림프절 기질 세포의 분리는 섬유아세포 망상 세포, 림프 및 혈액 내피 세포를 얻기 위한 효소 분해 및 기계적 분해를 포함하는 다단계 절차입니다. 설명된 절차에서는 짧은 분해와 자동화된 기계적 분해를 결합하여 생존 가능한 림프절 기질 세포의 표면 마커 저하를 최소화합니다.
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이 논문에서
요약
초록
림프절을 포함한 2차 림프 기관은 림프구의 항상성, 활성화 및 분화를 위한 구조적 환경을 제공하는 기질 세포로 구성되어 있습니다. 이중 음성 세포 집단 내에서 접착 분자 CD31 및 당단백질 포도플라닌(gp38), T 영역 망상 세포 또는 섬유아세포 망상 세포, 림프 내피 세포, 혈액 내피 세포 및 FRC 유사 주피 세포의 발현에 의해 다양한 기질 세포 하위 집합이 확인되었습니다. 모든 집단에 대해 서로 다른 구획의 분리 및 내벽, 다른 세포 유형의 인력 및 상호 작용, 배출 유체의 여과 및 림프관의 수축을 포함한 다양한 기능이 설명됩니다. 지난 몇 년 동안 여러 그룹에서 숙주에 잠재적으로 위험할 수 있는 세포독성 T 세포 반응을 조정하고 조절하는 기질 세포의 추가 역할을 설명했습니다.
림프절은 다양한 세포 유형을 가진 복잡한 구조이므로 원하는 세포 집단을 분리하기 위한 적절한 절차가 필요합니다. 현재 림프절 기질 세포를 분리하기 위한 프로토콜은 다양한 배양 시간을 가진 효소 소화에 의존합니다. 그러나 기질 세포와 그 표면 분자는 이러한 효소에 민감하여 표면 마커 발현이 손실되고 세포가 사멸합니다. 여기에서는 표면 분자 발현을 유지하는 림프절 기질 세포의 생존 가능한 단일 세포 현탁액을 얻기 위해 자동화된 기계적 파괴와 결합된 짧은 효소 분해 프로토콜이 제안됩니다.
서론
림프절은 외국과 자기 항원에 대한 적응 면역 반응이 시작되고 조정되는 전문 구획입니다. 여기에 제시된 절차 림프절 단일 세포 현탁액을 수득하고 여러 분자의 표면 발현을 유지 가능한 림프절 기질 세포에 접근하기 위해 자동화 된 기계적인 피펫 결합 단편의 효소 소화를 설명한다.
림프절 기질 세포가 세 가지 주요 기능을 림프 노드의 골격을 형성하고 이행 : 첫째가 체액 항원, 병원균과 병원균 관련 분자 패턴 (PAMPS)뿐만 아니라, 사이토 카인 및 위험 관련 분자 패턴을 샘플링 필터 (감쇠) 본 몸에. 둘째, 상호 작용 및 적응 면역 반응을 시작하는 항원 제시 세포 (APC)와 림프구를 유치하고 지시; 셋째, 이들은 하나의 림프구 항상성 및 분화 구조 환경을 제공-3입니다. 염증 림프절 기질 세포는 성장 인자, 사이토 카인 및 케모카인을 생산하는 동안, 수지상 세포 간의 상호 작용을 편성함으로써, T- 및 B- 세포 종기에 적응. 면역 반응의 오케스트레이션으로 인해 서로 다른 기질 세포 집단에 의해 형성되는 복잡한 구조 아키텍처에만 가능합니다.
림프절 간질 세포가 CD45 음성 세포와 섬유 모세포하며 내피 세포 1-6에서 CD31의 발현 또는 gp38에....
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프로토콜
이 비디오를 게시 및 프로토콜에서 모든 동물의 절차는 분할 한 기관 바젤 슈타 트, 스위스의 승인을 동물의 프로토콜에 따라 실시 하였다.
1 림프절 준비 및 소화
- 가열 플레이트 자석 교반기 37 ° C에 비커 초기 가열 물.
- 다음과 같은 기본 미디어를 준비 : DMEM 배지 (피루 베이트 제외) 2 % FCS로 보충, 1.2 mM의 염화칼슘 및 펜 / 연쇄상 구균 (페니실린의 100 단위, 스트렙토 마이신 100 μg).
- 사용하기 전에 모든 해부 도구를 소독.
- CO 2 질식 당 림프절 공여 쥐를 안락사 및 무균 적으로 림프절을 해부하다. 주위의 지방을 해부하지 마십시오. 참고 :이 프로토콜은 주변 피부 배수 림프절 (사타구니, 상완, 겨드랑이)에 최적화되어 있습니다.
- 2 ㎖의 차가운 얼음 기본적인 매체를 포함하는 멸균 페트리 접시에 림프절을 놓습니다.
- 림프절 캘리포니아를 중단1 ML의 주사기에 고정이 25 G 바늘을 사용하여 psule.
- 1 밀리그램 / ㎖의 콜라게나 제 IV 및 40 μg / ml의 DNase의 I. 보충 된 750 ㎕의 배지를 함유 염기성 5 ㎖ 폴리 프로....
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결과
본 프로토콜로 인해 자동화 된 멀티 채널 피펫 기계 세분화에 짧은 소화 시간 (45 분 최대)로 링크 등., 2007 (6)에 의해 발표 된 수정 소화 프로토콜입니다. 또한, 상기 절차는, 더 표준화 상이한 림프절 기질 세포에 표면 마커의 열화를 최소화하고 동시에 하나 이상의 샘플의 처리를 허용한다.
의 콜라겐 IV와 콜라게나 D는 플레처 프로토콜 13에서 링크 프로토콜 6 현재 프로토콜 또는 콜라게나 P와 디스 파제는 림프절 기질 세포의 생존 능력을 유지하고, CD45, gp38 및 CD31 등 여러 가지 표면 마커의 소화를 아끼지. 테스트하려면 현재 프로토콜, 겨드랑이, 서혜부와 위팔 림프절을 제거하고, 자신들의 간질 세포를 분리하기 위해 절단되었다. CD45, gp38 및 CD31 발현의 분석은 C57BL / 6m에서 격리 TRC, LEC, BEC 및 DN 세포의 존재를 입증얼음 (.......
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토론
림프절 기질 세포의 연구는 최근에 의한 소화 작용이 발행 프로토콜 6,13의 개발에 연구 초점이되었다. 두 프로토콜은 단일 림프절 간질 세포를 획득하기에 적절하지만, 소화 효소의 이용과 소화의 시간 차이가있다. 기질 세포와 그 표면 마커 효소 소화와 기계적 스트레스에 민감하기 때문에, 최적화 된 프로토콜이 필요합니다.
갓 해부 림프절에서 가능한 림프절 기질 세포의 분리는 표현형 및 기능 분석을 수행하기 위해 첫 번째 단계이다. 따라서 신중 안정된 온도에서 지시 된 시간 동안, 효소의 농도 다이제스트 정의하는 것이 중요하다. 두 소화 프로토콜 그러나 약간 긴 소화 단계, 6,13를 설명 하였다. 소화 시간을 줄이기 위해 기계적 세분화 포함하고 멀티 채널 피펫을 사용하여 표준화 하였다. 에 현재 프로토콜의 장점은 전자 따라서 소화 효소와의 배양 시간을 최소화, 45 분에서 기질 세포의 분리를 허용하는 것이다. 또한, 소화 동안 일.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자는 현재의 림프절 소화 프로토콜을 확립하는 데 도움이 되는 토론을 해준 Sanjiv Luther와 동료들에게 감사를 표합니다. 이 작업은 SNF 보조금 PPOOA-_119204 및 S.W.R에 PPOOP3_144918의 지원을 받았습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM | LifeTechnologies-Gibco | 41965-039 | |
| FCS | 최종 농도 2% | ||
| CaCl2 | 시그마 | 499609 | 최종 농도 1.2mM |
| 콜라겐분해효소 IV | Worthington Biochemical Corporation | >mg 건조 중량당 160단위, 최종 농도 1mg/ml | |
| 콜라겐분해효소 D | Roche | 11088882001에서 사용 | 3.5 mg/ml |
| DNAse I | Roche에서 사용 | 40 µ에서 11284932001 사용; g/ml | |
| 교반 자석 | FAUST | 5mm 길이-2mm ø | |
| 폴리스티렌 둥근 바닥 튜브 5ml | Falcon-BD Bioscience | ||
| 가열 기능이 있는 자기 교반기 | IKA-RCT 표준 | 9720250 | |
| 페트리 접시 100mm, 멸균 | TPP | 6223201 | |
| 25G 바늘 | Terumo | ||
| 안티 마우스 CD45 Ab | Biolegend | 클론 30-F11 | |
| 안티 마우스 CD11c Ab | Biolegend | Clone N418 | |
| 안티 마우스 Podoplanin Ab | Biolegend | Clone 8.1.1 | |
| 안티 마우스 CD31 Ab | Biolegend | Clone MEC13.3 | |
Eppendorf Xplorer plus, Multichannel | Eppendorf | 4861 000.821/830 | 1.250 µ l 최대 볼륨 |
| 안티 마우스 CD140a | Biolegend | 클론 APA5 | |
| 안티 마우스 CD80 | Biolegend | 클론 16-10A1 | |
| 안티 마우스 CD40 | Biolegend | 클론 1C10 | |
| 안티 마우스 I-Ab | Biolegend | 클론 AF6-120.1 | |
| 안티 마우스 CD274 (PD-L1) | Biolegend | 클론 10F.9G2 | |
| LIVE/DEAD 수정 가능 근적외선 사각 염색 키트 | Invitrogen | L10119 |
참고문헌
- Mueller, S. N., Ahmed, R. Lymphoid stroma in the initiation and control of immune responses. Immunological reviews. 224, 284-294 (2008).
- Roozendaal, R., Mebius, R. E. Stromal Cell - Immune Cell Interactions. Annual Review of Immunology. 29 (1), 23-43 (2011).<....
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재인쇄 및 허가
