방법 논문

라벨없는 DNA의 혼성화 분석 용 미세 유체 기반 전기 바이오칩

DOI:

10.3791/51797

⸱

2014년 9월 10일

 ,  ,  ,  , 
1MEMS Sensors and Actuators Laboratory (MSAL), Department of Electrical and Computer Engineering, Institute for Systems Research, University of Maryland, 2Institute for Bioscience and Biotechnology Research, Fischell Department of Bioengineering, University of Maryland

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

우리는 DNA 혼성화 검출을위한 미세 유체 기반 전기 바이오칩을 제시한다. ssDNA를 프로브 작용에 따라, 특이도, 민감도 및 검출 한계 보완 및 비 보완 ssDNA를 목표로 공부하고 있습니다. 결과는 3.8 nm의 검출 한계와 함께, 전기 화학적 시스템의 DNA 혼성화 이벤트의 영향을 예시한다.

초록

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마이크로 규모로 분석 벤치 탑 절차의 소형화는, 반응 시간, 비용, 및 사전 처리 단계의 통합에 관해서 상당한 이점을 제공한다. 그것은 치료 시점에서 각종 질병에 대한 바이오 마커의 실시간 평가를위한 기술을 제공하기 때문에 DNA 혼성화 사건의 분석으로 이들 장치를 이용하는 것이 중요하다. 그러나, 디바이스 풋 프린트는 다양한 물리적 현상 증가의 지배력을 감소시킨다. 이러한 현상은 가공 정밀도 및 장치의 작동 안정성에 영향을 미친다. 따라서, 정확하게 전반적인 성능을 개선하기 위해 재생 가능한 방식으로 이러한 장치를 제작하고 운영하는 중대한 필요성이 존재한다. 여기서, 우리는 프로토콜과 제조 및 DNA 혼성화 사건의 정확한 분석 용 미세 유체 기반 전기 화학적 바이오 칩의 동작에 사용되는 방법을 설명한다. 바이오 칩은 두 부분으로 구성되어있다 : 미세 유체 칩세 폴리 디메틸 실록산 (PDMS)로 이루어지는 병렬 마이크로 채널, 3 × 3 배열 된 전기 마이크로 칩. DNA 혼성화 이벤트는 전기 화학 임피던스 분광법 (EIS) 분석을 이용하여 검출된다. EIS 분석이 길이 규모에서 지배적 인 전기 시스템의 특성의 모니터링 변화를 가능하게한다. 바이오 센서와 양 전하 전송 및 diffusional 저항의 변화를 모니터링 할 수있는 능력으로, 우리는 20 분 다음 상보 ssDNA를 대상으로 선택성, 3.8 ㎚의 계산 된 검출 한계, 및 다른 비 - 상보 ssDNA를 가진 13 % 교차 반응성을 보여 배양. 이 방법론은 마이크로 스케일 레짐에서 확산 동작에 의해 해명 및 DNA 혼성화 사건의 조사를 가능하게하여 소형화 된 장치의 성능을 향상시킬 수있다.

서론

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미세 유체 랩 온어 칩 (LOC) 장치는 임상 진단, 환경 모니터링과 생물 의학 연구에 많은 장점을 제공한다. 이러한 장치는 다양한 절차 1-4 배양 시약 혼합, 결합 친화도 기반, 신호 전달, 세포를 포함하여 이루어질 수있는 칩의 영역에 유체 유동을 제어하기 위해 마이크로 유체 채널을 이용한다. 마이크로 유체는 마이크로 웰 플레이트 판독기 또는 전기 영동 겔 쉬프트 분석 같은 종래의 임상 진단 도구에 비해 많은 장점을 제공한다. 유사한 분석을 수행하기 위해 더 적은 시약 (㎕의 반대로 나노 리터) 미세 유동 장치는 크기가 2 ~ 3 명령을 필요로한다. 또한, 이러한 장치는 어떤 이벤트가 생물학적 5,6 채널 내의 종의 작은 한정으로 인해 발생할 수있는 속도를 증가시킬 수있다. 셋째, 센서는 라벨없는 detectio를 제공 할 수 리소그래피 및 에칭 기술을 이용하여 미세 유동 장치 내에 통합 될 수있다명. 마지막으로, 이러한 장치는 생산 및 7-10를 작동 할 수있는 기술자의 입장에서 약간의 작업을 필요로 저렴하다.

라벨없는 검출은 일반적으로 광학 또는 전기 변환기를 사용하여 수행됩니다. 광학 장치에 의한 샘플 분석 물과 저급 간섭 나은 감지 성능을 제공 할 수있다. 그럼에도 불구하고, 그 성능은 샘플의 배경 센서 (11)와 동일한 공진 파장을 갖는 경우에 노출된다. 마이크로 유체 시스템에서 생물학적 및 화학적 검출을 수행하는 전기적인 신호를 이용하여 여러 가지 장점이있다. 이러한 센서는 일반적으로 만 작동 전극 패턴을 필요로하기 때문에 제조는 본질적으로 덜 복잡하다. 다른 양상 신호가 신호 12-15 변환 변환기를 동시에 요구할 수있다 또한, 전기 신호는 대부분 직접 측정 장비와 인터페이스 될 수있다. 전기 센서는 일반적으로 impedanc 변화를 측정전자 (16, 17), 용량 (18), 또는 산화 환원 활동 19. 이러한 시스템의 소형화 아르 그러나 새로운 도전이되게됩니다. 극복하는 가장 중요한 과제는 포함한다 : 샘플 준비 및 (인해 낮은 샘플 볼륨과 레이놀즈 수에) 유체의 혼합, 물리적 및 화학적 효과 (모세관 력을 포함하여, 표면 거칠기, 건축 자재 및 분석 간의 화학적 상호 작용), 낮은 신호 대를 복잡한 생물학적 시료 (예, 혈액 및 타액)에서 전기 활성 분석에서 20-23, 및 잠재적 인 간섭 (감소 된 표면적과 체적에 의해 제조) 잡음비. 이러한 효과의 추가 조사는 전반적인 성능을 개선 할 재현 방식으로이 장치의 정확한 제조 및 운영 가이드 라인에서 발생합니다.

DNA 혼성화 검출 유전 질환과 24,25 canc 다양한 형태를 진단하기 위해 광범위하게 사용된다어 26. 매년 독감의 여러 균주 DNA 하이브리드 기술 (27)의 결과를 사용하는 환자에서 식별됩니다. 인플루엔자 바이러스는 미국에서만 28에서 36,000 사망자 매년를 차지한다. 이러한 예는 민감도 나 특이도를 희생하지 않고 낮은 샘플 볼륨 플레이트 리더 또는 젤 시프트 분석으로하고 적은 비용으로 동일한 분석 기법을 수행 할 수있는 벤치 탑 미세 유체 장치에서 혜택을 누릴 수 있습니다. 인해 라벨없는 전기 화학 센싱 많은 장점으로이를 DNA 혼성화 29,30 이벤트의 검출을 위해 광범위하게 사용되고있다. (mm 범위에서) 매크로 스케일 전극 관심 커 용액에 침지되어 설치 그들의 상보 서열과 일치하는 단일 가닥 DNA 서열의 결합 동력학에 대하여 매우 중요한 데이터를 제공하는데 사용될 수있다. 최근 MICR에서 전기 화학적 감지 기능을 통합의 몇 가지 발전이 있었다DNA 혼성화 용 ofluidics. 연구는 혼성화 반응 속도 (31)과 미세 유체 채널에서 검출 (15)에 대한 센서의 통합에 대해 수행되었다. 그러나, 여전히 복잡한 샘플 준비 단계없이 병렬 DNA 혼성화 이벤트를 분석 할 수있는 빠른 처리량 미세 유체 소자에 대한 요구가 존재한다.

본 연구에 제시된 장치는 다수의 상호 작용이 평행 복잡한 샘플 준비 단계없이 상영 할 수있는 플랫폼을 제공한다. 우리 프로토콜은 전기 화학적 바이오 칩은 미세 전자 기계 시스템 (MEMS) 기술 (32, 33)와 마이크로 제조되는 방법 마이크로 유체 기반 나타낸다. 우리는 전극 어레이로 구성 (PDMS), 폴리 디메틸 실록산으로 만들어진 마이크로 유체 칩, 및 전기 화학 칩 모두의 제조 공정을 설명한다. ssDNA의 프로브와 바이오 칩의 화학 작용도 해결됩니다. 마지막으로, ABIL구체적 ssDNA를 타겟을 검출하고 분석하는 바이오 센서의 성만이 설명된다. 전반적으로, 마이크로 유체 기반 전기 화학적 바이오 칩은 신속하고 높은 처리량 분석 기술이다. 이는 생물학적 분자와 전도성 센서 사이의 상호 작용을 조사하기 위해 사용될 수 있고, 랩 온어 칩 다양한 애플리케이션에 이용 될 수있다.

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프로토콜

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미세 유체 칩의 1 미세

  1. 전기 칩을 준비
    1. 패턴 골드 ​​전극
      1. 아세톤, 메탄올, 이소프로판올 ( "AMI"청소)와 빈 사 ''실리콘 웨이퍼 (프라임 등급의 품질을) 씻어. N이 총을 건조하여 탈 이온수 (DI)과 웨이퍼의 이소프로판올을 씻어.
      2. 플라즈마 강화 화학 기상 증착 (PECVD) 도구 1 μm의 두께의 SiO2 보호 층을 성장한다. DC 스퍼터링 도구로 금 2,000 두꺼운 층 다음에 크롬 200 두꺼운 층을 증착.
      3. 스핀 "PR1"긍정적 인 포토 레지스트 (회전 매개 변수 : 3,000 rpm으로, 1000 RPM / 초, 30 초) 1.6 μm의 두께 균일 한 막 ~을 만들 수 있습니다. 전 빵을 핫 플레이트에 100 ° C에서 1 분 동안 웨이퍼.
      4. 190 엠제이 / 포토 마스크를 통해 405 nm 파장에서 cm 2 웨이퍼를 노출. DEV (352)에서 30 초 동안 웨이퍼를 개발eloper는 N이 총 DI와 웨이퍼 건조를 씻어.
      5. 1.5 분 동안 골드 에칭액 금을 에칭. ~ 30 초 동안 크롬에 천트와 크롬 에칭. DI와 웨이퍼를 씻어 N이 총을 건조.
      6. "AMI"청소 절차에 포토 레지스트를 벗겨.
        참고 : 강산 화제 및 폭발 위험.
      7. 한 H 2 SO 4 : 4 : 4로 웨이퍼를 청소 H 2 O 2 혼합물 ( "피라"클린)을 1 분 동안. DI와 웨이퍼를 씻어 N이 총을 건조.
    2. 패턴 백금 전극
      1. 스핀 "PR2"긍정적 인 포토 레지스트 (회전 매개 변수 : 3,000 rpm으로, 1000 RPM / 초, 30 초) 1.4 μm의 두께 균일 한 막 ~을 만들 수 있습니다. 전 빵을 핫 플레이트에 100 ° C에서 1 분 동안 웨이퍼.
      2. 30 엠제이 / 포토 마스크를 통해 405 nm 파장에서 cm 2 웨이퍼를 노출. 핫 플레이트에서 125 ° C에서 45 초 동안 웨이퍼를 굽는다. 홍수에 노출1000 엠제이 / 포토 마스크없이 405 nm 파장에서 cm 2 웨이퍼. 6에서 2 분 동안 웨이퍼를 개발 : 1 AZ400K 개발자 및 DI와 웨이퍼를 씻어 N이 총을 건조.
      3. E-빔 증착 시스템을 이용하여 백금의 1600 두꺼운 층이어서 티탄의 (400)의 두꺼운 층을 증착.
      4. 아세톤 및 이소프로판올로 세척 한 다음 5 분간 초음파 아세톤 욕조에 포토 레지스트를 들어 올립니다. DI와 웨이퍼를 씻어 N이 총을 건조.
  2. 분석 채널을 준비
    1. 분석 채널에 대한 금형을 준비
      1. "AMI"청소 절차에 빈 사 ''실리콘 웨이퍼 (테스트 수준의 품질을) 씻어. DI와 웨이퍼의 이소프로판올을 씻어 것은 N이 총을 건조 하였다.
      2. 스핀 "PR3"네가티브 포토 레지스트 (2 단계 회전 매개 변수 :. 단계 일 - 600 회전, 120 회전 / 초, 10 초 두 단계 - 1,150 rpm으로, 383 회전 / 초,27 초) 균일 한 막 ~ 100 μm의 두께를 만들 수 있습니다. 전 빵을 핫 플레이트 (2 단계 베이킹 매개 변수에 대한 웨이퍼 :. 단계 일 - 300 ° C / 시간에서 65 ° C로 실온에서 진입로와 10 분 동안 온도를 유지 2 단계 - 95 ° C까지 상승 300 ° C에서 / 시간 30 분 동안 대기 온도).
      3. 2500 엠제이 / 포토 마스크를 통해 405 nm 파장에서 cm 2 웨이퍼를 노출. 포스트 - 빵을 300 ° C / 시간에서 95 ° C까지 올렸와에 의해 웨이퍼 핫 플레이트에서 10 분 동안 온도를 유지. 프로필렌 글리콜 모노 메틸 에테르 아세테이트 (PGMEA) 개발자에서 10 분 동안 웨이퍼를 개발한다. N이 총을 이소프로판올 건조와 웨이퍼를 씻어.
    2. 분석 채널을 제작합니다
      1. 20 분 동안 진공 챔버에서 1 폴리 디메틸 실록산 (PDMS) 혼합물 (엘라스토머 20g, 경화제 2g)과 완전히 탈기 : 10을 준비한다.
      2. 알루미늄 호일로 몰드 웨이퍼 주위 인클로저를 정의하고 천천히 부어 PDMS 비경금형 이상.
      3. 상자로에서 PDMS 몰드와 구우 (2 단계 베이킹 매개 변수 :. 한 단계 - 5 분​​ 80 °로 실온에서 진입로 C 2 단계 - 17 분 동안 80 ° C에서 개최).
      4. 알루미늄 호일에 금형과 장소에서 껍질 멀리 PDMS. 생검 펀치 도구로 구멍을 정의하고, 외과 의사의 칼을 분석 칩을 잘라.

2 장치를 조립

  1. 수동으로 전기 칩에 작업 전극 PDMS 분석 채널을 맞 춥니 다. PDMS는 채널을 밀봉하고 누설을 방지, 전기 화학적 칩에 잘 스틱.
  2. 플라스틱 또는 직쇄 엘보 커넥터 어댑터 (0.1875 OD '및 ID 0.0625')로 짧은가요 성 관을 사용하여가요 성 호스 (0.087 OD '및 ID 0.015')에 연결. 장치의 구멍을 천공 입구 각 커넥터를 연결합니다.
  3. 의 타단에 주사기를 연결튜브 및 주사기 펌프에 주사기를 배치합니다. 교대 부 (3)에서 요구되는 절차 단계 및 해당 용액에 의한 주사기의 세트, 튜브와 커넥터를 변경.

3 DNA 하이브리드 분석

NOTE : 전체 채널이 채워질 때까지 200 μL / hr의 유속으로 각 채널에 천천히 용액을 소개.

  1. 다른 ssDNA를 프로브 서열과 각각 수직 마이크로 채널을 기능화 (3 별도 수직 마이크로 평행 수행)
    1. 각각 다른 ssDNA를 프로브 배양 용액 마이크로 채우기 (10 mM의 인산 완충액을 100 mM의 염화나트륨, 10 μM 트리스 (2 - 카르복시 에틸) 포스 핀 (TCEP), 및 1 μM 프로브 ssDNA를), 및 마이크로 세정 뒤에 1 시간 동안 배양 PBS와 함께.
    2. 10 mM의 PBS, 100 mM의 염화나트륨 및 1.395 mM의 TCEP의 버퍼에 6 - 머 캅토 -1 - 헥산 올 (MCH)의 1 ㎜를 포함하는 용액과 함께 인큐 마이크로 채우기1 시간 동안 BATE는 PBS와 마이크로 채널을 세정 하였다.
  2. , PDMS를 들어 올려 수평 방향으로 90 ° 회전하고, 고유의 카운터 및 기준 전극 (그림 S1)를 포함하는 각 행과 반응 챔버의 별도의 행을 노출 아래로 배치합니다.
  3. 4 배의 제어 계측 솔루션 마이크로는 생리 식염수 구연산 나트륨 (SSC) 버퍼를 집중 입력하고 20 분 동안 배양한다.
  4. 배경 측정 : (작업, 카운터에 접속 텐쇼을 사용하여, 참조 전극 5 밀리미터가 PBS 용액 / 5 mM의 페로을 시안화하여 마이크로 채우고 (EIS 전기 화학 임피던스 분광법) 다른 주파수에 대한 전기 시스템의 임피던스 값을 기록 EIS 파라미터 : 1 MHz의 0.1 Hz에서, 10 년대 당 주파수 데이터 포인트 25 MV 진폭, 기준 전극에 비해 5 MV 편광) 주파수 범위. 마이크로 채널의 각 작동 전극이 측정을 반복합니다.
  5. (각 비 보완 및 보완 ssDNA의 목표를 위해 수행) DNA 혼성화를 측정한다.
    1. 4X의 대상 ssDNA를 측정 용액 마이크로 채우기 대상 ssDNA를 1 μM을 포함하는 SSC 완충액을 농축시키고, 20 분 동안 배양한다. 단계 3.4에 기재된 DNA를 측정한다.

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결과

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실험 장치의 제어 및 정확한 제조 공정이 연구에서 중요하다. 이 연구원은 재현성 및 높은 처리량 실험을 얻을 수 있습니다. 여기에서 우리는 마이크로 유체 기반의 전기 화학적 바이오 칩 (그림 1)의 높은 수율, 높은 재현성의 미세 공정을 증명하고있다. 낮은 실패율로, 몇몇 디바이스는 액 유출로 이어질 접합 문제를 보였다. 바이오칩의 전기 화학적 활성을 검증하기 위해, 순환 전압 전류 법 측정은 전기 활성 산화 환원 커플 페리 시안화 / 페로로 채워진 마이크로 채널에서 수행된다. 2 칩상의 구 다른 작용 극의 재생 가능한 전기 화학 반응을 보여준다. 이러한 결과는 전기 화학적 활성이 높은 처리량 측정을 허용하는 바이오칩의 모든 구 챔버에서 동일한 것을 나타낸다.

대부분의 DNA 혼성화 센서 ss​​DNA를 고정화센서 표면에 프로브. 금 패턴에 마이크로 유체 장치를위한 감지 전극을 사용함에...

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토론

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우리의 절차는 마이크로 유체 기반의 전기 화학적 바이오 칩의 제조 및 DNA 혼성화 이벤트 분석에 대한 활용도를 보여줍니다. 고 수율 제어 미세 공정을 통해 우리는 전기 화학 센서의 배열과 통합 마이크로 채널로 구성된 장치를 개발한다. 우리는 반복적 인 접근을 통해 전기 화학 칩 및 마이크로 유체 몰드의 포토 리소그래피 절차를위한 제어 처리 파라미터를 고안 하였다. 이 단계는 다른 소형화 분석 장치의 미래 창조에 대한 지침을 제공합니다. 중요한 것은 이러한 신호 대 잡음비, 안정성 및 감도 바이오 센서 등의 각종 파라미터를 최적화하는 방법을 제공한다. 장치의 제조에 이어, 우리 고유 분석 목적을 제공 bioreceptor로 프로브 ssDNA를 가진 전기 화학 센서를 기능화. 이 절차는 낮은 장치 실패율을 입증하지만, 액 누설 majo 것으로 도시장치 및 DNA 혼성화 분석의 성능 동안 조립 다음과 같은 연구에 문제가있을 수 있습니다. 이러한 장치의 결합 실패의 추가 조사는 공정의 수율을 개선하고 마이크로 바이오 시스템 연구에 ...

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공개 사항

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저자가 공개하는 게 없다.

감사의 글

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저자는 금융 지원을위한 로버트 W. 독일어 재단, 국방 위협 감소 기관 (DTRA), 연구의 국립 과학 재단 (National Science Foundation) 신흥 프론티어와 혁신 (EFRI)을 인정합니다. 저자는 또한 클린 룸 시설 지원을 위해 메릴랜드 Nanocenter과 Fablab 감사합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
4 "실리콘 웨이퍼Ultrasil4-5664단면 연마; P 형; 붕소 도핑; 방향 1-0-0; 두께 500 미크론; 저항 10-20 옴&미드닷; cm
Shipley 1813 포토레지스트 ("PR1")Microchem포지티브 포토레지스트
AZ5214 포토레지스트 ("PR2")Hoechst Celanse포지티브 포토레지스트
SU-8 50 포토레지스트 ("PR3")Microchem네거티브 포토레지스트
Gold etchantTranseneTFANo dilution
Chromium etchantTransene1020AC희석 없음
PDMS 엘라스토머Dow Corning3097366 1004
PDMS 경화제Dow Corning3097358 1004
생검 펀칭 도구HealthlinkBP20
Tygon 유연한 튜빙Cole Parmer R 36030.015"
Tygon 유연한 어댑터Cole Parmer 06417-410.0625"
1 ml 주사기Beckton-Dickenson301025
일염기성 인산칼플루카1551139
인산이염기성 무수시그마RES20765-A7
염화나트륨시그마-알드리치S7653
트리스(2-카르복시에틸)포스핀알드리치C4706
6-메르캅토-1-헥산올알드리치451088
20x 농축 식염수-구연산나트륨 완충액시그마93017
칼륨 헥사시아노페레이트(III)알드리치455946
상보적 ssDNA #1Integrated DNA Technologies (IDT)100 nmole DNA oligo5'-GGGACGTCCACGGAGCGCTA
TCGGAGCTTT-3'
표적 ssDNA #2Integrated DNA Technologies (IDT)100 nmole DNA oligo5'-/5ThioMC6-D/ACGCGTCAGGTCATTGACGA
ATCGATGAGT-3'
상보적인 ssDNA #2Integrated DNA Technologies (IDT)100 nmole DNA oligo5'-ACTCATCGATTCGTCAATGA
CCTGACCCGT-3'
표적 ssDNA #3Integrated DNA Technologies (IDT)100 nmole DNA oligo5'-/5ThioMC6-D/ACCTAGATCCAGTAGTTAGA
CCCATGATGA-3'
상보적 ssDNA #3Integrated DNA Technologies (IDT)100 nmole DNA oligo5'-TCATCATGGGTCTAACTACT
GGATCTAGGT-3'
Instrument
Plasma Enhanced Chemical Vapor Deposition (PECVD)Oxford InstrumentsPlasmaLab System 100챔버 압력 1,000 mTorr, Tempreture 200 ° C, RF 전력 20W, 가스: a) N2O 유량 710sccm; b) 5 % SiH 4< / sub> 및 95 % N2< / sub> 가스 유량 170 sccm, SiO2< / sub> 성장률 690 &# 197; / min.
DC 침을 튀기기 단위AJA 국제적인ATC 1800-V: 약실 압력 10 mTorr, 아르곤 흐름율 20 sccm, 공급된 DC 힘 200 W, 스퍼터링 속도 10 nm/min. 금의 경우: 챔버 압력 10mTorr, 아르곤 유량 20sccm, 공급 DC 전원 200W, 스퍼터 속도 36nm/min.
E-빔 증발 시스템Denton티타늄용 맞춤 제작: 챔버 압력 < 2 x 10-6 Torr, e-gun에 전원 공급 7.5 kW, 필라멘트 전류 150-200 mA, 증발 속도 6-10 Å/sec. 백금의 경우: 챔버 압력 < 2 x 10-6 Torr, e-gun에 전원 공급 7.5 kW, 필라멘트 전류 150-200 mA, 증발 속도 2-3 Å/sec.
PotentiostatCH Instruments660D
주사기 펌프KD ScientificKDS230
륨 크롬을 위한

참고문헌

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