방법 논문

물에서 바이러스 농도에 대한 작은 볼륨 절차

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DOI:

10.3791/51744

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2015년 2월 3일

 , 
1U.S. EPA

이 논문에서

요약

인간 아데노바이러스의 스파이크를 사용하여 소량의 물 샘플에 대한 최적의 바이러스 농도 조건을 식별하기 위한 접근 방식이 개발되었습니다. 여기에 설명된 기법은 다른 바이러스 표적에 대한 농도 매개변수를 식별하는 데 사용되며 대규모 바이러스 농도 실험에 적용됩니다.

초록

바이러스의 소규모 농도(시료 부피 1-10L, 여기서는 스파이크 100ml 물 시료로 시뮬레이션)는 바이러스 농도에 대한 최적의 매개변수를 식별하는 효율적이고 비용 효율적인 방법입니다. 바이러스는 여과(전기 양성, 전기 음성, 유리솜 또는 크기 배제)를 사용하여 물에서 농축된 다음 쇠고기 추출물로 2차 농축하여 필터 표면에서 바이러스를 방출하고 마지막으로 3차 농축하여 5-30ml 부피의 바이러스 농축물을 생성할 수 있습니다. 최적의 농도 절차를 확인하기 위해 두 가지 다른 전기 양성 필터(유리/셀룰로오스 필터[1MDS] 및 나노 알루미나/유리 필터[NanoCeram])와 서로 다른 2차 농도 기술을 평가했습니다. 세 가지 다른 셀라이트 입자 크기(미세, 중간 및 대)를 평가한 후 이 기술을 확립된 유기 응집 방법과 비교하는 Celite 기술. 또한 다양한 용출 첨가제가 필터 표면에서 아데노바이러스(AdV) 입자의 방출을 향상시키는 능력에 대해 평가되었습니다. 미립자 셀라이트는 2차 농축 중에 바이러스 스파이크가 추가되었을 때 확립된 유기 응집 방법과 유사한 수준의 AdV40 및 41을 회복했습니다. 유리/셀룰로오스 필터는 나노 알루미나/유리 섬유 필터에 비해 AdV40 및 41 모두에서 더 높은 수치를 회수했습니다. 통계적으로 유의하지는 않지만, 0.1% 폴리인산나트륨 수정 쇠고기 추출물 용리액을 첨가하면 수정되지 않은 쇠고기 추출물에 비해 AdV 입자가 10% 더 많이 회수되었습니다.

서론

인간의 장내 바이러스는 수 인성 질병에 1-3의 중요한 원인이 요원하지만, 농도없이 자신의 검출이 어려워 일반적으로 오염 된 환경 바다에서 낮은 숫자에 존재한다. 바이러스를 농축하는데 사용 된 절차는 일반적으로 필터 용출액 여과 필터 뒤에 용출 단계, 및 보조 농도를 포함한다. 일반적인 여과 절차 (최근 4,5 검토) 등 전기 양성 필터와 같은 충전 세포막의 사용에 의존한다. 이 필터는 필터 표면 (양전하)과 대상 바이러스 입자 사이의 정전 기적 상호 작용을 사용하여 물에 현탁 바이러스를 캡처에 의존 (음전하). 시판되는 두 전성 필터가이 기술에 의존하는, 유리 / 셀룰로오스 나노 알루미나 / 유리 섬유 필터. 유리 / 셀룰로오스 필터 비용이 유리 (/ CE)의 사용을 제한하는 최대 10 배 나노 알루미나 / 유리 섬유의, 아르일상 바이러스 모니터링을위한 llulose 필터. 최근 연구에 싼 필터 대안의 사용을 정당화 차이가 주변 물 6,7에서 엔테로 바이러스의 회복이 두 필터 사이의 공칭 결론을 내렸다. 이러한 전성 유리 양모 필터와 같은 다른 필터 옵션 그러나, 그들은 하나의 소스 물 (전기 음성 필터)의 전처리가 필요하거나 (유리 양모 필터) 상업적으로 사용할 수 없습니다, 연구되고있다. 바이러스 농도 절차의 개발은 주로 물에서 바이러스 회수율을 향상시키기 위하여 기본 농도 기법 (필터)의 최적화에 초점을 맞추고있다. 그러나 볼륨 밀리리터 전형적으로 1 L로부터 얻은 용출액 부피를 감소 이차 농도 절차는 또한 바이러스 회수율 8에 상당한 영향을 미칠 수있다.

장용성 바이러스의 농도는 일반적으로 보조 소고기 추출물 일부 유형으로 응집제에 의존 (유기 floccu만큼은) 또는 무 지방 우유 응집 9-12 필터 표면에서 바이러스 입자를 제거합니다. 최근, 셀 라이트 (미세 입자)의 첨가와 결합 쇠고기 추출물을 사용하여 다른 농도 차 절차는 아데노 바이러스, 장내 바이러스, 및 노로 8,13,14의 회수 가능성을 보여 주었다. 이 바이러스 입자에 유기 응집 방법과 유사한 원리 하에서 셀 라이트 농도 작품에 부착 및 현탁액의 pH를 변경하여 입자 (플록 또는 셀 라이트)로부터 방출된다. 이 두 차의 농도 기술 사이의 비교가 아군 아데노 바이러스 (ADV) 유형 40, 41 (8)의 회복으로 평가되고있다.이 연구는 두 개의 보조 농도 기술은 아데노 바이러스의 복구에 통계적으로 차이가 없었다 결론을 내렸다. 그러나, 유기 응집 방법은 30 분을 필요로한다. pH가 3.5에서 배양, 셀 라이트 기술은 pH가 4.0에서 짧은 배양 (10 분)을 필요로한다. 유기 flocculat이온도 급 농도 중에 플록 입자를 수집 비싼 실험 장비 (원심)의 사용을 필요로, 반대로 셀 라이트 기술은 현탁액으로부터 셀 라이트 입자를 분리하는 기본적인 실험 장비 (진공 여과)를 사용한다.

필터와 이차 용출 기술 특정 조합은 또한 바이러스 회수율에 영향을 미칠 수있다. 한 연구는 주 (전기 양성 필터)의 특정 조합 및 보조 농도 기술 (셀 라이트 또는 유기 응집이) 아데노 바이러스 (13)의 회복에 상당한 영향을 미쳤다 결론을 내렸다. 이러한 연구 결과는 이러한 기술을 사용할 때 그 최적화가 최적으로 주어진 물 행렬로부터 대상 바이러스를 회수하기 위해 필요한 제안한다. 최적화는 여러 변수 (필터 유형 / 브랜드, 산도 용출 용액, 셀 라이트 / 유기 응집을) 평가되기 때문에, 힘든 과정을 많은 연구자들이 적극적으로 방지 걸리는 시간입니다.

이 초간각 바이러스 유형 고유 캡시드 형태 및 특정 캡시드 전하 보여주는데 tudy이 절차는 아마도 아군 인간 아데노 바이러스를 40 균주 41 이용한 물에서 바이러스 농도에 대한 최적의 조건을 식별하기 위해 개발되었다 농도 프로토콜은 모든 바이러스에 대해 최적화 될 필요가있다 최적 바이러스 복구를 달성하기 위하여 대상. 1) 전기 양성 필터 2 다음에 디스크) 보조 농도 셀 라이트 기술에 비해 설립 유기 응집 방법의 평가를 사용하여 수돗물의 바이러스 복구를 평가, 그리고 3) 평가 :이 연구는 ADV (40)에 의해 41 농도에 대한 접근 방법을 제공합니다 차 농도에 대한 용출 버퍼.

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프로토콜

유리 및 필터 하우징 1. 준비

  1. 특별히 언급하지 않는 한, 15 분 동안 121 ° C에서 모든 유리, 필터 하우징 및 솔루션을 소독. 불임을 보장하기 위해 모든 개구 또는 알루미늄 호일 또는 이전 살균에 테이프 확보 종이 중 하나에 노출 된 표면을 커버합니다.
  2. 1 L 사이드 암 삼각 플라스크에 필터 하우징 (47mm 직경)를 부착하여 여과 장치를 조립합니다. 필요한 필터를 수집 : 47mm 직경 전기 음성 / 전기 양성 디스크 필터를.
  3. 1 L의 1.5 %의 쇠고기 추출물 준비 (응집을 플록 입자를 생성 용액의 pH를 3.5, 또는 비 응집 저하되면, pH를 3.5에서 골재를하지 않는) 비프 엑기스 15g에 용해시켜, 0.05 M 글리신, 1 탈 이온수의 L과 3.75 g 글리신을 추가.
    주 : 비 응집 쇠고기 추출물 전에 급 농도 셀 라이트의 첨가를 필요로 할 것이다.
  4. 용출 첨가제 나트륨 polyph 추가0.1 % 농도에서 쇠고기 추출물 osphate.
  5. 1 M 염산 용액을 첨가 쇠고기 추출물, 원하는 산도로 pH를 혼합 용액에 적가 하였다. 121 ℃에서 15 ~ 30 분간 오토 클레이브 쇠고기 추출물.
  6. 잘, 매체, 또는 (비 응집 쇠고기 추출물 만 함께 사용) 큰 입자 셀 라이트 0.1 g을 측정합니다.
  7. 삼각 부착 플라스크에 진공 출구에 대응 튜브를 부착함으로써 진공 / 흡착을 준비한다.

솔루션 및 바이러스 재고 2. 준비

  1. 1 M HCl을 1 L를 준비합니다.
  2. 1 M NaOH를 1 L를 준비합니다.
  3. 1X PBS 용액을 준비합니다 (137 mM의 NaCl을, 2.7 mM의 KCl을, 1.47 mM의 K 2 PO 4, 4.3 mM의의 NaH 2 PO 4).
    1. 1 M의 NaOH를 사용하여 9.0 1X PBS의 산도를 조정합니다.
  4. 준비하고 9 ㎖의 PBS (PH와 재고 바이러스 1 ㎖를 혼합하여 10 4 -10 5 가장 가능성있는 수 (MPN) ml의 -1 스톡 바이러스를 희석7), 8, 13을 앞서 기재된. 1 ml의 분취 량에서 -80 ° C에서 보관.
    1. 잠재적 오염물을 제거하기 위해 필터링 주사기 (0.22 ㎛의 공극 크기)에 의해 바이러스 스톡 멸균.
  5. 탈 염소 수돗물
    1. 측정 값을 이용하여 무균 살균 수돗물 1 L 눈금 실린더 및 자기 교반 막대를 함유하는 2 L 비이커에 붓는다.
    2. 티오 황산나트륨 0.7 g을 추가하고 입자가 용해 될 때까지 섞는다. 1 M 염산 또는 1 M NaOH 용액을 사용하여 필요한 경우 7-7.5에 수돗물의 산도를 조정합니다.
    3. 해동 바이러스 스파이크 (1 mL) 및 탈 염소 살균 수돗물 1 L로 스파이크의 전체 볼륨. 10 분 동안 혼합한다.
    4. 스파이크 된 샘플과 동일한 방법으로 각각의 실험 과정에있어서 블랭크 (아데노 않고 탈 염소 수돗물)을 준비한다.

밀리 포어 필터 장치의 제조 3

  1. 필터 하우징을 통해 멸균 덮개를 제거합니다. 확인필터 하우징 상부 그릇과 낮은 필터 스크린 사이의 적절한 맞춤 여과시 시료 누출을 방지 할 수 있습니다.
  2. 1 L 삼각 플라스크에서 멸균 덮개를 제거합니다. 좋은 도장을 만들어, 필터 유닛의 코르크 삼각 플라스크의 상단 구멍에 꼭 맞는지 확인합니다.
  3. 낮은 필터 화면에서 필터 유닛 위에 그릇을 제거하고 멸균 집게로 화면을 통해 정면으로 47mm 전기 양성 필터 디스크를 넣습니다. 화면 하단에 필터 하우징 그릇을 부착하고 시계 반대 방향으로 비틀 어서 제자리에 고정.

4. 물 여과 (기본 농도)

  1. 바이러스 100 ml의 멸균 졸업 된 실린더 사용하여 수돗물 아군 측정한다.
  2. 바이러스 100ml를 47mm 플리츠 유리 / 셀룰로오스 필터 또는 나노 알루미나 / 유리 섬유 디스크 필터를 포함하는 필터 하우징 내로 수돗물 아군 붓는다.
  3. 물이 천천히 필터를 통과하도록 허용합니다. 오 남아있는 잔여 물을 제거하기 위해 부드러운 진공 적용필터 표면에서 F 수돗물.
  4. 트립신 처리를 사용하는 경우, 표면을 필터링하고 5 분 동안 배양 0.25 % 트립신 5 ㎖를 추가합니다.
  5. 멸균 탈 50 ml의 물을 사용하여 필터 표면에서 트립신을 씻으십시오.

필터 5. 바이러스 용출

  1. 2 L 삼각 플라스크에서 필터 하우징을 제거하고, 250 ml의 사이드 암 플라스크에 배치합니다.
  2. 눈금 실린더를 사용 하 쇠고기 추출물 100 ㎖를 측정한다. 천천히 필터 하우징에 쇠고기 추출물 100 ㎖를 붓는다.
  3. 쇠고기 추출물은 작은 (250 ml)을 삼각 플라스크에 쇠고기 추출물을 캡처, 필터를 통해 붓는다. 필터에서 잔류 쇠고기 추출물을 뽑아 진공을 적용합니다.

6. 셀 라이트 보조 농도

  1. 볶음 판에 용출 된 바이러스를 포함하는 전송 플라스크. 약간의 소용돌이를 만들 혼합, 교반 접시에 무균 자기 교반 막대와 장소를 추가합니다.
  2. 셀 라이트 0.1 g을 넣고쇠고기 추출물 100 ㎖에 분말과 셀 라이트를 분산 할 수 있습니다. 쇠고기 추출물로 멸균 산도 프로브를 놓습니다.
  3. pH가 4.0을 달성하기 위해 쇠고기 추출물에 현명한 1 M 염산을 떨어 추가합니다. 천천히 10 분 동안 혼합 할 수 있습니다.
  4. 2 L 삼각 플라스크를 사용하여 (전술 한 바와 같이) 필터 하우징 상에 47mm 프리 필터를 놓습니다.
  5. 프리 필터를 통해 100 ml의 쇠고기 추출물 / 셀 라이트 혼합물을 붓고. 쇠고기 추출물을 통해 붓는다. 필터에서 잔류 쇠고기 추출물을 뽑아 약간의 진공을 적용합니다.
  6. 필터 하우징 배출구의 끝에 금속 튜브 클립을 놓습니다. 금속 튜브 클립에 멸균 15 ml의 폴리 프로필렌 수집 튜브를 연결합니다. 다시 삼각 플라스크에 넣고 필터 하우징을 놓습니다.
  7. 프리 필터에 포집 셀 라이트를 통해 1X PBS 버퍼 5 ㎖, pH가 9.0를 추가합니다.
  8. PBS는 프리 필터를 통해 물방울을 허용합니다. 15 ml의 수집 관에 잔류 PBS를 통해 당기하려면 약간의 진공을 적용합니다.

7. 유기 응집 보조 농도

  1. 볶음 판에 용출 된 바이러스가 들어있는 비커를 전송합니다. 쇠고기 추출물을 100 ml의 멸균 자기 교반 막대를 추가하고 약간의 소용돌이를 만들 섞는다.
  2. 쇠고기 추출물로 멸균 산도 프로브를 놓습니다.
  3. 쇠고기 추출물 현명한 1 M 염산 드롭을 추가하고 3.5로 산도를 조정합니다. 30 분 동안 혼합한다.
  4. 4 ºC에서 15 분 동안 2,500 XG에 250 ml의 원심 분리기 원뿔 튜브에 용출액을 원심 분리기를 따르십시오.
  5. 펠렛을 방해하지 않도록 상층 액을 복용 치료를 붓고. 1X PBS, pH가 9 5ml에 펠렛을 재현 탁.
  6. 4 ºC에서 10 분 동안 4,000 XG에 현탁액을 원심 분리기. 상층 액을 붓고 펠렛을 폐기합니다.
  7. 7-7.5로 pH를 조정, 필터는 -80 ° C에서 0.22 μm의 주사기 필터 및 동결을 통해 소독.

8. 바이러스 핵산 추출

  1. 제조업체의 지침에 따라 적절한 상용 키트를 사용하여 바이러스 핵산을 추출합니다.

9. ADV 40/41 qPCR에

  1. 8, 13을 발표 한 프라이머 및 프로브뿐만 아니라, 반응 혼합물과 열 순환 프로파일을 사용합니다.
    주 : 분석의 검출의 예상 한계 반응 당 약 5 qPCR의 단위입니다.
  2. 다음과 같은 농도에서 PCR 증폭 혼합물의 구성 요소를 추가 : 10 mM 트리스 (PH 8.3)의 50 mM의 KCl을, 4.5 mM의의 MgCl 2, 10 mM의 dNTPs를, 10 μM 프라이머 1 μm의 프로브와 중합 효소 0.5 μL 그래서 45의 최종 볼륨 μL를 96- 웰 PCR 반응 플레이트 내에 웰의 적절한 수에 첨가 될 수있다.
  3. 96 웰, 빠른 반응 PCR 플레이트의 각 해당 잘으로 PCR 증폭 혼합물의 부하 45 μL.
  4. DNA의 5 μL는 PCR 플레이트의 적절한 우물에 샘플을 추출 추가합니다.
  5. , 내열성 커버 씰 플레이트를 커버 PCR 판 우물의 바닥에있는 방울을 이동 판을 회전.
  6. foll으로 설정 PCR 증폭주기OWS : 15 초 동안 95 ° C의 40주기와 1 분 60 ° C 다음에 10 분 동안 95 ° C.

10. 데이터 분석

  1. 5에서 1 : 1의 샘플에 걸친 일련의 5 배 희석액 중으로 측정 분석 (625)의 희석 범위를 바이러스 입자의 가장 가능한 번호 (MPN)을 결정하기 위해, 8, 13을 앞서 설명 된 바와 같이.
  2. 5에서 1 : 1 아데노 바이러스 실험을 걸친 일련의 스파이크 5 배 희석액을 분석 15,625 희석 범위를 바이러스 입자의 가장 가능한 번호 (MPN)을 결정하기 위해.
  3. EPA MPN 계산기 (http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html)를 사용하여, 희석의 유형을 고려하여 조정 계산기 (1 : 5 1:10), 희석 수 행하고, 숫자 일련의 희석에 샘플을 복제.
  4. 수행 볼륨 단위로 등 (예를 들면, 1 ㎖, 100 ㎖를 정규화하여 다음 데이터의 열 변형 로그 ). 샘플에 존재하는 바이러스 입자의 수​​를 나누어 주어 실험에 대한 회수율을 계산 실험 스파이크에 존재하는 바이러스 입자의 수​​에 집중하고 있습니다.
  5. 다른 실험 변수의 효과를 평가 (예를 들어, 다른 셀 라이트 타입의 pH 범위에서, 다른 필터 타입과 상이한 이차 농도 기법) (예를 들면, 짝 t 검정, 하나 또는 두 개의 파라 메트릭 또는 비 - 파라 메트릭 통계 테스트를 수행하여 ADV 회수율에 데이터의 분배 및 실험 디자인에 따라)을 - 방향 ANOVA.

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결과

셀 라이트 선택

셀 라이트의 세 가지 다른 종류의 이전 실적이 가장 좋은 변종의 선택을 시험 하였다. 중간 크기의 입자를 미세과 Celites 가장 높은 아데노 바이러스 복구를 생산했다. 큰 celites의 사용은 AdV40 41 (범위 32 % -100 %) (그림 1) 모두 회수율 결과. 아데노 바이러스 (40)의 평균 회수율은 1백44퍼센트 ± 52 % (미세), 115 % ± 28 % (중간) 및 82 % ± 53 % (대형) 입자 celites 있었다 AdV41, 1백32% ± 39 % (미세), 83 % ±에 대한 25 % (중) 11 % (대형) ± 50 %. 일방향 ANOVA는 최적화 된 셀 라이트 기술은 각각 19 % 및 109퍼센트 ± 16 %, ± 75 %를 회수 유기 응집 방법의 것과 AdV40 (P = 0.7920) 및 41 (P = 0.1439)의 통계적으로 유사한 수준을 회복 ...

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토론

전기 양성 필터는 물에서 바이러스를 집중에 유용하다; 그러나 이러한 필터는 다시 자신의 효과를 변경할 수있는 그들의 구조와 구성이 다를 수 있습니다. 이 문제를 복잡하게, 캡시드 구조와 요금 농도 기술은 최적의 복구 (15)을 보장하기 위해 맞출 필요 바이러스 균주에 따라서 다릅니다. (예를 들어, 전기 양성 필터, 쇠고기 추출물 용출), 대상 바이러스의보다 효과적인 농도 (16, 17)을 달성 할 수있는 기존의 농도의 단순한 변형 기법 스루.

지금까지 연구는 일반적으로 기본 농도 (필터) 단계를 수정하여 바이러스의 회복에 초점을 맞추고있다,하지만 약간의주의는 바이러스 복구 (18)에 영향을 줄 수있는 후속 농도 절차에 주어졌다. 이것은 다른 기법 이차 농도 바이러스 회수율 6,13,19,20 영향을 미칠 수 있음을 입증되었다. CELI빠르고 간단한 시료 처리 절차를 사용하는 동안 ...

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공개 사항

경쟁하는 금전적 이해관계가 없습니다.

이 기사에 표현된 견해는 저자의 견해이며 반드시 미국 환경 보호국의 견해나 정책을 반영하는 것은 아닙니다. 상표명 또는 상업용 제품에 대한 언급은 사용에 대한 보증 또는 권장을 구성하지 않습니다.

감사의 글

원고를 검토해 주신 Nicholas J. Ashbolt 박사와 G. Shay Fout 박사에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
아데노바이러스 40 주식ATCCVR-931
아데노바이러스 41 주식ATCCVR-930
티오황산나트륨Fluka Chemical Co.72051
Celites #577플루카 케미컬22142
NanoCeram 47mm아르고나이드N/A
1MDS 47mm3M6408502
AP-20 프리필터 47mmMillipore Corp.
글리신 Sigma50046-1KG
폴리인산나트륨아크로스 유기물390930010
트립신Gibco25200
PBS시그마P5368
염산피셔A481-212
BBL 쇠고기 추출물BD Biosciences212303
Difco 쇠고기 추출물BD Biosciences211520
ABI 7900 Real-time PCR 시스템ABIN/A
스테인리스강 필터 하우징Millipore Corp.
혈액 DNA 추출 키트Qiagen 51104
EPA MPN 계산기http://www.epa.gov/nerlcwww/online.html
AP2004700XX2004720

참고문헌

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