고환 마우스 세포에 대한 형질 전환 기술은 정자의 고유 한 프로세스를 공부로이 문서에서는 생체 내에서 미세 주입 및 마우스 고환의 일렉트로에 대해 설명합니다. 제시된 프로토콜은 전기 천공 법 (electroporation)에 의해 유리 모세관 준비, 원심성 덕트를 통해 미세 주입하고, 형질 전환의 단계를 포함한다.
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이 논문에서
요약
초록
이 비디오 및 문서 기여 미세 주입 및 생체 내에서 마우스 고환의 일렉트로의 포괄적 인 설명을 제공합니다. 고환 마우스 셀이 특정 형질 전환 기술은 정자의 고유 한 프로세스의 연구를 할 수 있습니다.
다음 프로토콜 플라스미드 구성체와 마우스 정소 세포의 형질 전환에 초점을 맞추고있다. 특히, 우리는 적색 형광 단백질 (DsRed2)을 표현하는 녹색 형광 단백질 (eGFP는) 또한 pDsRed2-N1 벡터를 강화 표현하는 기자 벡터 pEGFP-C1을 사용했다. 두 부호화 리포터 유전자는 인간 사이토 메갈로 바이러스의 즉시 초기 프로모터 (CMV)의 제어하에 있었다.
마우스 정소에 유전자 전달을 수행하기 위해, 리포터 플라스미드 구성체는 살아있는 마우스의 고환에 주입된다. 이를 위해, 마취 동물의 정소는 노출 및 마이크로 인젝션의 사이트가 제조된다. 우리의 선호하는 장소주입은 고환과 부고환의 정자의 해부학 전송 경로와 궁극적으로 연결 RETE의 고환과, 원심성 덕트입니다. 이러한 방식으로, 마이크로 인젝션 후 정 세관의 충전은 양호 인해 DNA 염색 용액의 사용을 관리하고 제어한다. 그 컬러 세관 구조 정소의 충분한 충전을 관찰 한 결과, 기관은 전기 천공이다. 이는 고환 세포 내로 DNA 용액의 전송을 가능하게한다. 배양 3 일 후, 정소 제거하고, 형질 전환의 성공을 나타내는, 녹색 또는 적색의 형광 현미경으로 조사 하였다.
일반적으로,이 프로토콜은 DNA- 또는-RNA를 전달하기 위해 이용 될 수는하기 위해 살아있는 마우스 정소로 구성한다 (위에) 표현 또는 생체 내 유전자 기능 분석에 용이하게 유전자를 노크. 또한, 리포터 구조 또는 추정되는 유전자 REGULA 공부 적합토리 요소입니다. 따라서, 전기 천공 기술의 주요 장점은 다른 기술에 비해 낮은 필요한 노력뿐만 아니라 적당한 기술 장비 및 기술과 함께 빠른 성능이다.
서론
포유 동물은 성숙한 정자 반수체 정자로 개발하기 위해서는 순차 유사 분열, 감수 분열 및 분화를 겪고 자기 갱신 줄기 세포의 복잡한 과정으로 간주된다. 이러한 형태 학적 변화는 다양한 세포 유형에 의해 조율되는 중후 시도에도 불구하고, 세포 배양 1,2에서 이러한 프로세스를 모방 여전히 불가능하다. 따라서, 지금까지의 정자에 대한 연구는 생체 내 모델로 살아있는 유기체에 의존한다. 일반적으로, 유전자 기능 연구는 일반적으로 형질 전환 동물에 기초한다. 그러나, 생성하여 동물 모델이 종류를 유지하는 것은 시간 소모적이고 비용 집약적 꽤 정교하다. 이것은 생성하고 세대 위에 유전자를 유지하기위한 필수 사육 긴 프로세스에 기인한다. 또한, 형질 전환 또는 녹아웃 방법에 의해 전체 유기체의 유전자 조작은 g을 타겟팅 생리적 장애를 유발하는 경향이있다예를 들어 여러 지역에서 필수적인 기능, 고환 외부 또는 체계적으로 ENES.
또한, 일부 과도 형질 전환 방법은 몇 가지 중요한 단점과 연관되어 있습니다. 리포 펙 3 및 마이크로 입자 충돌 (4) 조직을 손상시킬 수있는 충분한 형질 전환 효율을위한 특정 세포 깊이로 제한되어있는 반면 예를 들어, 바이러스 매개....
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프로토콜
모든 수행 동물 실험은 로컬 윤리위원회 (Landesamt 엘리제 Landwirtschaft, Lebensmittelsicherheit 싶게 Fischerei, 메 클렌 부르크 - 포어 포메 른, 독일)에 의해 승인되었습니다.
1 플라스미드 준비
- 플라스미드 제제를 들어, 플라스미드 정제 키트 (재료 표 참조) 또는 동물의 면역 반응을 피할 수 있도록 독소 제거 버퍼와 유사한 방법을 사용한다. 설명서의 지시 사항을 따르십시오. 플라스미드 용액을 희석 DDH O 2를 사용한다.
- 최대 속도 (20,000 XG)에서 DNA 용액을 회전시켜 이물질을 제거합니다. 그런 다음 상층 액을 수집합니다.
- 분광 광도계 (자료 참조) 플라스미드 농도를 결정합니다.
- 1-3 μg (DNA) / μL로 DDH 2 O 플라스미드 농도를 조정합니다. 참고 : 높은 농도가 너무 점성 주사액이 발생할 수 있습니다 동안 낮은 농도는 형질 전환 효율을 감소시킬 것이다. 게다가형질 전환 효율은 플라스미드의 크기에 따라 개별적으로 시험되어야한다.
- 주사 이전에, 함께 혼합 용액을 제조 5 ㎕의 PBS (10 배) 및 5 μL 패스트 그린 (0.5 %)과....
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결과
그것이 사용되는 바와 같이 생체 내에서 마우스 정소의 미세 주입 및 전기 천공을 수행하는 프로토콜에 따라 대한 실험 환경은 그 공업 적 제조 마이크로 피펫을 획득 할 수있다하더라도.도 1에 도시되어, 우리는 (도 1a 당기는 자체 피펫을 생성하는 것이 바람직 있도록) 및 베벨 (그림 1B) 유리 모세관 그들은 우리의 요구를 장착. 마이크로 인젝션 용 및 전기 천공 장치는도 1c에 도시되어있다. 형질 감염 효율의 이유로, 구형파 electroporator를 이용하는 중요하다.
이 표시 원심성 덕트의 준비에 특별한 초점을 마우스 수술의 주요 단계를 그림. Figur (고환이 노출이 컨텍스트 (그림 2A)와 원심성 덕트에서 양안 관찰에 의해 식별 및 지방 .......
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토론
특히 남성 불임 필연적으로 정자의 지역에서 생식 생물학 분야의 연구는 살아있는 유기체에 의존합니다. 고환의 기능을 검사하기 위해, 어떠한 적절한 세포 배양 / 시험 관내 시스템은 반수체 성숙한 정자에 1,2 이배체 spermatogonium 모든 중요한 형태 학적 변화를 반영 할 수있는 확립되지 않았다. 따라서, 유전자 변형 동물의 발생이 종종 필요하고 남성 생식 생물학 등으로 유용한 도구이다. 이를 형질 전환의 상당한 수에, 아웃 노크 노크 남성 불임에 대한 통찰력을 제공 생성 된 쥐. 그럼에도 불구하고, 트랜스 제닉 마우스의 생성은 일반적으로 수정란의 전핵에 유전자 구조를 주입함으로써 수행된다. 그러나,이 방법은 시간 소모적이며 전문 실험실에서 수행 할 예정이다. 절차는 노크 아웃을 생성하거나 노크에서 동물더욱 정교한이다.
모델 생물체의 유전자 기능을 연구하는 또 다른 방법은 일시 발현하는 것입니다. 그러나.......
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공개 사항
마틴 미카엘, 알렉산더 Sobczak, 요아킴 M. WEITZEL는 생식 생물학 연구소, 가축 생물학에 대한 라이프니츠 연구소 (FBN), Dummerstorf에서 독일 고용 그들은 더 경쟁 금전적 이해 관계가 없다고 선언합니다.
감사의 글
우리는 고환 미세 주입 방법을 가르쳐 뮌스터 대학의 생식 의학 및 남성 의학의 센터되었습니다 Birgit Westernstroeer 감사합니다. 게다가, 우리는 어슐러 Antkewitz 및 기술 지원 페트라 Reckling에게 감사의 말씀을 전합니다. 우리는이 작품 (WE2458 / 10-1)를 지원하기 위해 독일 연구 재단 (DFG)을 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 원심분리기 | Sigma | 1-15 PK | |
| 분광 광도계 | Nanodrop | ND-1000 | |
| 마이크로피펫 풀러 | Narishige | PC-10 | 수직 모세관 풀러 |
| 마이크로사출 모세관 | Clark | GC100-10 | 붕규산 표준 벽 |
| 마이크로피펫 베벨러 | Bachofer | Typ 462 | 회전 디스크 beveler |
| Electroporator | Nepagene | CUY 21EDIT | 구형파 전기자극기 |
| 핀셋 전극 | Nepagene | CUY 650P5 | 5 mm Ø 디스크 전극 |
| 스테레오 현미경 | Zeiss | Stemi 2000-C | |
| 차가운 광원 | Zeiss | KL 1500LCD | |
| Microinjection pump | Eppendorf | Femtojet | |
| Micromanipulator | 수제 | XYZ 크로스 테이블 | |
| 수술 기구 | FST | 가위, 집게, 바늘 홀더 | |
| 미세 집게 | FST | Dumont # 5, # 7 | 원심성 덕트 준비 |
| Michel 클립 적용 스테이플러 | FST | Michel, 12029-12 | |
| Michel 봉합 클립 | FST | Michel, 12040-01 | 7.5 x 1.75 mm |
| 외과용 봉합사 | Catgut, Markneukirchen, Germany | Catgut 00 | |
| 주사기(30G 바늘 | 포함) B. Braun | Omnican 40 | 마이크로피펫 적재 및 마취용 |
| 플라스미드 분리 키트 | Promega | Cat. # A2495 | 플라스미드 Midiprep |
| 플라스미드 pEGFP-C1 | 클론텍 | Cat. #6084-1 | CMV-프로모터 + EGFP |
| 플라스미드 pDsRed2-N1 | 클론텍 | 카탈로그 #6084-1 | CMV-프로모터 + DsRed2 |
| 패스트 그린 염료 | 시그마 | F7258-25G | ddH2O |
| 10% 케타민 | 혈청 Werk, Bernburg, 독일 | 자일라진과 1:1 | 로타민 |
| % 자일라 | 혈청 Werk, 베른부르크, 독일 | 자일라진 | |
| 와 1:1 비율로 혼합Sterillium | 소독 | ||
| 수의사 연고 | S & K Pharma, GmbH | Kerato Biciron 5%, 안 | 구 건조를 예방하는 |
| To-Pro-3 요오드화물 | Invitrogen | T3605 | |
| 10x PBS, pH 7.4 | |||
| >1.37 M NaCl | Carl Roth | 3957.1 | |
| 이부프로펜, Dolormin | Johnson & Johnson Consumer Health Care Germany | 01094902 | 수술 후 통증 완화를 위한 진통제 소아과 솔루션(NSAID) |
| 27 mM KCl | Carl Roth | 6781.1 | |
| 100 mM Na2HPO4· 2H2O | Carl Roth | T106.2 | |
| 18 mM KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 |
참고문헌
- Reuter, K., Schlatt, S., Ehmcke, J., Wistuba, J. Fact or fiction: In vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 245-252 (2012).
- Hunter, D., Anand-Ivell, R., Danner, S., Ivell, R. Models of in vitro spermatogenesis. Spermatogenesis. 2, 32-43 (2012).
- Zizzi, A., et al.
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