Clathrin-mediated endocytosis는 빠르고 매우 역동적인 과정으로 신호 수용체를 포함한 많은 단백질을 내부화합니다. 여기에 설명된 프로토콜은 개별 내포세포 이벤트의 동역학을 직접 시각화합니다. 이는 내포세포 기전의 핵심 구성원이 서로 어떻게 협력하는지, 그리고 단백질 화물이 이 과정에 어떤 영향을 미치는지 이해하는 데 필수적입니다.
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방법 논문
TIRF 현미경을 통해 단일 이벤트 해상도에서 G 단백질 결합 수용체의 Clathrin 매개 엔도 시토 시스를 시각화
이 논문에서
요약
초록
많은 중요한 신호 수용체는 잘 연구된 클라트린 매개 세포내이입(CME) 과정을 통해 내재화됩니다. 세포내이입의 전반적인 변화를 측정하는 기존의 세포 생물학적 분석법은 CME에 참여하는 30개 이상의 알려진 성분을 확인했으며, 생화학 연구를 통해 이러한 성분 중 다수의 상호 작용 맵을 생성했습니다. 그러나 CME가 매우 역동적인 프로세스이며 규제가 복잡하고 미묘하다는 사실이 점점 더 분명해지고 있습니다. 이 원고에서는 TIRF(Total Internal Reflection Fluorescence) 현미경을 사용하여 이 과정을 매개하는 개별 이벤트 수준에서 살아있는 세포에서 실시간으로 clathrin 매개 내세포 세포 메커니즘 구성 요소의 역학을 직접 시각화하는 방법을 설명합니다. 이 접근법은 생리학적 조절에서 볼 수 있듯이 세포내이입(endocytosis)을 전체적으로 차단하지 않고 세포내이입(endocytosis)을 변경할 수 있는 미묘한 변화를 밝히는 데 필수적입니다. 우리는 이 기술을 사용하여 새로운 관심 영역, 즉 뚜렷한 클라트린 코팅 피트(CCP)의 역학을 조절하는 화물 구성의 역할을 분석하는 데 중점을 둘 것입니다. 이 프로토콜은 널리 사용 가능한 다양한 형광 프로브와 호환되며 세포 표면에서 내재화된 많은 화물 분자의 역학을 시각화하는 데 적용할 수 있습니다.
서론
clathrin 매개 엔도 시토 시스 (CME)의 과정은 소체 1-3에화물을 수집하고 세포막을 조작 clathrin-매개 된 세포 내 이입 기계의 다양한 컴포넌트뿐만 도착 타이밍에 의존한다. CME는 엔도 시토 시스 1의 초기 사이트에서 함께 와서 막 변형 및화물 어댑터 단백질에 의해 시작된다. 이러한 단백질은 clathrin 코팅 피트 (CCP) (4)을 형성 새장 형 구조로 어셈블 외피 단백질 clathrin를 모집. CCP가 완전히 주로 큰 GTPase, dynamin의 작용을 통해 구형, 막 분열로 조립되면, 무료 clathrin 코팅 소포 (CCVS) 5,6를 생성합니다. 이러한 내재화는 구성 요소의 여러 CME 라운드 동안 재사용 될 수 있도록 clathrin 코트의 신속한 분해를 트리거한다.
CME에 관여하는 단백질의 발견 및 특성화는 전통적인 생화학 뿌리되었습니다emical, 유전 및 현미경 기술 4-6,8. 이러한 분석법은 이러한 세포 내 이입 컴포넌트 역할과 상호 작용 지점을 해명 하였다. 인신 매매 기계의 필수 구성 요소를 정의하기위한 매우 유용하지만, 이러한 분석은 매우 CME 구성 요소 나화물 농도의 동적 동작을 캡처 ....
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프로토콜
찬란의 1 발현은 배양 된 세포에 CME 구성 요소 태그
HEK293 세포는 GPCR 생물학 및 세포 내 이입을 연구하기 위해 광범위하게 사용되고있다, 따라서이 프로토콜의 모델로 사용되는 유용한 모델 세포입니다. 과발현과 낮은 세포 독성이없는 균일 한 표현을 제공하는 형질 전환 프로토콜을 사용합니다.
- 멸균 층류 후드에있는 모든 세포 배양을 처리합니다. 10 % 소 태아 혈청 (FBS)와 둘 베코의 수정 된 필수 미디어 (DMEM)의 1 ㎖로 12 웰 플레이트의 4 우물을 입력합니다. HEK293 세포의 합류 T25 플라스크에서 4 각 웰에 각각 1시 50분 1:25 1:16 1:10 희석.
- 또한, 제조업체의 지침에 따라, 원하는 크기의 멀티 웰 플레이트에 세포를 씨앗. 12 웰 플레이트에 2 × 10 4 세포 - 0.4을 시드. 5 % CO 2 및 95 % 습도 멸균 37 ° C에서 하룻밤 세포를 성장.
참고 :이 성장 R을 고려오버라이드 조건이 세포주에 따라 달라, 그 형질 이상적 포화 상태 다음날 또는 중복 형질를 행하는 가능성을 보장하기 위해 다수의 웰을 시드하는 것이 바람직 할 수도있다.
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- 다음 날 아침입니다 잘....
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결과
사용 라이브 셀 TIRF 현미경 우리는 μ-오피오이드 수용체 (MOR)의 세포 내 이입 역학을 녹음 한, G-단백질 결합 수용체 (GPCR)와 세포 내 이입 어댑터 단백질 β-arrestin. β-arrestin 구조체는 일시적으로도 1에 설명 된 프로토콜을 사용하여 안정하게 발현하는 MOR 세포주에 형질 전환하고, 96 시간 후 묘화 하였다. 안정적인 세포주의 MOR은 N-말단의 pH에 민감한 GFP 태그입니다. 이 형광 단백질은 중성 세포 외액에서 형광. 또한, MOR 번만 endocytoses 작용제에 의해 활성화하고, 그렇지 않으면 균일 원형질막을 가로 질러 분산 된 상태로 유지. 희미한 형광으로 채워진 셀에 공 초점 모드 결과에 커버 유리에 앉아 부착 세포막에 초점을 맞추고. 이것은 세포막 만 셀 주위 형광 링으로 볼 셀의 중심에 집중 다르다. 왼쪽 비교그림 2A에서 오른쪽 패널. 잘못된 각도로 기존의 표면 형광 또는 TIRF로 전환 그림 .......
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토론
여기에서 우리는 실시간으로 살아있는 세포에서 개별 CCPS의 수준에서 clathrin 매개 엔도 시토 시스 (CME)를 시각화하는 TIRFM의 사용을 설명합니다. CME는 많은 공간적으로 시간적으로 별도의 개별 이벤트의 누적 효과에 의해 매개 신속하고 매우 동적 인 이벤트입니다. 이러한 내재화의 생화학 적 측정과 같은 현재 사용되는 대부분의 분석법, 표면 바이오 티 닐화 또는 리간드 결합, 유동 세포 계측법 또는 내부화 단백질, 또는 단백질의 전자 현미경 지역화의 양을 측정 고정 세포 분석법을 사용하여, 고정 된 시점에서 단백질 지역화의 앙상블 변화를 모니터링 . 이러한 기존 방법은 CME 필요하지만 CME 혹은 다른 동적 막 거래 프로세스 생리 비늘 일치 공간 및 시간 해상도 부족 단백질을 확인하는데 매우 유용왔다. 최근의 증거는 CCPS가 단백질 구성 및 역학 9-1에서 이종 것을 알 수 있듯이이 중요하다2 및 CME 가능성 급속 공간적 이산 방식으로 조절된다. 생균 TIRFM은 살아있는 세포에서 실시간.......
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
저자는 기술적인 도움과 조언을 제공해 준 Imaris, R. Vistein, D. Shiwarski 박사, 그리고 시약과 유익한 토론을 해준 Dr. M von Zastrow, Dr. T Kirchhausen, Dr. D Drubin, and Dr. W Almers에게 감사의 뜻을 전한다. T32에서 제공하는 자금은 SLB와 NIH DA024698에 NS007433하고 MAP에 DA036086 제공합니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| L-글루타민 및 피루브산 나트륨이 함유된 DMEM/고포도 | Fisher Scientific | ||
| Dulbecco의 인산 완충 식염수(DPBS), 칼슘 없음, 마그네슘 | 없음 Gibco, Life Technologies | 21600-010 | |
| EDTA Free Acid | Amresco | 0322-500G | |
| Fetal Bovine Serum | Gibco, Life Technologies 10437-028 | ||
| Leibovitz의 L-15 배지, 페놀 레드 | Gibco 없음, Life Technologies | 21083-027 | |
| Opti-MEM | Gibco, Life Technologies | ||
| HEPES | CellPURE Fisher Scientific | BP2937-100 | |
| Effectene | Qiagen | 301425 | Transfection 시약 |
| 25mm 커버 글라스 | Fisher Scientific | 12-545-86 | |
| Corning 세포 배양 처리 플라스크, 25cm2 | Fisher Scientific | 10-126-28 | |
| 세포 배양 6웰 플레이트 | Greiner Bio-One, by VWR | 82050-896 | |
| Monoclonal ANTI-FLAG M1 | Sigma Aldrich | F3040-5MG[ | |
| D-Ala2, N-Me-Phe4, Gly5-ol]-Enkephalin acetate salt (DAMGO) | Sigma Aldrich | E7384-5MG | |
| Alexa Fluor 647 단백질 라벨링 키트 | Life Technologies | A20173 | |
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ | |
| Imaris 이미지 분석 소프트웨어 | BitPLane | http://www.bitplane.com/imaris/imaris, 자동 분석용 | |
| Nikon Eclipse Ti 도립 현미경 및 필터 큐브 및 필터를 포함한 필수 액세서리 | Nikon | ||
| Nikon TIRF 암(필요한 어댑터 포함) Nikon Eclipse Ti | Nikon | 입사각 조정용 | |
| iXon+ EMCCD 카메라 및 어댑터 | Andor |
참고문헌
- McMahon, H. T., Boucrot, E. Molecular mechanism and physiological functions of clathrin-mediated endocytosis. Nature Reviews Molecular Cell Biology. 12 (8), 517-533 (2011).
- Kaksonen, M., Toret, C. P., Drubin, D. G. A Modular Design for the Clath....
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