방법 논문

에 가이드 생체 단일 단위 기록

DOI:

10.3791/51757

⸱

2014년 11월 7일

 , 
1Institute of Neuroscience, University of Oregon

이 논문에서

요약

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여기에서는 마취된 마우스 피질에서 확인된 억제성 중간뉴런으로부터 안정적이고 잘 격리된 단일 단위 기록을 얻기 위한 전략을 설명합니다. ChR2를 발현하는 뉴런은 청색광에 대한 반응으로 식별됩니다. 이 방법은 표준 세포 외 기록 장비를 사용하며 칼슘 이미징 또는 시각적 유도 패치에 대한 저렴한 대안으로 사용됩니다.

초록

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신경 생리에서 중요한 과제는 대뇌 피질의 다수의 억제 세포 유형의 응답 특성과 기능을 특성화하고있다. 우리는 여기 리마 1 동료들에 의해 개발 된 방법을 사용하여 마취 마우스 피질에서 확인 된 억제의 interneurons 안정적인, 잘 격리 된 단일 단위 기록을 얻기위한 우리의 전략을 공유 할 수 있습니다. 녹음은 특정 신경 세포의 소집단에 Channelrhodopsin-2 (ChR2)를 표현 생쥐에서 수행됩니다. 인구의 회원은 푸른 빛에 대한 간단한 플래시에 대한 반응으로 식별됩니다. "PinP의"이라, 또는 신경 세포 집단의 Photostimulation 이용한 식별 - -이 기술은 표준 세포 외 기록 장치로 구현 될 수있다. 이것은 유전자 식별 세포 외 기록 타겟팅 목적, 칼슘 이미징 또는 시각 유도 패치에 저렴하고 대안적인 접근이 될 수있다. H오히려 우리는 매일 연습하는 방법을 최적화하기위한 지침을 제공합니다. 우리는 parvalbumin 양성 (태양 광 +) 세포를 대상으로 특별히 우리의 전략을 정제하지만 이러한 소마토​​스타틴 (somatostatin) 발현 (SOM +)를하고 calretinin 발현 (CR +)의 interneurons으로뿐만 아니라 다른 interneuron 유형에 대해 작동하는 것을 발견했다.

서론

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포유류의 뇌를 구성하는 무수한 세포 유형을 특성화하는 것은 신경 생리학의 중심적이지만 오랫동안 파악하기 어려운 목표였습니다. 예를 들어, 대뇌 피질에서 다양한 억제 세포 유형의 특성과 기능은 큰 관심을 끄는 주제이지만 여전히 상대적으로 알려지지 않았습니다. 이는 부분적으로는 기존의 블라인드 생체 내 기록 기술이 서로 다른 세포 유형을 구별하는 능력이 제한되어 있기 때문입니다. 세포외 스파이크 폭은 흥분성 피라미드 세포에서 추정되는 파브알부민 양성 억제 뉴런을 분리하는 데 사용할 수 있지만, 이 방법은 유형 I 및 유형 II 오류가 모두 발생할 수 있습니다2,3. 또는 기록된 뉴런을 채우고, 회수하고, 염색하여 나중에 형태학적 및 분자적 정체성을 확인할 수 있지만, 이는 고통스럽고 시간이 많이 걸리는 과정입니다. 최근에는 유전적으로 확인된 억제성 중간뉴런 집단에 칼슘 이미징 또는 시각적 유도 패치 기록을 통해 접근할 수 있게 되었습니다. 이러한 접근법에서는 칼슘 리포터(예: GCaMP) 또는 형광 단백질(예: GFP)의 바이러스 또는 형질전환 발현을 통해 프로모터 발현에 의해 정의된 세포 유형을 식별하고 특성화할 수 있습니다. 이러한 접근 방식은 고가의 장비가 필요한 2광자 현미경을 사용하며 뇌 조직의 광 산란 특성으로 인해 표재성 피질층에 국한됩니다.

최근 Lima와 동료들1은 생체 내에서 유전적으로 식별된 신경 세포 유형에 대한 전기생리학적 기록을 목표로 하는 광유전학의 새로운 응용 프로그램을 개발했으며, 이를 "PINP" 또는 Photostimulation-assisted Identification of Neuronal Populations라고 합니다. 기록은 특정 신경 세포 하위 집단에서 Channelrhodopsin-2(ChR2)를 발현하는 마우스에서 수행됩니다. 인구의 구성원은 짧은 푸른 빛의 섬광에 대한 반응으로 식별됩니다. 다른 많은 광유전학 응용 분야와 달리 목표는 회로 기능을 조작하는 것이 아니라 단순히 유전적으로 정의된 부류에 속하는 뉴런을 식별하여 정상적인 뇌 기능 중에 특성화할 수 있는 것입니다. 이 기술은 표준 세포 외 기록 장비로 구현할 수 있으므로 칼슘 이미징 또는 시각적 유도 패치에 대한 접근 가능하고 저렴한 대안으로 사용할 수 있습니다. 여기에서는 마취된 청각 피질에서 특정 세포 유형을 PINPing하는 접근 방식을 설명하며, 보다 일반적인 점이 다른 제제 및 뇌 영역에 유용하게 적용될 수 있을 것으로 기대합니다.

피질에서 PINP는 억제성 중간뉴런의 생체 내 반응 특성을 조사하는 데 특히 유망합니다. GABAergic interneuron은 피질 뉴런의 작고 이질적인 부분 집합으로 구성됩니다4. 특정 분자 마커의 발현으로 표시되는 다양한 하위 유형은 최근 피질 회로5-9에서 다른 계산 역할을 수행하는 것으로 나타났습니다. 유전 도구가 개선됨에 따라 결국 이러한 광범위한 범주에 속하는 형태 학적, 생리학적으로 분리 가능한 유형을 구별하는 것이 가능할 수 있습니다. 여기에서 우리는 마취된 마우스 피질에서 확인된 억제성 중간뉴런으로부터 안정적이고 잘 격리된 단일 단위 기록을 얻기 위한 전략을 공유합니다. 이 전략은 파브알부민 양성(PV+) 세포를 표적으로 하기 위해 특별히 개발되었지만, 소마토스타틴 발현(SOM+) 및 칼레티닌 발현(CR+) 중간뉴런과 같은 다른 중간뉴런 유형에도 효과가 있는 것으로 나타났습니다. PINPing은 개념적으로는 간단하지만 실제로는 놀라울 정도로 단호하지 않을 수 있습니다. 우리는 시행 착오를 통해 방법을 시도하는 다른 사람들에게 유용할 수 있는 여러 가지 팁과 요령을 배웠습니다.

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프로토콜

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참고 : 오레곤 동물 관리 및 사용위원회의 대학 승인 한 다음 프로토콜은 건강 지침의 국립 연구소에 따른다.

1. 급성 수술

  1. 복강 내 (IP) 주사 (표 1)를 통해, 케타민 - medetomidine 칵테일 동물을 마취.
    참고 :이 실험에 사용 된 마우스는 드라이버 선 (; SST-iCre12, SOM의 +, CR-iCre12, CR + Pvalb-iCre11, PV +)를 interneuron하는 CRE에 의존 ChR2 - EYFP 형질 전환 line10 교차에 의해 생성됩니다. ChR2 또는 관련 opsins의 바이러스 배달 유사한 발현 수준이 얻어진다 가정, 동일하게 작동합니다.
  2. 수술을 시작하기 전에, 확인 동물 전시 부드러운 발가락 핀치에 대한 응답이. 이 깊이의 마취를 유지하기 위해 필요에 따라 실험을하는 동안 마취제를 다시 투여. 주 사용 마취제를 사용하는 경우, 선택적으로 유지 보수 주사에 대한 IP 카테터를 이식.
  3. 식염수 또는 유지 보수 주사 (표 1)에 대해 적절하게 희석 마취제 칵테일을 사용하여 예를 들어 실험을하는 동안 락 테이트 링거액 (약 3 ㎖ / ㎏ / 시간), 수화 동물을 유지합니다.
  4. 정위 또는 다른 헤드 유지 장치에서 동물을 놓습니다. 두개골이 잘 고정되어 있는지 확인합니다. 이는 안정적인 단일 세포 기록을 유지하기 위해 필수적이다.
  5. 건조를 방지하기 위해 눈에 opthalamic 연고를 적용합니다. 36.5-37 ° C의 체온을 유지한다.
  6. 추가 기록 안정성 조에 고인 드레인을 수행합니다. 메스 블레이드를 사용하여 치스 테르 나디 라티 나 마그나을 노출 두개골의 후방 얼굴에서 조직을 제거합니다. 뇌척수액을 배출하기 위해 두라에 작은 흠을 확인합니다. 블레이드 만 매우 팁을 사용하여 소뇌 나 뇌간에 문의하지 마십시오.
  7. 메스를 사용하여, 청각에 대한 (관심있는 대뇌 피질의 영역 위에 작은 개두술 (~ 2mm 2)을 수행피질, 브레 그마의 약 -2.3 mm 후방, 정중선의 4.5 mm의 측면).
  8. 경질을 제거하고 따뜻한 0.5 아가로 오스의 층으로 노출 된 피질 커버 - 1mm 두께 (식염수에 1.5 % 아가로 오스, 0.9 %의 NaCl을;에 적용 ~ 37 ° C). 주기적으로 생리 식염수를 몇 방울을 적용하여 실험을하는 동안 아가로 오스 습기를 유지합니다.

2. 녹화 환경

  1. 텅스텐 전극 준비 (7-14 MΩ, 127 μm의 직경, 12 ° 테이퍼 팁, 에폭시 코팅). 유리 모세관 튜브에 전극을 Superglue 그립 (그림 1)를위한 열 수축 튜브를 추가합니다.
  2. 대뇌 피질의 표면에 직각 여행 세트 모터 (또는 유압) 미세 조작기에 전극을 장착합니다. 두개골에 대해, 피부 아래에 지선을 밀어 넣습니다. 그들은 근전도 아티팩트를 생성 할 수있는 머리의 측면과 목 뒤쪽에 근육과의 접촉을 피하십시오.
  3. 세포 외 A를 이용하여 전기 신호를 증폭단일 단위 녹음에 적합한 리 파이 어은, 바람직하게는 임피던스 검사 모드를 갖추고 있습니다. 두 개의 오실로스코프 및 전원 스피커 세트 - 지속적인 스파이크 활동 (5,000 Hz의 대역 통과 300)를 모니터링합니다. 여기서, 기록 된 데이터는 10 kHz의 샘플링 속도로 연속적으로 디지털화되고; 스파이크는 오프라인 추출한다.
  4. 팁 피질의 표면에 도달 할 때까지 아가 통해 전극을 전진. 현미경을 통해이 단계를 관찰한다. "제로"미세 조작기에이 위치.
  5. 최고 기록의 깊이를 근사하기 위해, 시각적 침투 끝에 전극을 인출 할 때, 전극 팁은 제로의 깊이에 대뇌 피질을 종료 확인.
    참고 : 조작하는 읽기와 관찰 된 전극의 위치 사이의 불일치가 조직에 상대적으로 표류 나타냅니다. 이것은 뇌이나 동물, 또는 조작하는 드리프트의 불안정으로 인해 발생할 수 있습니다.
    1. 있는지 확인하기 위해 추가 검사로조직의 첫 번째 수백 마이크로 미터를 통해 진행하는 동안이 제로 세트 포인트가 대뇌 피질의 표면에 해당하고, 자극 유발 필드 전위를 모니터링 할 수 있습니다. 필드 전위를 모니터링 할 때, 10 Hz로 세포 외 증폭기의 하부 대역 통과 필터 컷오프 낮은. 로컬 필드 전위의 극성이 레이어 I / II 국경 근처에 13 ~ 100 ㎛의 깊이 주위에 반전 있는지 확인합니다. 이는 청각 피질 신뢰성 기준점이지만, 다른 피질 다를 수있다.
  6. 수동 미세 조작기에 푸른 빛 소스 (그림 2)에 결합 된 광섬유를 탑재합니다. 현미경을 사용하여 가능한 한 아가의 표면에 가깝게 섬유 팁의 위치. 전극이 조직을 입력 할 빔을 센터입니다.
  7. 지정된 폭과 duratio의 TTL (트랜지스터 - 트랜지스터 로직) 펄스열을 제공 할 수있는 제어 장치와, 광원의 출력을 레귤N- 예 아두 이노 (도 3), (도시 된 바와 같이) 컴퓨터 I / O 카드, 또는 시판 펄스 발생기.
    1. 모두 오실로스코프에 신호를 모니터링합니다.
  8. 파워 미터를 이용하여 광섬유의 선단부 전체 광선 전력 (MW)을 측정한다. 섬유 코어의 단면적으로 나누어 방사도 (Mw / mm 2)을 계산하기 위해이 값을 사용한다. 10의 범위의 강도 값으로 시작 - 15 mW의 / mm이 필요한 경우 생성물이 제거 될 때까지, 하향으로 조정한다.
  9. 조직을 입력 할 태세 아가로 오스의 전극, 빛 이슈를 확인합니다. 검색 펄스열을 시작합니다 (예를 들어, 30 밀리 광 펄스, 500 밀리 초 interstimulus 간격 (ISI)).
    1. 입사광의 각도를 변경하는 전극에 대하여 광섬유를 재배치함으로써 과도 광 아티팩트 (도 4)을 제거한다. 유물이 계속되면, 빛 전력을 감소하려고합니다. 일에즉 아티팩트가 완전히 (에만 최소화)을 제거 할 수없는 드문 경우에는, 탐색 펄스의 지속 기간을 연장. 이것은 사실이 신경 세포의 스파이크를 식별하는 데 도움이 될 수 있습니다.

3. 스트레이트 떠있을-에 '

  1. 약 1 ㎛ / 초의 속도로 뇌를 통해 천천히 전극을 전진. 지속적인 활동을 모니터링 한 오실로스코프를 사용합니다. 다른 한편으로, 레이저 펄스를 발생시킨다.
  2. 전극이 ChR2 + 셀을 접근 종종 전기 신호 오실로스코프에 분명 잘하기 전에 감지 할 수 있음을 나타냅니다 오디오 모니터에 빛을 유발 스파이크의 희미한 '해시'를 수신합니다. 사전의 속도를 느리게하는 효과가 있습니다.
    NOTE : 셀 전극의 경로에 직접적으로 놓여있는 경우, 광 - 유발 활성이 더 큰 (더 크게) 성장할 것이다. 전극은 단일 interneuron 접근하면, 해시는 균일 한 크기와 형태의 작지만 잘 정의 스파이크로 해결한다.
  3. 즉시 리튬 등GHT-유발 스파이크 개별적으로 오실로스코프의 오프 트리거 할만큼 큰, 그래서 일을 시작합니다. 스파이크 파형의 정확한 형상을 관찰 횡축 배율을 조정한다.
  4. 중지하고 조직이 정착 될 때까지 기다립니다. 가까운 셀에 전극을 이동하는 유혹에 저항. 이 단계는 안정된 기록 중요하다. 몇 분 후, 신호 대 잡음비가 개선되지 않은 경우 - 즉, 티슈가 가라 앉을되지만 가​​까이 전극의 선단에 세포를 가져 못한 - 미리 5 더 μm의 다시 기다린다.
    1. 피크 또는 활동 전위의 물마루 어느 확실 잡음 플로어 (예를 들어, +/- 300 μV 이상)보다 충분히 위에 설정된 전압 임계치로 캡처 될 수있을 때까지이 과정을 반복한다.
      참고 : 억제의 interneurons을 PINPing 때 가양 또는 모호함의 작은 위험이있다. 대부분의 세포는 쉽게 30 밀리의 기간 간 PUL과 펄스의 기차를 따를 수있다SE 간격 2-5 밀리 초 (그림 5)의 신뢰할 수있는 최초의 스파이크 대기 시간이 500 밀리 초, 또는 빠르고. PV + 세포의 대부분은, 특히, 전체 1 초 (그림 6)에 대한 발사 유지할 수 있습니다. 이러한 억제 뉴런 때문에, disynaptic (경유) 활성화는 큰 문제가되지 않습니다.
  5. 녹음하는 동안, 최초의 오실로스코프에 지속적인 활동을 모니터링 할 수 있습니다. 크기와 두 번째 오실로스코프를 사용하여 스파이크의 모양에 눈을 떼지. 스피커에 자신의 소리의 품질을합니다.
    1. 셀이 중 하나 (이 찔려 죽은 또는 손상 위험이) 전극에 너무 가까이 도면을 나타냅니다 급격한 변화에 대해주의 깊게 듣거나 떨어져 표류한다. 스파이크가 크고 왜곡되는 경우, 백 아웃; 이들이 작은 커지면, 전극을 전진. 2 μm의 단계로 천천히 이동합니다.
    2. 정점 또는 저점에 정렬 된 모든 스파이크 파형을 중첩하여 기록 사후의 품질을 확인합니다. 전압 Thres를 비바리보유. 임계 값의 넓은 범위에 걸쳐, 오직 일정한 높이 (도 5a)의 일관된 스파이크 형상이 있어야한다.
  6. 어떤 지점에서 신호가 인접 신경 세포에서 스파이크에 오염 될 경우, 이동합니다. 전극은 인접 셀의 범위 밖에 통과하지만, 표적 뉴런의 범위 내에 남아있을 오프 기회에 천천히 전진. (이것은 일반적으로 성공하지 못합니다.)
  7. 각 침투 피질 (900+ μm의)의 전체 깊이를 통해 전극을 이동합니다. 더 빛 응답 뉴런 반대로, 녹음 정기적으로 이웃 ChR2- 세포의 스파이크에 오염 된 많은 침투 또는 후에 발생하지 않으면, 새로운 전극을보십시오.
    참고 : 단 한 번의 일괄 처리 내 개별 전극의 임피던스 및 팁 형상 상당히 다를 수 있습니다. 두 요인 ㅁ - 빛 유발 스파이크를 감지 할만큼 충분히 커야합니다 전극의 유효 "듣고 반경"에 기여ILE 검색은 아직 분리에서 하나의 interneuron을 기록 수 있도록 충분히 제한.
  8. 원하는대로 전극의 임피던스를 테스트합니다. 조직의 손상을 방지하기 위해, 아니라 뇌 밖에, 아가로 오스 층의 상부에 전극의 끝으로이 작업을 수행. 7-14 MΩ의 범위 내에서, 정확한 임피던스는이 애플리케이션에 대한 성능, 또는 수율의 확실한 예측 아니다. 즉, 수신 반경을위한 합리적인 프록시의 말했다 : 낮은 임피던스 전극 이상의 유닛을 선택, 높은 임피던스, 적은.
  9. 실험의 끝에, 이러한 마취 깊이 평면 아래 마취제 과다, 또는 경추 탈구 등 제도적으로 승인 된 수단에 의해 동물을 안락사.

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결과

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우리는 여기에 "리마 등. 한. 표 1 세부 제안 마취 칵테일, 케타민-Medetomidine - 아세 프로 마진을 (가 개발 한 optogenetic 방법을 사용하여, 마취 마우스 피질에서 유전 분류 억제의 interneurons에서 단일 단위 기록을 얻기위한 우리의 전략을 공유 KMA ").도 1은 도표 4. 3 아두 이노 마이크로 컨트롤러와 광 출력 게이팅위한 구성 및 코드를 포함하는도.도 2는 간단한 LED 제어부위한 회로도 포함 도표. 녹음 준비 텅스텐 미세 전극을, 도시의 예를 도시 빛에 의한 전기 유물 프로토콜에 대해 논의했다. 유물은 때때로 (왼쪽 패널)가 발생하지만, 쉽게 (오른쪽 패널) 수정됩니다. 5 광학 식별의 interneurons의 세 가지 유형 (태양 광 +, CR +,와 솜 +)에서 예를 들어 녹음을

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토론

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떠있을 개념적으로 간단하지만, 실제로 문제가 될 수 있습니다. 성공의 주요 결정은 전극의 선택입니다. 전기 청취 반경은 중요한 파라미터이다. 이것은 선단이 약간 먼 거리 ChR2 + 셀로부터 정지되었을 때에 하나 이에 따라 어드밴스의 속도를 조정할 수 있도록, 광 유발 스파이크를 검출하기에 충분히 커야한다. 동시에, 양호한 단일 유닛 분리 가능하도록 충분히 제한되어야한다. 즉, 전극은 이웃 ChR2- 단위에서 스파이크를 선택해서는 안된다. 듣기 반경의 관점에서 균형 눈에 띄는 것은 어떤 대상 세포 유형에 대한 도전이 될 수 있지만, 비교적 큰 세포가, 드문 드문 작은, 종종 세포 삼각뿔 부근에서 발견 억제의 interneurons, 특히 참됩니다 스파이크. 비록 여기에 제안 된 전략을 사용하여, 예상 수율이 높지 않다. 우리의 전형적인 수율은 우리의 criter 주어진, 0-2 PV + 신경 세포 / 동물이었다우수한 단일 단위 분리의 IA 및 녹음 반 시간 이상 지속.

억제 ...

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공개 사항

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저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없습니다.

감사의 글

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이 연구는 Whitehall Foundation과 NIH의 자금 지원을 받았습니다. 광 전달을 위한 회로를 설계하는 데 도움을 주고 전문 지식을 제공해 주신 Clifford Dax(University of Oregon Technical Support Administration)에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
ChR2-EYFP 라인잭슨 콜로니12569
Pvalb-iCre (PV) 라인잭슨 콜로니8069
Sst-iCre (SOM) 라인잭슨 콜로니13044
Cr-iCre (CR) 라인잭슨 콜로니10774
아가로스시그마-알드리치A9793유형 III-A, 높은 EEO
마이크로 포인트 (경막 후크)FST10066-15
수술용 가위FST14084-09
메스FST10003-12(손잡이), 10011-00(블레이드)
Puralube 안과 연고포스터 & Smith9N-76855
Homeothermic BlanketHarvard Apparatus507220F
텅스텐 미세 전극A-M 시스템57720012 MΩ AC 저항, 127 μ m 직경, 12° 테이퍼드 팁, 에폭시 코팅
모세관 유리 튜빙워너 인스트루먼트G150TF-3
열 수축 튜빙DigiKeyA332B-4-ND
Zapit 가속기DVASKU ZA/ZAA 표준 슈퍼 글루와 함께 사용.
마이크로전극 AC 증폭기 1800AM 시스템700000
MP-285 모터화된 마이크로매니퓰레이터셔터MP-285
4-채널 디지털 오실로스코프TektronixTDS2000C
파워드 스피커Harman모델 JBL  듀엣
수동 매니퓰레이터ScientificaLBM-7
800 µ m 광섬유 패치 케이블ThorLabsFC/PC BFL37-800
전력계ThorLabsPM100D(전력계), S121C(표준 전력 센서)
475nm Cree XLamp XP-EDigiKeyXPEBLU-L1-R250-00Y01DKR-NDLED의 전력 및 효율은 지속적으로 증가하고 있으므로 최신 제품(www.cree.com)을 확인하는 것이 좋습니다.
아두이노 UNODigiKey1050-1024-ND
된

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lima, S. Q., Hromadka, T., Znamenskiy, P., Zador, A. M. PINP: a new method of tagging neuronal populations for identification during in vivo electrophysiological recording. PLoS One. 4, (2009).
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  10. Madisen, L., et al. A toolbox of Cre-dependent optogenetic transgenic mice for light-induced activation and silencing. Nat Neurosci. 15, 793-802 (2012).
  11. Hippenmeyer, S., et al. A developmental switch in the response of DRG neurons to ETS transcription factor signaling. PLoS Biol. 3, 159(2005).
  12. Taniguchi, H., et al. A resource of Cre driver lines for genetic targeting of GABAergic neurons in cerebral cortex. Neuron. 71, 995-1013 (2011).
  13. Christianson, G. B., Sahani, M., Linden, J. F. Depth-dependent temporal response properties in core auditory cortex. J Neurosci. 31, 12837-12848 (2011).
  14. Povysheva, N. V., Zaitsev, A. V., Gonzalez-Burgos, G., Lewis, D. A. Electrophysiological heterogeneity of fast-spiking interneurons: chandelier versus basket cells. PLoS One. 8, 70553(2013).

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