전뇌와 소뇌의 슬라이스 배양 시스템을 사용하여 NG2 세포와 희소돌기아교세포를 연구하는 기술에 대해 설명합니다. 이 방법을 사용하면 조직 세포 구조를 유지하면서 세포 외 환경을 쉽게 조작할 수 있는 희소돌기아교세포 계통 내에서 세포의 증식 및 분화 역학을 조사할 수 있습니다.
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이 논문에서
요약
초록
NG2 발현 세포 (polydendrocytes, 희소 돌기 아교 세포 전구 세포)는 중추 신경계에서 주요한 넷째 신경교 세포 집단이다. 배아 및 출생 후의 개발하는 동안 그들은 적극적으로 증식 myelinating 희소 돌기 아교 세포를 생성합니다. 이 세포는 일반적으로 기본 해리 문화, 신경 세포 공 배양 연구, 고정 조직되었다. 새로 사용 가능한 트랜스 제닉 마우스 선이 배양 시스템은 전뇌와 소뇌 모두 회색과 백질 영역에 희소 돌기 아교 세포 계통 세포의 증식과 분화를 조사하는데 사용될 수있는 슬라이스. 슬라이스 문화는 출생 초기 마우스에서 준비가되어 1 개월까지에 대한 문화에 보관됩니다. 이 조각은 세포의 행동과 상호 작용을 조사하기 위해 배양 기간 동안 여러 번 이미지를 만들 수 있습니다. 이 방법은 NG2의 세포 분열의 시각화와의 상세한 분석을 가능하게하고있는 동안 희소 돌기 아교 세포의 분화로 이어지는 단계 지역별 의존 할 수 있습니다천만에 NG2 세포 및 희소 돌기 아교 세포 기능 이질성. 이는 생체 내에서 밀접 발견 유사한 셀룰러 환경에서 시간 경과에 영향을 미치는 이러한 세포 및 극한 외부 신호를 조사하는데 사용될 수있는 강력한 기술이다.
서론
4 - 중추 신경계 Organoytpic 슬라이스 배양 semiintact 시스템 (1)의 뉴런 및 신경교 세포 생물학을 연구하는데 매우 유용한 것으로 입증되었다. 9 - 이러한 문화를 채택하고 세포 외 환경의 조작을 반복 장기 라이브 세포 이미징에 대한 쉬운 접근과 전기 생리 레코딩 (5)이 기본으로 해리 된 세포 배양의 많은 혜택을 유지하기가 비교적 간단하다. 또한, 슬라이스 배양 3 차원 조직 cytoarchitecture 지역 신경 연결을 유지하고, 가장 중요한 세포 유형은 시스템에 존재한다. 이러한 특성은 세포와 환경의 상호 작용으로 단일 세포의 행동과 생리를 조사하기 위해 이들 문화에 고유 한 편리한 시스템을 확인합니다.
NG2 세포 증식 및 m을 계속 생성 포유류의 중추 신경계에서 신경교 세포 집단이다배아 및 출생 후의 개발 10 동안 희소 돌기 아교 세포를 yelinating. 이들은 광범위 해리 일차 세포 배양에서 연구되었으며, NG2 형광 단백질의 세포 특이 식 트랜스 제닉 마우스 라인의 최근의 발전은 급성 슬라이스 제제의 생체 내 거동 매핑 및 전기 생리 레코딩에서 촉진했다. 비록 이러한....
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프로토콜
주 : 모든 동물의 절차는 지침을 따르고 코네티컷 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회 (IACUC)에 의해 승인되었습니다.
참고 : YFP 기자 20 (JAX 번호 006148) 선이 각각 사용되었다 : NG2cre 18 구성 적 (JAX # 008533)와 NG2creER 16 유도 이러한 실험 (JAX 번호 008538)의 경우 형질 전환 마우스는 19 (JAX은 # 003920) 또는 gtRosa26 / EG Z에 교차 화상 NG2 세포 및 그 자손. 희소 돌기 아교 세포로 성숙 화상, PLPDsRed 트랜스 제닉 마우스 (21)를 사용 하였다. 일관성 생존을 위해, 조각까지 전뇌와 소뇌 모두에서 출생 일 10 생쥐에서 분리 할 수 있습니다.
1 조각 준비
- 문화 후드에서 여섯 잘 접시에 조직 배양 삽입을 배치하고 (시약 섹션에서 레시피) 1 ml의 슬라이스 문화 매체를 추가 할 수 있습니다. 5 %와 37 ° C에서 해부하기 전에 CO 2 적어도 2 시간을 세포 배양 인큐베이터에서 접시를 넣습니다.
- 70 % 에탄올에서 모든 도구와 조직 초퍼 멸균.
- 이전 해부의 시작 적어도 15 분....
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결과
대표 데이터의 예는 다음과 같습니다 P8 NG2cre의 전뇌와 소뇌에서 모두 슬라이스 문화를 사용하여 획득 한 것을 : 경제의 제로 성장, NG2creER : YFP를 형질 전환 마우스 라인을 PLPDsRed. NG2 세포 전뇌와 소뇌 조각 (그림 1B-D, 비디오 1) 이러한 세포의 표현형 일 동안 이미지를 만들 수는 고정 후 결정 NG2와 CC1 항체 (그림 1E)과 면역 염색 할 수 있습니다. 이미징 사는 또한 세포 증식은 또한 Ki67 (도 1F)와 같은 세포 증식 마커에 대한 면역 조직 화학 염색을 사용하여 평가 될 수있다. 이러한 데이터는 개개의 세포 기초 NG2의 세포 분열 후에 희소 돌기 아교 세포의 분화의 시간의 상세한 역학 분석을 허용한다. YFP 마우스 (도 2) : NG2 세포의 운명 매핑 NG2creER에 4OHT와 슬라이스에 CRE 재조합 유도 한 후에 수행 될 수있다. YFP 리포.......
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토론
중추 신경계의 수초화 효율적으로 신경 세포의 통신 및 축삭의 생존 22 필수적이다. 25 - 대부분의 뇌 영역 16,23의 거주 인구를 유지하면서 NG2 세포는 지속적으로 성인에 myelinating 희소 돌기 아교 세포를 생성합니다. 이러한 세포의 분화를 조절 일부 유전 및 분자 메커니즘을 설명했지만 많이 발견되고 남아있다. Organotypic 슬라이스 배양 인해 해부학 영역, 세포 외 환경의 쉬운 조작 견고 수초화, 모든 주요 세포 유형의 존재를 유지하는 자신의 고유 한 특성으로 이러한 메커니즘을 조사하기 편리한 도구이다. 이러한 특성은 NG2 세포, 희소 돌기 아교 세포와 축삭 11,26 사이의 단기 및 장기 작용의 조사를 용이하게한다. 또한, 세포 이식은 수행하기가 비교적 용이하고 의존적 D 영역을 조사하는데 사용될 수있다셀 동작을 17 ifferences. 또한, 약리학 적 치료는 정상 17,27,28
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공개 사항
저자는 경쟁하는 재정적 이해관계가 없음을 선언합니다
감사의 글
이 연구는 미국 국립다발경화증학회(National Multiple Sclerosis Society, RG4179 to A.N.), 미국 국립보건원(National Institutes of Health, NIH R01NS073425, R01NS074870 to A.N.) 및 미국 국립과학재단(National Science Foundation, A.N.)의 보조금으로 지원되었습니다. PLPDsRed 형질전환 마우스를 제공해 주신 Dr. Frank Kirchhoff(독일 홈부르크 자를란트 대학교)에게 감사드립니다. 유전자 변형 쥐 군체를 유지하는 데 도움을 주신 Youfen Sun에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Slice Culture Medium | |||
| Minimum Essential Medium | Invitrogen | 11090 | 50% |
| Hank' s 균형 잡힌 염 용액 | Invitrogen | 14175 | 25% |
| HEPES | 시그마-알드리치 | H-4034 | 25mM |
| L-글루타민 | 인비트로젠 | 25030 | 1mM |
| 인슐린 | 시그마-알드리치 | I6634 | 1mg/L |
| 아스코르브산 | 시그마-알드리치 | A-0278 | 0.4mM |
| 호스 세럼 | 하이클론 | SH30074.03 | 25% |
| NaOH로 pH 7.22로 적정하고 병 상단 필터로 걸러낸 다음 섭씨 | |||
| Dissection Buffer | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S3014 | 124mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | P5405 | 3.004mM |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P5655 | 1.25mM |
| MgSO4 (무수) | Sigma-Aldrich | M7506 | 4.004mM |
| CaCl2 2H2O | Sigma-Aldrich | C7902 | 2mM |
| NaHCO3 | Sigma-Aldrich | S5761 | 26mM |
| D-(+)-포도 | Sigma-Aldrich | G7021 | 10mM |
| 아스코르브산 | Sigma-Aldrich | A-0278 | 2.0mM |
| 아데노신 | Sigma-Aldrich | A4036 | 0.075mM |
| 병 상단 필터로 필터링하고 섭씨 4도에서 보관, 95%O2 5%CO2로 산소화 사용 | |||
| 기타 시약 및 용품 | |||
| 4-hydroxy tamoxifen (4OHT) | Sigma-Aldrich | H7904 | 100nM |
| 파라포름알데히드(PFA) | EM Sciences | 19200 | 4% |
| L-라이신 | 시그마-알드리치 | L-6027 | 0.1M |
| 메타피리요트 | 시그마-알드리치 | S-1878 | 0.01M |
| 토끼 항 NG2 항체 | Chemicon (Millipore) | AB5320 | 1:500 |
| 마우스 항 CC1 항체 | Calbiochem (Millipore) | OP80 | 1:200 |
| 마우스 anti Ki67 항체 | Vision Biosystems | NCL-Ki67-MM1 | 1:300 |
| 마우스 anti NeuN 항체 | Chemicon (Millipore) | MAB377 | 1:500 |
| 종 특이적 2차 항체 | Jackson Immunoresearch | ||
| Normal Goat Serum (NGS) | 5% | ||
| Triton X-100 | 0.10% | ||
| Mounting medium DAPI | Vector Labs | H-1200 | |
| 밀리셀 배양 멤브레인 인서트 0.45μ m 기공 크기 | Fisher Scientific | PICM03050 | |
| 병 상단 필터 | Fisher Scientific | 09-740-25E | |
| 에탄올 | |||
| 95% O2 5% CO2 가스 혼합 | |||
| 인산염 완충 식염수(PBS) | |||
| 멸균 6웰 플레이트 | |||
| 해부(해마) 또는 계량 주걱, | |||
| 수동 또는 자동 조직 다지기 면도날 | |||
| , | |||
| 일회용 이송 피펫, | |||
| 35mm 및 60mm 멸균 페트리 접시 | |||
| , 실체 현미경 | |||
| 반전상 현미경 | |||
| 층류 후드 | |||
| 조직 배양 인큐베이터 | |||
| 거꾸로 된 형광 Microcope | |||
참고문헌
- Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. Journal of Neuroscience Methods. 37 (2), (1991).
- Gogolla, N., Galimberti, I., DePaola, V., Caroni, P. Preparation of organotypic hippocampal slice cultures f....
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