수정 된 두 개의 광자 현미경에서 3D 궤도 추적 : 세포 내 소포의 추적에 응용

Summary

이 비디오 프로토콜에서는 변형된 이광자 현미경에서 궤도 추적 방법을 사용하여 살아있는 세포 내에서 형광 표지된 리소좀을 고속으로 3차원으로 추적합니다.

Abstract

이 동영상 프로토콜의 목적은 변형 된 이광자 ^현미경을 사용하여 ¹ 입체 형광 입자 궤도 추적 실험을 수행하고 분석하는 방법을 설명하는 것이다. 종래의 접근 방식 (래스터 스캔 또는 프레임들의 스택에 기초하여 넓은 시야)에 대향 된 바와 같이, 3D 궤도 추적 지역화 및 높은 공간 (10 nm의 정확도) 및 시간 해상도 (50 Hz에서의 주파수 응답)의 3 차원 변위에 따라 허용 ^{마이크론이} 수백의 길이 비늘에 이동 형광 입자. 이 방법은 추적 된 대상물 주위에 원형 궤도를 수행하기 위해 두 개의 광자 레이저 스캐닝 현미경의 하드웨어를 제어하는​​ 피드백 알고리즘을 기반으로한다 : 피드백기구의 변위를 제어하여 중심에 형광 물체를 유지 주사 빔 ^3-5. 이 기술의 장점을 설명하기 위해, 우리는 알 내에서 빠르게 움직이는 세포 기관, 리소좀을 따라iving 셀 ^6,7. 세포는 표준 프로토콜에 따른 도금 및 상업적 리소좀 염료를 사용하여 염색 하였다. 우리는 살아있는 세포의 내부 3D 궤도 추적 실험을 수행하기 위해, 간단히 하드웨어 구성과보다 상세히 제어 소프트웨어를 논의한다. 우리는 상세히 주사 현미경을 제어하고 입자 주위 닫힌 궤도 빔의 움직임을 사용하기 위해 필요한 파라미터들을 논의한다. 우리는이 방법이 효과적으로 생균 내에 3 차원 미세 소관을 따라 표시된 리소좀의 빠른 움직임을 추적 할 수있는 방법을 보여줌으로써 결론. 리소좀은 일반적으로 미세 소관 네트워크 ⁸ 따라 모션을 지시 표시, 0.4-0.5 μM / 초 범위의 속도로 이동할 수있다.

Introduction

방법 중 다수의 현미경을 사용 입체적으로 형광 발색 입자를 추적하는 날짜로 개발되어왔다. 대부분의 접근은 일반적으로 이상적인 축 방향으로 트래킹을 달성하기 위해 현미경 출사 광학계의 정의 수정과 조합이 차원에서 추적하기 적합한 고속 카메라의 사용에 의존한다. 이 프로세스가 적절한 시간 해상도 (10Hz의)는 일반적으로 시간 소모적이며, 얻을 수 있지만, 종래의 입자가있다 추적되는 경우에만, Z-스택의 시계열을 수행하여 형광체 입자를 추적 할 수있다 (촛점 또는 두 개의 광자 중) 레이저 주사 현미경 액티브 피드백 메커니즘 ^(2)에 의해 작은 래스터 촬상 영역의 중심에 있었다.

록킹에서 입자로의 개념은 궤도 추적 방법의 기초이다. 대신 래스터의 원형 궤도가 형광 입자의 주위에 수행되는 검사합니다. 따라서 형광의 강도궤도 정확하게 입자의 총수 ⁴ 편재.

입자의 국부적 위치는 현미경 스캐너 재 중심 위치에 입자 궤도를 작동하는 데 사용될 수있다. 현미경의 갈바 노 스캐너는 아날로그 전압에 의해 구동된다. 이 전압의 AC 성분은 사인 및 원 궤도를 수행 할 수 있도록 X 및 Y 스캐닝 미러에 적용 코사인 파 즉,

Protocol

1 샘플 준비

1. 10 % 소 태아 혈청 및 페니실린 스트렙토 마이신 50 ㎍ / ml의 100 IU / ㎖로 보충 된 DMEM을 사용하여 조직 배양 플라스크에 CHOK1 세포를 유지한다. 37 ° C에서 5 % CO ₂ 가습 인큐베이터에있는 세포를 품어.
2. 수확 후 0.16 mm의면 두께 14mm 직경 마이크로 웰에 CHOK1 세포를 플레이트. 60~70% 자랄 때 주변의 이미징을위한 최적의 밀도에 대한 종자 세포.
3. 37 ° C에서 하룻밤 세포를 품어, 5 % CO _2. 녹색과 튜 불린 추적기 녹색의 150 nm의 Lysotracker DND26의 50 nm의를 포함하는 용액에 세포를 HBSS (행크 버퍼 식염수)의 셀을 세 번 세척하고, 부화. 37 ° C에서 1 시간 동안 세포를 품어. 선택 단계 : 부화하기 전에, 미토콘드리아 매트릭스 염색 염료 (25 nM의)와 추가로 얼룩을 수행합니다.
4. 어떤 언 바운드 염료를 제거 HBSS에있는 세포를 세 번 씻으십시오. IMAG 이전에 신선한 DMEM 성장 매체를 추가세포를 보내고.

2 현미경 구성

비디오 프로토콜에 기재된 입자 ....

Results

이 프로토콜에 따라 고속 3D 단일 입자 추적은 형광 표지 리소좀의 변위를 추적하는 개질 이광자 현미경을 이용하여 살아있는 세포 내부에서 수행 될 수있다. 실험 수행 엔도 좀의 성숙 과정 ⁹ 후 셀 내부 이동 절연 리소좀 추적 이루어져있다. 리소좀은 녹색 형광 염료를 사용하여 염색하고 2 광자 여기 악용 930 nm에서 여기시켰다. 우리의 데이타는 32 밀리 초 (도 1A)의 시간 해상도와 X, Y, Z 변위 궤도를 얻을 수 있음을 보여준다. 카펫 분석 시간 (그림 1b)를 통해 각각의 궤도를 따라 기록 강도를 표시합니다. 방출 된 형광의 통합 강도가 기록 될 수있는 추적 (도 2a) 중. 미세 소관 네트워크에서 이동 소포로부터 예상 될 수있는, 재구성 된 3 차원 궤적은, 동작 지시를 표시한다.dditionally, 상기 주변 영역 (도 2b)의 래스터 스캔 이미지에 3.......

Discussion

높은 시간 분해능으로 3 차원 형광 입자의 궤적을 달성 지난 년 동안 형광 현미경 기술과 계장의 엄청난 진행됨에도​​ 불구 분야에서 도전을 유지하고있다. 높은 시간 해상도가 이차원 추적 입자를 달성 한 경우, 축 방향에 확장은 전형적으로 시스템 ^(10)의 주파수 응답에서의 급격한 감소를 가져온다.

이 동영상 프로토콜에서는 이광자 현미경을 사용하여 높은 시간 해상도 (이 실험에서는 32 밀리 초)으로 살아있는 세포 내에 입체적 개별 입자의 추적의 실증 애플리케이션에 초점을 맞추었다. 이러한 실험을 수행하기 위해 필요한 설정은 레이저 주사 현미경 검사를 수행하는 실험실 전형적 가능하다. 3D 궤도 추적을위한 두 악기 추가 기능뿐만 아니라 제어 소프트웨어 Commercia에 대 한 시장에서 사용할 수있는이러한 올림푸스 사제 것과 리터 레이저 주사 현미경. 그것이 발광 형광 디 주사를 필요로하지 않기 때문에, 실험 장치의 설계에 유리하다 가능한 펄스 고전력 적외선.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lysotracker DND 26	Life Technologies	L-7526
Tubuline 추적기 Green	Life Technologies	T34075
Mitotracker RED	Life Technologies	M7512
Coherent Chamelon- ultra II TI	Coherent
Glan Taylor 방해석 편광자	Melles Griot	03PTA001
갈바노미터-모터 미러	Cambridge Technologies	M 6350
Dichroic 미러	Chroma Technologies	700 DCSPXR
모터화된 스테이지	ASI	MS2000
Piezo	PI	P721-LLQ
광전자 증배관	Hamamatsu	H7422P-40
데이터 수집 카드	IO 기술	PCI 1128-4000
이미지용 이미징 소프트웨어	LFD	글로벌 -SimFCS