리포터 세포주 시각화 추적 이종 집단의 관심의 세포를 분리 할 수있는 수단을 제공한다. 그러나, 유전자 - 표적 인간 배아 줄기 세포에서 종래의 상동 재조합을 사용하여 매우 비효율적이다. 여기서, 우리는 아연 핑거 클레아 향상된 상동 재조합을 사용하여 EGFP CNS 중뇌 특정 전사 인자 PITX3 궤적 타겟팅 기술한다.
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이 논문에서
요약
초록
현재 인간 배아 줄기 세포 (ESC) 분화 프로토콜을 하나의 주요 제한은 이종 세포 집단의 생성이다. 이러한 배양 관심의 세포를 포함 할뿐만 아니라 미분화 ESCS 비 신경 유도체 및 다른 신경 세포 아형로 오염된다. 이것은 시험 관내에서 이러한 약물 발견 또는 세포 대체 요법에 대한 시험 관내 모델로서 생체 애플리케이션에서의 사용을 제한한다. 이것을 극복하기 위해, 시각화 트랙과 관심 셀을 분리하는 수단을 제공 리포터 세포주는 설계 될 수있다. 종래의 상 동성 재조합은 매우 비효율적이다 통해 그러나, 인간 배아 줄기 세포에 이것을 달성한다. 이 프로토콜과 함께 뇌하수체의 호 메오 박스 (homeobox) 인간 배아 줄기 세포에서 삼 (PITX3) 궤적 사이트 별 이중 가닥 DNA 나누기를 소개 맞춤 설계된 아연 핑거 뉴 클레아 제를 사용하는 대상에 대해 설명PITX3 - EGFP - 특정 DNA 기증자 벡터입니다. PITX3 리포터 세포주의 발생에 이어, 그 다음 그러한 체외 파킨슨 병 모델링 또는 세포 대체 요법으로 연구에 사용하기 위해 발행 프로토콜을 사용하여 구별 될 수있다.
서론
현재 배아 줄기 세포 (ESC) 분화 프로토콜은 특히 특정 신경 표현형의 유도와 관련하여, 이종 세포 집단에서 발생. 배양이 원하는 세포 표현형, 다른 신경 세포가 포함되지만 이에 따라, 비 - 신경 세포와 분화되지 않은 세포 유형은 종종 하나 존재한다. 이러한 특성은 ESC의 적용 세포 대체 요법에 사용하기위한 시험 관내 및 질병 모델링 셀 소스를 유도 제한한다.
유전자 리포터 세포주 시각화 추적 관심 셀을 분리하는 수단을 제공하는, 리포터 단백질 (RP)의 발현은 내인성 발현을 재현 한한다. 유전자 코딩 영역의 바로 상류 프로모터의 사용은 유전자 조 기자를 유도하는 데 사용될 수 있지만, 이러한 구조는 내인성 유전자 발현을 제어하는 조절 요소 정확한 부족하다. 대조적으로, 상 동성 재조합이 구비기회는 RP의 고품질 표현을 보장합니다. 과거에, 관심있는 특정 유전자좌에 상 동성 재조합을 위해 설계된 벡터를 표적으로하는 DNA 1,2 전달하는 수단으로 전기 천공을 사용하여 마우스 ESCS (mESCs)에서의 RP를 대상으로 사용되어왔다. 그러나 종래의 상 동성 재조합을 통해 리포터 세포주의 생성 인간 ESCS (인간 배아 줄기) 매우 비효율적이다, 따라서 전용
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프로토콜
모든 과정은 무균 층류 후드에서 수행된다. 달리 지정하지 않는 한 모든 미디어 및 솔루션은 37 ° C 평형을하고 있습니다.
형질에 대한 (이 프로토콜에 사용되는 인간 배아 줄기 및 hiPSCs, WA-09) 인간의 PSC를 1. 확장
참고 : 마트 리겔 또는 Geltrex에 인간 배아 줄기을 확장 할 필요가 없습니다. 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)에 확장 된 인간 배아 줄기는 MEF 제거 단계 다음 일렉트로 또는 nucleofection 사용할 수 있습니다 (2.8 절 참조).
- 1 × 100mm 요리와 MEF 미디어 cm 2 당 2.0 × 10 4 세포에서 DR4 MEFs의 1 개 75cm2 플라스크를 준비 / V 젤라틴 w 0.1 %로 사전 코팅 요리에 (표 1 참조).
주 : CF1, BLK6 또는 MF1 MEFs를 사용할 수있다, 그러나, 예를 들면, DR410, 항생제 내성 MEF 라인을 사용하는 것이 권장된다. - 다음날, 100mm 접시 위에 통로 인간 배아 줄기 섹션 1.1에서 준비 MEFs가 미리 도금. 이 ASPI을 수행하려면문화 ....
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결과
PITX3와 함께 사용자 정의 설계 PITX3 아연 손가락 쌍의 공동 일렉트로에 따라 - EGFP - 특정 DNA 기증자 벡터, 이후 퓨로 마이신 선택, 양 hESC의 클론은 처음 게놈 PCR 검사 (그림 1)를 통해 검출되었다. 이러한 PCR 5 긍정적 인 클론 '및 3'특정 프로브의 남부 오 하이브리드는 19 %의 효율로, PITX3 궤적 (그림 2)의 한 엑손하는 정확한 타겟팅을 확인했다. 도 3에 도시 된 이미지는 면역 발행 PA6 간질 세포 분화 프로토콜 12,13을 이용하여 분화를 다음 PITX3 프로모터에 의해 구동 EGFP 발현을 보여준다. EGFP의 공동 현지화는 같은 FOXA2 (적색) (그림 3A)과 티로신 수산화 효소 (TH, 빨간색)으로 중뇌 도파민 신경 세포의 마커를 관찰 할 수있다 (.......
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토론
리포터 세포주의 생성은, 추적 시각화하고 인간 배아 줄기 유래의 이종 집단으로부터 관심 세포를 분리하기위한 강력한 수단을 제공한다. 그러나, 기존의 상동 재조합을 통해 표적 유전자는 인간의 ESCS 3 매우 비효율적 인 것으로 입증되었습니다. 이 프로토콜에서는 ZFNs 함께 널리 타겟팅 벡터를 이용하여 인간 배아 줄기에서 엑손 PITX3 궤적 중 하나에 RP를 도입하는 비교적 간단한 기술을 설명한다. 우리 손에서 유전자 표적 시스템 (즉, 이전에 6 출판 유사) 제대로 대상 PITX3 궤적을 포함 퓨로 마이신 내성 클론의 19 %로, 효율적입니다.
유전자 타겟팅을 용이하게하기 위해 ZFNs 사용에 제한이 집에서 처음부터 ZFNs 설계에 어려움이있다. 따라서,이 프로토콜에서 우리는 사용자 정의 취득 비용이 많이들 수 있습니다 시판 ZFNs를 디자인했다. & # 사용160; 최근 TALEN 시스템
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공개 사항
저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
이 프로토콜에 설명 된 작품은 재생 의료에 대한 캘리포니아 연구소 (CIRM)와 공동 제휴의 일환으로 빅토리아 정부에서 자금을 지원에 의해 가능하게되었다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 마우스 배아 섬유아세포(DR4) | GlobalStem | GSC-6004G | |
| 젤라틴 | 시그마 | G1393-100ML | |
| HBSS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 레드 없음(HBSS) | Life Technologies | 14175-095 | |
| Dispase | StemCell Technologies | 7923 | |
| 세포 스크레이퍼 | Corning | 3008 | |
| Accutase | Life Technologies | A11105-01 | |
| Y27632 | Axon Medchem | Axon 1683 | |
| 세포 여과기 - 40 μ m | BD Biosciences | 352340 | |
| 33 밀리미터 - 0.22 μ m 필터 | Millipore | SLGP033RS | |
| rhFGF2 | R& D Systems | 233-FB-025/CF | |
| Electroporator | BioRad | 165-2661 | |
| 0.4cm 전기천공법 큐벳 | BioRad | 165-2088 | |
| Human TV-hPITX3-forward targeting construct | Addgene | 31942 | |
| ZFN Kit; Human PITX3 | Sigma-Aldrich | CKOZFN1050-1KT | |
| Puromycin | InvivoGen | ant-pr-1 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Geltrex | Life Technologies | A1569601 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | |
| Dulbecco의 Modified Eagle Medium (DMEM) | Life Technologies | 10566-016 | |
| 소 태아 혈청, 적격, 열 불활성화, 미국 원산지(FBS) | Life Technologies | 16140-071 | |
| 펜/연쇄상구균 | Life Technologies | 15070-063 | |
| Dulbecco의 변형 독수리 배지/영양 혼합물 F-12(DMEM/F12) | Life Technologies | 11320-033 | |
| 녹아웃 혈청 대체품(KSR) | Life Technologies | 10828-028 | |
| MEM 비필수 아미노산 (네아) | Life Technologies | 11140-050 | |
| GlutaMAX | Life Technologies | 35050-061 | |
| ß-메르캅토에탄올 | Life Technologies | 21985-023 | |
| N-Lauroylsarcosine 나트륨 염 용액(사르코실) (30%) | Sigma-Aldrich | 61747 | |
| EDTA | Sigma-Aldrich | E9884 | |
| Trizma Hydrochloride | Sigma-Aldrich | T3253 | |
| Proteinase K solution (20 mg/ml) | Bioline Australia | BIO-37084 | |
| Expand Long Template PCR System | Roche Australia | 11681834001 | |
| hPITX3 L arm gen. F(프라이머): 5' TGTCCTAAGGAGAATGGGTAACAGACA 3' | GeneWorks, 호주 | ||
| hPITX3 L 암 GFP R(프라이머): 5' ACACGCTGAACTTGTGGCCGTTTA 3' | GeneWorks, 호주 | ||
| HyperLadder 1 kb | Bioline Australia | BIO-33025 | |
| GelRed | Jomar Bioscience, 호주 | 41003 |
참고문헌
- Nefzger, C. M., et al. Lmx1a Allows Context-Specific Isolation of Progenitors of GABAergic or Dopaminergic Neurons During Neural Differentiation of Embryonic Stem Cells. Stem Cells. 30 (7), 1349-1361 (2012).
- Zeng, W. R., Fabb, S. R. A., Haynes, J. M., Pouton, C. W.
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재인쇄 및 허가
