우리는 리보뉴클레아제가 풍부한 쥐 췌장에서 높은 무결성을 가진 RNA를 분리하는 절차를 보고합니다.
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이 논문에서
요약
초록
쥐 췌장과 같은 리보뉴클레아제가 풍부한 조직에서 고품질 RNA를 분리하는 것은 어려운 일입니다. 췌장의 주요 기능은 소화를 돕는 것이므로 쥐의 췌장에는 75mg의 리보뉴클레아제가 함유되어 있을 수 있습니다. 마우스 췌장에서 RNA를 분리하기 위한 표준 페놀/구아니딘 티오시아네이트 용해 시약 프로토콜의 변형을 보고합니다. 구아니딘 티오시아네이트는 강력한 단백질 변성제이며 대부분의 조건에서 리보뉴클레아제의 활성을 효과적으로 방해합니다. 그러나 리보뉴클레아제가 풍부한 조직에서 RNA를 성공적으로 분리하기 위해서는 표준 프로토콜에 대한 중요한 수정이 필요합니다. 주요 단계에는 높은 용해 시약 대 조직 비율, 상 분리 전에 소화되지 않은 조직 제거, RNA 용액에 리보뉴클레아제 억제제 포함이 포함됩니다. 이러한 변형 및 기타 변형을 사용하여 RNA 무결성 수(RIN)가 7보다 큰 RNA를 일상적으로 분리합니다. 분리된 RNA는 일상적인 유전자 발현 분석에 적합한 품질입니다. 췌장 외에 리보뉴클레아제가 풍부한 조직으로부터 RNA를 분리하기 위한 이 프로토콜의 적응은 쉽게 달성할 수 있어야 합니다.
서론
높은 무결성 RNA의 분리는 같은 북부 블로 팅 9, QRT-PCR 1 또는 5 프로파일 유전자 발현 같은 일상적인 분자 생물학 실험이 필요합니다. RNA 분리 대부분의 현대적인 방법을 구아니딘 티오 시아 네이트 프로토콜 (2)의 변형에 기초한다 3. 구아니딘 티오 시아 네이트는 강한 단백질 변성제이고 효과적으로 대부분의 조건에서 리보 뉴 클레아 제의 활성을 방해 할 것이다. Chomczynski 및 사키 3의 인기있는 방법은 약 4 시간에 분리 시간을 줄이고, 구아니딘 티오 시아 네이트 용해 용액에 페놀을 배합. 대부분의 시판되는 RNA 추출 시약은 Chomczynski와 사키 방법 3를 기반으로하고 있습니다.
같은 인간이나 마우스의 췌장 등의 리보 뉴 클레아 풍부한 조직은 RNA를 분리하는 추가 문제를 제공합니다. 마우스의 췌장은 그 중 일부는 운영 시간에만 출시 될 예정 리보 뉴 클레아 제 6의 최대 75 밀리그램을 포함 할 수있다G 조직의자가 분해의 결과로 췌장 조직의 파괴. 구아니딘 티오 시아 네이트 프로토콜의 수정은 성공적으로 높은 무결성 2, 4, 7, 10
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프로토콜
1. 준비
다음 사례는 기관의 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 설정된 정책을 준수.
- 그것은 특정 일에 더 이상 6 이상 마우스 췌장을 분리하는 것이 좋습니다. 깨끗하고 멸균 모든 수술 도구, 동물 당 하나의 집합이 있습니다.
- 모든 마이크로 원심 튜브 레이블을 지정합니다. 동물 당 네 개의 2 ㎖ 튜브.
- 얼음에 50 ㎖의 원심 분리기 튜브에 용해 시약 8 ㎖를 놓습니다. 주 : 정제 키트는 췌장의 분리에 적합한 구아니딘 티오 시아 네이트 페놀 시약와 함께 제공하지만, 용해 시약 때문에 격리 당 필요한 큰 볼륨으로 사용됩니다.
- 균질의 블레이드 청소를 위해 15 ML의 원심 분리기 튜브에 다음과 같은 솔루션의 약 10 ㎖를 분배. 에탄올, 70 % (2 관), HPLC 등급 물 (1 관)과 약 200의 RNase ㎕의 비움 또는 이에 상응하는 리보 뉴 클레아 제 inactivator를 포함 HPLC 등급 물.
2. 외과, 췌장의 해부 및 균질화
- 면 거즈 나 종이 수건이 들어있는 항아리에 이소 플루 란의 1 ~ 2 ㎖를 놓습니다. 마우스는 이소 플루 란의 근원에 도달 할 수는없....
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결과
용해 균질 1 ㎖에서 총 RNA의 수율은 20 ~ 40 μg이다. OD 280분의 260 비율은 일반적으로 약 2.0이며, RIN은 7.0 지속적으로 크다. RIN은 6 ≤ 경우 분리가 반복 될 필요가있을 것이다. 때때로, 8.0보다 높은 RIN은 달성된다.
종래 췌장의 제거에 마우스를 안락사의이 가장 일반적으로 사용되는 방법은 CO 2 질식 또는 이소 플루 란을 흡입한다. 두 기술은 자궁 경부 전위 다음에 있습니다. 그것은 화학 약품 및 / 또는 절차에 시간이 RNA 무결성, 두 기술을 비교 하였다하여 고립 된 마우스의 췌장 RNA의 RIN에 영향을 줄 수있는 가능성이 있기 때문이다. 마우스는 CO 2 질식 또는 이소 플루 란 흡입을 사용하여 마취; 두 기술은 자궁 전위에 의해 미행했다. 이전의 자궁 경부 전위에 동물을 마취의 시간은 isofl에 비해 CO 2 질식 약 1 ~ 2 분 이상했다urane. 이소 .......
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토론
풍부한 리보 뉴 클레아하는 조직에서 RNA를 분리하는 것은 분자 생물학 실험에 대한 큰 도전을 나타냅니다. 각종 시약 및 키트는 주로 RNA 추출의 페놀 구아니딘 티오 시아 네이트 방법에 시판을 기반으로하는 그. 구아니딘 티오 시아 네이트는 단백질을 변성 따라서 리보 뉴 클레아 제의 활성을 감소시킨다. 그러나 췌장에서 리보 뉴 클레아 제의 깎아 지른듯한 크기는 RNA 분리의 표준 프로토콜을 추가로 수정해야합니다. 프로토콜 표준 구아니딘 티오 시아 네이트 방식의 기반이 여기에보고 아직 췌장 등의 리보 뉴 클레아 풍부한 조직에서 RNA의 성공적인 분리를위한 몇 가지 중요한 변경뿐만 아니라, 팁이 포함되어 있습니다.
RNA 단리를위한 표준 지침에 유의해야한다. 이 기술은 더 적은 리보 뉴 클레아 풍부한 췌장보다 표본에서, RNA의 성공적인 분리에 매우 중요합니다. 몇 가지 예는 분자 생물학 등급 워싱턴을 사용하여 포함터, 리보 뉴 클레아없는 소모품 오히려 유리보다 일회용 플라스틱 .......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
우리는 그들의 도움이 의견, 제안 및 자신의 프로토콜을 공유 지안 후아 링, 레이몬드 맥도날드, 갤빈 스위프트, 미셸 그리핀, 폴 Grippo 및 Satyanarayana Rachagani 감사합니다. 이 작품은 부여 U01CA111294와 오하이오 주립 대학 교내 연구 프로그램에서 아이디어 개발의 수상에 의해 지원되었다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 파워 젠 500 | 피셔 사이언티픽 | 14-261-03 | 균질 화기 |
| 5424R | Eppendorf | 냉장 마이크로 centifuge | |
| Trizol 시약 | Invitrogen | 15596018 | Lysis 시약 |
| Student Vannas 스프링 가위 | Fisher | 91500-09 | 부속 조직에서 췌장을 절단하는 데 사용 |
| 수술 용 가위, 6 인치 | Fisher | 08-951-20 | 마우스의 신을 자르는 데 사용 |
| 뭉툭한 끝 집게 | Fisher | 1381239 | 을 해부하는 동안 췌장을 잡는 데 사용 |
| USP | Abbott Labs | 4/8/5210 | 마취 |
| Rnase out (40 U/µ l) | Invitrogen | 10777-019 | Rnase inhbitor |
| Rnase Away | Ambion | 10328-011 | 일반 Rnase inactivator |
| HPLC 등급 물 | Fisher | W5-4 | 세척 균질화 블레이드 |
| 분자 생물학 등급 물 | Hyclone | SH30538.03 | RNA 용출 |
| miRNeasy 미니 키트 | Qiagen | 217004 | 정화 키트 |
| 2 ml 마이크로 원심 분리기 튜브, 인증 Rnase Dnase 무료 | USA Scientific Plastics | 1620-2700 | |
| 15 ml 원심 분리기 튜브 | Falcon | 352099 | |
| 70% 에탄올 | Fisher | ||
| 100% 에탄올 | Fisher | ||
| 200 µ l 피펫 팁 | Rainin | GPL200F | 청소용 균질화 블레이드 |
| 클로로포름 | 피셔 | BP1145-1 | |
| Nanodrop | Thermo | ND-1000 | 분광광도계 |
| 바이오분석기 | Agilent | Capillary 전기영동 분석기 RNA 무결성 | |
| 측정 RNAlater | Ambion | RNA 안정화 시약 | |
| RNeasy 스핀 칼럼 | Qiagen | 스핀 칼럼 miRNeasy Mini 키트의 일부로 | |
| Mice | Chales River | Strain C57BL/6 | 그들의 나이는 4개월에서 12개월 사이였습니다. |
| 생쥐 | 잭슨 랩 | 균주 129 | 그들의 나이는 4개월에서 12개월 사이였습니다. |
참고문헌
- Chen, C., Ridzon, D. A., Broomer, A. J., Zhou, Z., Lee, D. H., Nguyen, J. T., Barbisin, M., Xu, N. L., Mahuvakar, V. R., Andersen, M. R., et al. Real-time quantification of microRNAs by stem-loop RT-PCR. Nucleic Acids Res. 33, e179(2005).
- Chirgwin, J. M., Przybyla, A. E., MacDonald, R. J., Rutter, W. J.
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재인쇄 및 허가
