방법 논문

신경 세포주에 신경 독성과 신경에 관여하는 분자 진학의 윤곽을하는 도구로 실시간 임피던스 기반의 세포 분석기

DOI:

10.3791/51748

⸱

2014년 8월 9일

 ,  , 
1University Clinics for Child and Adolescent Psychiatry, University of Zürich

이 논문에서

요약

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개선된 체외 신경독성 분석은 새로운 신경보호 화합물을 식별하는 데 도움이 될 것입니다. 신경 세포주에서 세포 독성 및 세포 보호를 결정하고 두 번째 메신저 경로의 관여를 설명하여 신경 보호 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위한 실시간 임피던스 기반 세포 분석기의 유용성을 제시합니다.

초록

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많은 뇌 관련 질환은 병태 생리에 관여하는 신경 세포의 죽음이있다. 약물과 신경 / 신경 독성의 분자 메커니즘에 대한 통찰력을 확보하고 잠재적으로 신약 개발을 촉진 할 수 있습니다 도움이 될 관련 다운 스트림 경로의 신경 또는 신경 독성 효과를 연구하기 위해 체외 모델에서 개선. 그러나, 기존의 많은 시험 관내 독성 분석법은 중요한 제한이 - 가장 안 시간 코스 및 효과의 동력학을 관찰 할 수 있도록, 하나의 시점에서 신경 보호 및 신경 독성을 평가한다. 또한, 실시간으로 신경 보호에 관여하는 신호 전달 경로 다운 스트림에 대한 정보를 수집 할 수있는 기회는 매우 중요하다. 현재의 프로토콜에서는 라벨없는 실시간 condit하에 신경 세포주에서 세로토닌 2A (5-HT의 2A) 수용체 작용제의 신경 보호 효과를 결정하기 위해 실시간 임피던스 기반 세포 분석기의 사용을 설명임피던스 측정을 이용하여 이온. 더욱이, 우리는 제 메신저 경로의 억제제는 신경 보호 효과에 관여하는 분자 스트림을 묘사하기 위해 사용될 수 있음을 보여준다. 우리는 또한 세포 증식에​​ 영향이 관찰 된 신경 보호 효과에 기여 여부를 확인하려면이 기술의 유틸리티를 설명합니다. 시스템은, 웰의 바닥 표면에 금 미세 전극 배열을 교대 셀 센서로서 포함 E-플레이트라고도 특수 마이크로 플레이트를 이용한다. 임피던스 읽기가 부착 세포, 세포 생존, 형태, 및 접착 숫자로 변경된다. 셀 인덱스라는 무 차원 파라미터는 전기 임피던스 측정으로부터 도출되고, 상기 셀의 상태를 나타내는 데 사용된다. 전반적으로, 실시간 임피던스 기반 세포 분석기는 더 기여 실시간, 신경 보호 및 신경 독성의 라벨없는 평가, 및 제 메신저 경로 개입의 평가를 허용치료 후보를 선택하기위한 시험 관내에서 잠재 신경 화합물의 상세하고 높은 처리량 평가.

서론

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신경 세포의 사멸이 많은 뇌 관련 질환의 병태 생리 1에서 중요한 역할을한다. 체외 독성 분석의 신뢰성 및 높은 처리량의 가용성은 신경 독성의 메커니즘에 대한 통찰력을 얻기 위해 약물 개발이의 치료 후보로 신경 분자를 선택하기 위해 매우 중요합니다. 그러나 가장 널리 운동 해상도를 허용하지 않는 하나의 시간 시점에서 신경 독성 / 신경을 평가 체외 신경 독성 assays.They 사용에 많은 제한이있다; 종종 신호 전달 경로를 방해하고 같은 세포 집단에서 추가 연구를 제한하고, 종종 노동 집약적이며, 많은 경우에 기계적인 통찰력을 제공하지 않습니다 수 있습니다 라벨 또는 프로브를 사용합니다. 본 연구에서 우리는 실시간 미만 신경 세포주에서 세포 독성 및 신경 보호를 결정하기 위해 실시간 임피던스 기반 세포 분석기의 유용성을 증명 라벨없는조건 효과에 관련된 제 메신저 경로의 분석을 통해 하류 메커니즘에 대한 통찰력을 제공하고.

이전의 연구는 표준 기법 3,4,5,6 비해 세포 독성은 물론 세포주에서 세포 증식에 미치는 영향을 결정하기 위해 실시간 세포 분석의 유효성을 확인했다. 예를 들어, 상관 관계는 기저 증식 조건 ....

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프로토콜

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1 준비

  1. 37 ° C에서 5 % CO 2 세트 조직 문화 인큐베이터에서 실시간 세포 분석기의 역을 놓습니다. 멸균 조건 하에서 조직 배양 후드 내의 모든 세포 배양 처리 및 약리 치료를 수행한다.
  2. NOTE : 표준 배양 조건에 비해 서로 다른 온도 설정을 필요로하는 신경 세포 라인, 그에 따라 조정되어야한다. 약하게 부착 세포주를 들어, E-96 플레이트의 웰의 바닥에 금 미소 전극과 세포의 상호 작용을 용이하게하기 위해 코팅제를 사용한다.
  3. (적당한 용매에 신경 보호제 또는 두번째 메신저 경로 억제제 - 디메틸 설폭 사이드 또는 멸균) 1000 배 스톡 세포 배양 치료를위한 약물 화합물의 솔루션을 준비하고 -20 ° C에 저장합니다. 다음과 같은 치료에 차량과 같은 용매를 사용합니다.
  4. DMEM / F1 문화 인간 신경 모세포종 SK-N-SH 세포이 매체는, 약 75 %의 밀도로 175cm 2면과 세포 배양 플라스크에서 10 % 태아 소 혈청 (FBS) (증식 배지)로 보충. 세포 증식 및 세포 독성에 대한 응답 속도의 관점에서 실험 사이의 일관성을 확인하기 위해 (약 10 유로의) 범위 내에서 세포 통로 번호를 유지합니다. 하부 통로 번호가 바람직하다.
  5. PBS에....

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결과

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혈청 부족은 실시간 셀 분석기로 연속적으로 모니터링 할 수있다 셀 인덱스 값에서 감소하는 리드

세포 신경 독성 자극 제시된 기법 및 특정 신경 독성 자극과 연구 세포 유형에 의존하는 역학과 실시간으로 모니터링 할 수있다 셀 인덱스 값의 저하를 초래할.도 2의 증가를 보여 SK-N-SH 세포는 고원 (녹색 선)과 박탈 매체 (빨간 선) 혈청하는 세포를 전환 한 후 새로운 낮은 수준에서 안정화 한 다음 세포 지수의 하락에 도달 할 때까지 증식 배지에서 재배되는 셀 인덱스입니다. 이 드롭 인해 혈청 철수 세포 접착 성 변화를 나타낼 수있다.

약물 치료의 신경 보호 효과는 실시간 셀 분석기로 연속적으로 모니터링 할 수있다

"> 동시에 (동시 처리) 또는 신경 독성 자극 후 (셀 회수 제안)에서 (전처리) 전에 첨가 화합물의 신경 .......

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토론

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현재 프로토콜은 연속적 및 라벨없는 조건에서 신경 세포주에서 화합물의 신경 / 신경 독성 효과를 평가하기 위해 상기 효과에 관련된 제 메신저 경로에 대한 통찰력을 얻기 위해 실시간 셀 분석기의 유틸리티를 제공한다.

세포 독성 및 세포 증식에​​ 대한 약물의 효과를 연구하기 위해 실시간 셀 분석기 효용은 일반적으로 인식 되더라도, 단지 몇 연구는 신경 관련 세포 유형에서 사용했다. GALANTE 외.은, 도시 한 상태에서 우리는 이전에 그것의 신경 독성을 평가하기 위해 사용될 수 있으며, 인간 신경 아세포종 SK-N-SH 세포에서의 5-HT 2A 수용체 작용제의 신경 보호를 모니터링하는 실시간 셀 분석기의 유용성을 보여 주었다 인간 신경 모세포종 SH-SY5Y 세포 7,10 베타 - 아밀로이드 펩타이드. 최근의 연구는 실시간 셀 분석기 측정하면서 안정적으로 증식과 세포 사멸 세포를 제안했다euronal 세포주 및 신경 전구.......

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공개 사항

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현재 비디오 기사에 대한 출판 비용은 "ACEA 생명 과학"에 의해 후원되었다.

감사의 글

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연구에 제시된 실험에 대한 재정적 지원은 스위스 국립과학재단의 Marie Heim-Vögtlin 프로그램에서 제공되었습니다.

실시간 세포 분석기 데이터에서 통계적으로 유의미한 차이를 스크리닝하기 위해 수정된 MATLAB 프로그램 세트를 개발한 Johanna Nyffeler와 유익한 토론을 해주신 Yama Abassi 박사님께 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
xCELLigence  RTCA SP 시스템 번들ACEA Biosciences번호: 00380601030RTCA 분석기, RTCA SP 스테이션 및 RTCA 제어 장치로 구성
E-plate 96ACEA Biosciences번호: 05232368001RTCA SP Station
SK-N-SH 세포ATCC (LGC 표준과 협력하여)HTB-11다른 관심 있는 부착 뉴런 세포선으로 대체될 수
. DMEM/F12 Sigma-AldrichD8437세포 배양 배지
태아 소 혈청Life Technologies16140-063보충제 증식, 혈청 박탈 배지는 아님
조직 배양 플라스크 T175Sarstedt83.1812.302나중에 E-Plate 96
0.05% Trypsin-EDTALife Technologies25300-054에 도금될 세포 배양용조직 배양 플라스크에서 배양된 세포의 트립신화용
Scepter 2.0 cell counterMerck MilliporePHCC20060Automated cell counter
Phosphate-buffered salineLife Technologies10010-015세포 세척용
(±)-DOI 염산염Sigma-AldrichD1015-HT2A 세포 배양 치료용 작용제
LY-294002 염산염Sigma-AldrichL9908PI3-K 억제제 세포 배양 치료용 
세포 배양 처리를 위한 5-HT2A 작용 활성을 가진리수리드Tocris Bioscience4052
LY-294002 및 리수리드 말레산염 용해용디메틸 설폭사이드시그마-알드리치D4540
에 삽입된 세포 배양을 위해 있습니다 말레산염 화합물

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Cavallucci, V., D'Amelio, M. Matter of life and death: the pharmacological approaches targeting apoptosis in brain diseases. Curr. Pharm. Des. 17 (3), 215-229 (2011).
  2. Bull, S. HPA CHaPD 001: Review of Environmental Chemicals and Neurotoxicity. Focus on Neurological Diseases. , Health Prot....

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E Plate2A

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