 저장합니다.
- 즉시 RNAlater에서 샘플을 동결하지 마십시오; 4 ° CO / N에 상점 (RNAlater 철저하게 조직을 침투 할 수 있도록). 조직은 장기 저장을 위해 -20 ° C에 저장할 수 있습니다 나중에 조직의 파괴와 RNA의 소량의 추출을 위해 처리 할 수 있습니다.
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결과
3D 리겔에서 해리와 시드 E10.5 지느러미 췌장 전구 세포는 췌장 개발을 요점을 되풀이하다. 조상은 쉽게 형광 기자와 올 수 있습니다. 우리의 경우 우리는 (그림 2) Neurog3 4 활성화하지 않고 타목시펜의 부재에 따라서 Pdx1 프로모터 (Pdx1 - Ngn3-ER TM-nGFP) (동영상 1)에 의해 제어되는 핵 GFP 단백질을 발현하는 형질 전환 마우스를 사용.
organoid 매체와, 세포의 작은 클러스터의 초기 압축은 제 시간에 발생한다. 확장 후 처음 4 일 동안 클러스터의 확대 (도 2a)에 의해 검출 될 수있다. 5 일에서 분기 20 % 큰 organoids에 형성한다. 단일 세포를 확장하고 대형 클러스터 Pdx1 식 (28)을 그대로 유지하면서 Pdx1 식을 잃지 않는다.
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토론
시험 관내에서 기능적인 베타 세포의 대규모 생산은 여전히 하나 비효율적이다. 이 도전적인 상황에서, 발달 생물학 연구 기능의 베타 세포의 분화에 필요한 정확한 신호를 해독하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 체외에서 배아의 췌장 전구 세포의 유지 보수, 확장과 차별화 할 수 있습니다. 이것은 다른 내분비 호르몬을 공동으로 표현하지 않는 인슐린을 생산하는 베타 세포의 형성을 포함, Pdx1 높은 수준의 인슐린을 성숙하고 처리 된 인슐린 (28)이 프로 convertases을 표현했다. 시스템 내에서 중요한 핵심 요소는 (외생 적 헤파린에 의해 potentiated 추가 FGF에 의해 자극) FGF의 활동이며, 노치 (내인성) 신호 전달 경로뿐만 아니라 Y-27632에 의해 바위 - 억제 : 그 요인의 부재, 혹은 전혀 organoids 및 분야의 제한된 번호가 28을 생성 하였다. FGF 및 안 요구CH 활성은 쉽게 생체...
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
이 작품은 Det에 FRIE Forskningsråd / Sundhed OG Sygdom에서 유전학 파일럿 상에 NCCR 프론티어, 청소년 당뇨병 연구 재단의 41-2009-775 그랜트 12-126875 순차적으로 투자되었다. 저자는 비디오 촬영을 호스팅 스파 놀리 실험실 감사합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 페니실린-스트렙토마이신 | Gibco | 15070-063 | 재고는 -20 °로 유지되었습니다. C |
| KnockOut 세럼 교체 (보충제) | Gibco | 10828-028 | 재고 유지 -20 ° C |
| 2-메르캅토에탄올 | 시그마 알드리치 | 3148-25ML | 재고는 4°C로 유지되었습니다. C |
| Phorbol Myristate Acetate (PMA) | Calbiotech | 524400-1MG | 재고는 -20 °로 유지되었습니다. C |
| Y-27632 (ROCK inhibitor) | Sigma Aldrich | ab120129 | 재고는 -20 °C로 유지되었습니다. 주의! 안정성/소스는 빈번한 문제의 원인입니다. |
| EGF | Sigma Aldrich | E9644-2MG | 재고는 -80 °로 유지되었습니다. C |
| 재조합 인간 R-spondin 1 | R& D | 4645-RS-025/CF | 재고는 -80 °로 유지되었습니다. C |
| 재조합 마우스 R-spondin 1 | R& D | 3474-RS-050 | 재고는 -80 °로 유지되었습니다. C |
| 재조합 인간 FGF1 (aFGF) | R& D | 232-FA-025 | 재고는 -80 °로 유지되었습니다. C - 베타 세포 생산을 증가시키기 위해 포함하지 마십시오 |
| 헤파린 (리크민) | Drossapharm | 재고는 4 °로 유지; C | |
| 재조합 인간 FGF10 | R& D | 345-FG-025 | 재고는 -80 °로 유지되었습니다. C |
| DMEM/F-12 | Gibco | 21331-020 | |
| 페니실린-스트렙토마이신 | Gibco | 15070-063 | 재고는 -20 °로 유지되었습니다. C |
| B27 x50 (보충) | Gibco | 17504-044 | 재고는 -20 °로 유지되었습니다. C |
| 재조합 인간 FGF2 (bFGF) | R& D | 233-FB-025 | 재고는 -80 °로 유지되었습니다. C |
| Matrigel | Corning | 356231 | 재고는 -20 °로 유지되었습니다. C |
| Trypsin 0.05% | Gibco | 25300-054 | 재고는 4°C로 유지되었습니다. C |
| RNAlater - RNA 안정화 시약 | Qiagen | 76104 | RT |
| Dispase에 보관 | Sigma Aldrich | D4818-2MG | 작업 농도 : 1.25 mg / ml. 재고 유지 -20 ° |
| C BSA for | reconstitution Milipore | 81-068 | 사이토카인의 재구성을 위해 - 재고는 -20 °로 유지되었습니다. C |
| 태아 송아지 혈청 (FCS) | Gibco | 16141079 | 재고는 -20 °로 유지되었습니다. C |
| 60웰 마이크로웰 트레이 | Sigma Aldrich | M0815-100EA | |
| 4웰 플레이트 | Thermo Scientific | 176740 | |
| 95웰 플레이트 F bottom | Greiner Bio | 6555180 | |
| Glas 하단 플레이트 | Ibidi | 81158 | |
| 처리 유리 마이크로피펫 | Blaubrand | 708745 | |
| 현미경 | Cell® Hamamatsu ORCA ER B7W 카메라와 Ludin Cube 및 Box가 장착된 이미징 스테이션(전동 반전 Olympus IX81 스탠드). 라이카 DMI6000 B는 라이카 DFC365 FX 카메라와 AF6000 Expert/Matrix 소프트웨어 명령 인터페이스가 장착된 Ludin Cube와 Box로 둘러싸여 있습니다. | ||
| 대물렌즈 | 올림푸스 UPLAN FL NA 0.30 공기, 9.50mm, 10X 장거리; 라이카 HC PL FLUOTAR NA 0.30 공기 11.0mm 10X 장거리 |
참고문헌
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