효모, 사카로 미세스 세 레비 시아는, 엔도 좀 시스템의 생합성과 기능을 조절하는 유전자를 확인하고 연구하는 중요한 모델 생물이다. 여기에서 우리는 초 미세 구조 연구를위한 엔도 좀 구획의 특정 표시에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다.
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이 논문에서
요약
초록
엔도 좀은 진핵 세포의 체크 포인트를 정렬 주요 막 중 하나이며 그들은 대부분 플라즈마 막과 골지체에서 단백질의 재활용 또는 파괴를 조절한다. 결과 엔도 솜 시스템은 세포의 항상성 유지에 중요한 역할을 담당하고, 소낭 수송에 의해 상호의 소기관이 네트워크에 속하는 유전자의 돌연변이, 암 및 신경 생물학적 장애 등 심각한 병변을 일으킨다. 이는 엔도 솜 시스템의 생합성 및 조직을 기본 메커니즘을 이해하는 것이 프라임 관련성이다. 효모 사카로 마이 세스 세레 비시 애의이 작업에 중요한되었습니다. 특히 라벨과 미세 수준에서이 모델 생물의 엔도 좀의 시스템을 분석하기 위해, 우리는 여기에 실버 향상 반응을 통해 이러한 입자의 시각화 다음 spheroplasts에 의해 적극적으로 청구 nanogold 흡수에 대한 자세한 프로토콜을 제시한다. 이 방법은 가치가 너무엔도 좀의 인신 매매에 결함이있는 돌연변이의 형태 학적 검사를위한 L. 또한, 그것은뿐만 아니라 미세 시험에 적용 할뿐만 아니라 단백질 현지화 수사 immunogold labelings와 결합 될 수있다.
서론
엔도 솜 시스템 1,2 수용체 리소좀 효소 선별 수용체의 매매와 원형질막 (PM)의 리사이클을 포함한 여러 중요한 역할을 담당하고 세포의 주요 막 선별 장치이다. 엔도 좀은 세 가지 구획, 즉 나누어집니다. 초기 엔도 좀 (EE), 후반 엔도 좀 (LE)와 재활용 엔도 좀. 이 분류는 그것이 특정 마커 단백질에 자신의 형태에, 그들에 도달하는 endocytosed 소재에 소요되는 시간을 기준으로합니다. PM에서 내면화 막, 즉 단백질과 지질 이중층은, 어느 저하에 엔도 좀을 통해 리소좀에 전달 될 수 또는 재순환 될 수있다. 멤브레인은 리소좀에 계속하거나 다시 골지로 검색 할 수도 마찬가지로 골지체에서 엔도 좀으로 이송하고있다. 또한, 단백질은 경계 막 엔도 솜의 형성에 이르게하는 과정에서 내측 신진 내강 소체로 분류 될 수있다LE의 하위 범주, multivesicular 기관.
효모 엔도 솜 시스템은 비교적 덜 복잡한 높은 진핵 세포 중 하나 이상이다. 효모 엔도 좀은 EE와 LE로 구분됩니다. 그들이 리사이클 엔도 솜 또한 조직 특이 리소좀 - 관련 세포 기관을 포함하지 않는 포유 동물 세포 대조적. 결과적으로 그들은 엔도 좀 인신 매매 경로 3,4의 덜 복잡한....
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프로토콜
1. 스페 준비
- 실험의 디자인에 의해 결정되는 해당 매체의 10ml에 30 ° C에서 하룻밤 효모를 배양한다.
- 하루 후, 광도계를 사용하여 600 nm의 (OD 600)에서 문화의 광학 밀도를 측정 OD 0.2 ~ 0.4의 600에 동일한 배지에서 세포를 희석의 디자인하지 않는 기하 급수적 인 성장 단계로 성장 실험은 다른 조건이 필요합니다. 문화 OD 1 ~ 600이 때 세포는 지수 상에 있습니다.
- 50 ML 튜브에서 5 분 3,500 XG에서 원심 분리하여 세포의 10 OD 600 등가물을 수집합니다. 원심 분리 후, 상층 액을 버린다.
- 100 ㎜ 파이프 (산도 9.6) 5 ㎖, 10 mM의 디티 오 트레이 톨, 10 분 동안 30 ° C에서 배양에서 세포 펠렛을 Resuspend.
- 5 분 3,500 XG에서 원심 분리하여 다시 세포를 수집합니다. 상층 액을 버린다.
- 세포를 재현 탁 전n은 1 M 소르비톨 및 세포 용해 효소의 5 ㎎을 함유 (실험의 디자인에 의해 결정), 부드러운 30 분 동안 진탕 30 ° C의 혼합물을 배양 배지 5 ㎖.
- spheroplasts에 해당 펠릿 분....
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결과
제시된 프로토콜에 따라, 효모 엔도 좀 시스템의 형태가 전송 EM에 의해 액세스 할 수 있습니다. 그림 1에 도달하기 때문에 nanogold로 표지 된 엔도 좀 구획의 다른 유형을 보여줍니다. 은 강화 nanogold 명확 전자 고밀도 입자로 볼 수 있습니다. 실버 인핸스 반응 설정된 최적의 설정은 효모 세포의 미세 구조에 지장이없는 5 ~ 15 nm의 사이의 균일 크기 범위의 금 입자를 구비한다. 세포막뿐만 아니라, LE가 제시된 경우 multivesicular 몸에 흡수 적어도 30 분 (그림 후이 입자에 의해 도달하는 동안 초기 엔도 좀의 구획은 24 ° C에서 5 분간 배양 (그림 1A) 후 nanogold에 액세스 할 수 있습니다 1B). nanogold / 실버 향상 프로토콜과 함께 우리의 IEM 절차 8을 결합의 해상도 전력은 유엔 여기에 설명multivesicular 기관 .......
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토론
면역 전자 현미경은이 단백질이있는 사업자와 세포 소기관의 미세 해상도와 단백질의 현지화를 결합 할 수있는 기술이다. 그 구획은 형광 현미경에서와 구두점 구조를 표시하므로 효모 엔도 솜 시스템을 연구 할 때 특히 중요하다. 그것은 그것들을 구별하는 것이 곤란하다. 이러한 이유로 EM에 의해 검출 및 시간 의존적으로 세포 내 이입 경로를 입력하는 것은 매우 중요하다 프로브의 사용은 특별히 다른 엔도 좀을 표시한다. 이러한 유형의 프로브는 엔도 시토 시스 (6)의 기능을 평가하기 위해 귀중한이며 항혈청 검출 단백질 마커의 부족에 대한 대안이다.
여기에 설명 된 절차를 적극적으로 엔도 좀 구획 레이블을하는 프로브로 nanogold 청구 악용. 저온 절편 제작이 특수 장비와 기술을 필요로하지만, 제시된 프로토콜은 기술적으로 간단하고 다시 사용하지 않습니다특수 기계를 첩. 따라서 그것의 연구에 사용하고자하는 모든 실험실에 액세스 할 수 있습니다. 그러나, 몇 가지주의.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 그림의 준비와 지원 르네 Scriwanek 감사합니다. FR은 ALW 오픈 프로그램 (821.02.017 및 822.02.014), DFG-NWO 협력 (DN82-303) 및 ZonMW VICI (016.130.606) 보조금, ECHO (700.59.003)에 의해 지원된다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 파이프 (piperazin-1,4-bis (2-ethansulfensaure) | Merck, Darmstadt, Germany | 1,102,200,250 | |
| HEPES | Merck, Darmstadt, | Germany 391,340 | |
| EGTA | Sigma, St louis, MO | E4378 | |
| MgCl2· 6H2O | Merck, 다름슈타트, 독일 | 1,058,330,250 | |
| DL-Dithiothreitol | Sigma, St louis, MO | D0632 | |
| Sorbitol | Sigma, St louis, MO | S1876 | |
| 양전하를 띤 나노골드 | 나노프로브, Yaphank, NY | 2022 | -20 ° C |
| HQ-silver™ 향상 키트 | Nanoprobes, Yaphank, NY | 2012 | -20 ° C |
| 파라포름알데히드(PFA) | Sigma, St louis, MO | 441244 | |
| 글루타르알데히드 8% EM 등급 | Polyscience, Inc., Warrington, PA | 216 | -20 °에 저장; C |
| 용해 효소 | MP Biomedicals, Santa Ana, CA | 153526 | -20 °에 저장; C |
| Parafilm M | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| 50 메시 니켈 그리드 | Agar Scientific, Stansted, 영국 | G209N | |
| 극저온 면역 다이아몬드 나이프 35° | Diatome AG, 스위스 비엘 | N.A. | |
| UCT 초박절편 | 라이카, Solms, 독일 | N.A. | |
| Formvar 15/95 resine | 전자 현미경 과학, Hatfield, PA | 15800 | |
| 50 메시 니켈 그리드 | Agar Scientific, Stansted, 영국 | AGG2050N | |
| Parafilm | Sigma, St louis, MO | P7793 | |
| 그리드 보관함 | Leica, Solms, Germany | 162-50 | |
| Falcon 100 mm x 15 mm Petri dish | Corning, Corning, NY | 351029 | |
| Pasteur capillary pipettes 150 mm | Van Bruggen Glas, Rotterdam, The Netherlands | 10216234 | |
| 1.5 ml 마이크로 원심분리기 | 사르스테트, Nü mbrecht, 독일 | 72690001 | |
| 50 ml 튜브 | Bio-one, Alphen aan den Rijn, 네덜란드 | 210296 | |
| Benchkote 표면 보호기 | Whatman, Maidstone, 영국 |
참고문헌
- Gruenberg, J. The endocytic pathway: a mosaic of domains. Nat Rev Mol Cell Biol. 2, 721-730 (2001).
- Sachse, M., Ramm, G., Strous, G., Klumperman, J. Endosomes: multipurpose designs for integrating housekeeping and specialized tasks. Histochem Cell Biol.
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