방법 논문

질량 분석에 의해 - 겔 개선 환원 적 β-제거 포괄적 인 O가 연결된과에 대한 설포 글라 이코믹스

DOI:

10.3791/51840

⸱

2014년 11월 20일

 ,  ,  ,  , 
1Complex Carbohydrate Research Center, University of Georgia, 2Department of Biochemistry and Molecular Biology, University of Georgia, 3Research Institute for Bioresources and Biotechnology, Ishikawa Prefectural University

이 논문에서

요약

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O-결합 글라이칸의 다양성을 종합적으로 탐구하기 위해 과메틸화 및 신속한 상 분할 방법과 결합된 겔 내 환원적 β-제거를 위한 새로운 절차를 SDS-PAGE에 의해 분해되고 질량 분석법에 의한 후속 글리코마이크 분석이 가능한 당단백질에서 직접 방출되는 O-결합 글라이칸의 분석에 적용됩니다.

초록

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

SDS-PAGE에 의한 단백질 분리 후 분해된 단백질 밴드의 겔 내 단백질 분해 분해는 생물학적 샘플의 고해상도 단백질 분해 분석을 생성했습니다. SDS-PAGE에 의해 분해된 당단백질에 의해 운반되는 글라이칸을 심층적으로 분석할 수 있는 유사한 접근법은 검출 방법으로 질량 분석법(MS)을 사용할 때 회수율과 감도를 극대화하기 위해 특별한 고려 사항이 필요합니다. 고품질 데이터를 얻기 위해 극복해야 할 주요 장애물은 MS 분석을 방해하는 겔 유래 오염 물질을 제거하는 것입니다. 여기에 제시된 샘플 워크플로우는 강력하고 효율적이며 MS 전에 인라인 HPLC 세척이 필요하지 않습니다. 표적 단백질을 포함하는 겔 조각을 아세토니트릴, 물 및 에틸 아세테이트로 세척하여 고분자 아크릴아미드 단편을 포함한 오염 물질을 제거합니다. O-결합 글라이칸은 in-gel reductive β-elimination에 의해 표적 단백질에서 방출되고 강력하고 간단한 세척 절차를 통해 회수됩니다. 이 워크플로우의 장점은 황산화 글라이칸을 검출하고 특성화하기 위한 감도를 향상시킨다는 것입니다. 이러한 절차는 MS 분석 전에 신속한 상 분할을 통해 비황산(시알릴화 및 중성) 과메틸화 글라이칸에서 황산염 과메틸화 글라이칸을 효율적으로 분리하여 SDS-PAGE에 의해 분해된 당단백질의 글리코믹 및 설포그리코믹 분석을 향상시킵니다.

서론

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

글리코 실화는 유기체 생리학, 조직 병리학, 및 셀룰러 인식 1-3에 기여 필수적인 단백질 번역 후 변형이다. 분석, 당질의 주요 발전에도 불구하고, 특정 단백질에 글리 칸의 전체 다양성을 특징 짓는 특히 차 생물 소스에서 고립 된 단백질에, 매우 어려운 과제 남아있다. 그럼에도 불구하고, 당 단백질 글리 칸의 microheterogeneity 자주 다른 단백질과 기능의 상호 작용에 영향을 미친다. 따라서, 글리 칸 다양성의 특성화 세포 및 조직 당화 4,5의 생리적 중요성을 이해하는데 필수적이다. 조직의 생리 및 병태 생리, 강력한 민감하고 포괄적 인 glycomic 분석 기술에 당 단백질 글리코 실화의 기여를 이해하기 위해 점점 더 중요 해지고있다. 단백질체 분석에서 동정 된 단백질은 일반적으로 LC-MS에 의해 달성된다/ 트립신 펩티드 (6)의 MS 분석. 단백질 분해는 7-9의 트립신과 같은 프로테아제의 겔 소화 다음 SDS-PAGE에 의해 해결 정제 된 단백질 또는 단백질을 사용하여 수행 될 수있다. SDS-PAGE에 의해 단백질 혼합물의 예비 농축 단백질 ID의 깊이와 정확도를 향상시킨다. 당 단백질의 당화의 glycomic 분석을위한 유사한 전략의 개발은 당질의 최전선에있다.

글리 칸의 두 가지 주요 클래스는 N-O 결합 또는 쇄교 어느 통해 단백질 골격에 부착된다. N 연결된 글리 칸은 아스파라긴에 부착된다 아스파라긴 (Asn)에서 Asn-X-빼앗아 /의 Thr / Cys이고 정의 sequon의 일부로서 발견 잔기 (X는 프롤린을 제외한 임의의 아미노산 임), 및 펩티드 - N과 효소 절단에 의해 해제 될 수있다 -glycanase (PNGaseF 또는 A), 하나 솔루션에서 젤, 또는 온 오점 10-12. O 연결 글리 칸은 주로 세린 (SER) 또는 트레오닌 (THR) 잔기에 부착된다. 그러나, 단지 하나의 효소 IDEN되었습니다당 단백질로부터 O 연결 글리 칸을 방출 할 수 있고, 그것은 단지 간단한 O 연결 글리 칸을 방출 극히 제한 글리 칸으로 발견 된 특이성을 갖는다. 화학 릴리스 전략은 당 단백질의 O 연결 글리 칸의 종합 릴리스에 대한 선택의 방법 남아있다. 환원성 또는 비 환원성 β-제거, 또는 하이드라진 잘 특성화 된 화학 분리 기법이며, 당 단백질 (13, 14)에서 O 연결 글리 칸을 해제하기위한 가장 널리 사용되는 방식은 현재. 환원 β-제거는 SDS-PAGE에 의해 분리 된 당 단백질로부터 O 연결 글리 칸을 방출하기 위해 사용되었지만, 이전 접근법은 15-17 후속 분석을 위해 HPLC 분리를 요구했다.

다차원 MS (MS N) 분석은 현재 대부분의 생물학적 소스에서 예상되는 금액에 고립 된 당 단백질에서 방출 된 글리 칸의 특성에 대한 구조적 데이터의 가장 부유 한 소스를 제공합니다. MS의 깊이기반 구조 특성이 크게 전에 그들의 분석 글리 칸을 방출 permethylating에 의해 촉진된다. 메틸화는 이온화를 개선하고 글리 칸 구조 (18, 19)의 넓은 범위에 걸쳐 몰 응답 신호를 등화시키는 경향이있다. 또한, 메틸화는 모호하여 구조적 해명 20-23 향상 특유 매스와 단자 및 치환 단당 잔기를 붙인다. 예를 들어, 산성 글리 칸은 MS에 의해 비 메틸화 종으로 감지 할 수 일반적으로 어렵다. 산성 글리 칸이 MS에 의해 마이너스 이온 모드에서 검출 될 수 있지만, 동일한 이온 모드에서 모두 산성 및 중성 글리 칸을 검출하는 것은 불가능하다. 글리 칸 메틸화의 큰 장점은 메틸화로 글리 칸의 단당류 치환체에 자유 수산기 (OH)가 모두 그들로서 검출하게 메틸기 (OCH 3 또는 SID), 따라서 시알 릴화 된 글리 칸의 전하를 중화로 캡핑 될 것이라는 것이다 중립 (아시아LO) 글리 칸. 그러나, sulfoglycans에 황산 부분의 수산기는 이온화를 억제하고 감도를 감소 음이온 전하의 보존 결과, 메틸화에 저항. 이 억제는 현재 황산 글리 칸 24 ~ 26의 높은 풍요 로움을 가지고 같은 점액과 같은 매우 복잡한 당 단백질의 포괄적 인 glycomic 분석을 방지 할 수 있습니다.

정화 황산 글리 칸 최근 보고서는 역 위상 정화 크로마토 그래피 및 MALDI 분석에 앞서 별도의 메틸화 글리 칸, 충전에 사용됩니다. 이 방법은 우리가 유기 상 분할보다 덜 엄격한 것으로 나타났습니다 용출 다른 이동상을 사용하여 황산 및 비 황산 글리 칸의 완전한 분리에 의존한다. 따라서, sulfoglycans의 검출 및 농축에 적합한 새로운 기술이 여기에 제시되어있다. 이러한 기술은 다음과 같은 물 성상 황산 화 글리 칸의 정량적 복구 할 수 : DCM (디클로로 메탄)일상적 당쇄 메틸화 반응 (27)의 끝에서 수행된다 추출. 또한이 MS 단편화 패턴을 단순화 중요한 메틸화 비 설페이트 화 글리 칸의 혼합물로부터 메틸화 sulfoglycans이 견고한 분리 병용 하전 종 풍부. 개선에 - 겔 O 연결된 글리 칸 분석을위한 포괄적 인 프로토콜은 제공됩니다. 개선 된 프로토콜은, 글리 칸 회복을 향상 MS 통해 얻어지는 N 메틸화 글리 칸의 분석 구조 정보를 증가시키고 생물학적 공급원으로부터 격리 필수 당 단백질에인가 sulfoglycomic 분석의 감도를 향상시킨다.

이 프로토콜은 전체 당 단백질 추출물 O 연결된 글리 칸 분석을 위해 또는 SDS-PAGE에 의해 해결 관심 특정 당 단백질의 의도와 세 실험 절차로 구성된다; A) 젤 청소, B)에서 - 겔 환원 β-제거, 및 C) 글리 칸 permethy만큼은. 목표는 생물학적 관심 (그림 1)의 기본 소스에서 수확 당 단백질에 대한 포괄적 인 O-연결 glycomic 데이터를 획득하는 것입니다. SDS-PAGE에 의해 분리 된 당 단백질 염색 관심 대역 절제되고 결과 겔 밴드를 작은 조각으로 분리된다 시각화된다. 겔 조각 탈색 및 겔 오염물 (도 2a)를 제거 에틸 아세테이트 세척을 실시한다. 글리 칸 릴리스에 - 겔 환원 β-제거 (그림 2B)에 의해 달성되고 발표 된 글리 칸은 메틸화된다. 수성 유기 추출 다음과 메틸화 정량적으로 떨어져 비 황산 중립 글리 칸 (그림 2C)에서 음이온 성 황산 글리 칸을 분할한다. 에 - 겔 수성 유기 추출 결합 환원 β-제거는 SDS-PAGE에 의해 분리 된 당 단백질의 소량에서 방출 O 연결 글리 칸과 sulfoglycans의 특성을 수 있습니다. 전략적 개요 summari입니다도 1 및 세부 데이빗은도 2에 도시되어있다. 또, 탈색 및 세척 겔 조각 부는 표준 LC-MS / MS 단백체 기술에 의해 단백질 ID를 위해 사용될 수있다.

액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

프로토콜

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

참고 : 연구실 안전에 관한 사항

표준 실험실 모범 사례에 준하여 다음 사항을 준수하십시오. 적절한 위치에있는 모든 유기 용제를 저장합니다. 화학 성분의 명확한 표시와 화학 폐기물 용기에있는 모든 폐기물을 보관하십시오. 이러한 프로토콜에 사용되는 몇 가지 시약 잠재적 인 발암 물질이나, 휘발성 가연성 가스를 생성 환기 흄 후드에서 모든 시약을 처리합니다. 유기 용매를 사용하여 작업 할 때와 같은 장갑, 실험실 코트, 및 눈 보호 등의 개인 보호 장비를 착용 할 것.

figure-protocol-1
에 - 겔 O-글라 이코믹스 1. 절차를 그림. 관심의 (A) 단백질은 적절한 염색 절차 (코마 또는 실버)에 의해 감지, SDS-PAGE에 의해 해결하고 절제되어있다. 절제된 젤 조각 썰어작은 큐브로, 탈색, 이후 MS 분석을 방해 오염물을 감소시키기 위해 에틸 아세테이트로 세척 하였다. 겔 슬라이스의 일부는 LC-MS / MS에 의해 겔 트립신 소화 및 후속 단백체 특성화를 위해 예약 될 수있다. (B) O 연결 글리 칸은에 - 겔 환원 β-제거하여 해결할 당 단백질에서 해제됩니다. 필수 단계는 탈염 및 메탄올 공비에 의한 붕산 제거를 포함한다. 메틸화 및 이후 수성 ​​및 유기 단계로 분할된다 (C) 환원 β-제거가 발표 한 글리 칸을 O 링크. Sulfoglycans 정량적 상단 (수성) 단계에서 회수 낮은 (DCM) 층으로 중립 시알 글리 칸을 분할한다.

figure-protocol-2
에 - 겔 글라 이코믹스 그림 2. 상세 흐름도. 각 experimen도 1에 도시 탈 단계가 개별적으로 도시되어있다. (A) 젤 탈색하고, EtOAc 추출, (B)에서 - 겔 환원 O 연결된 글리 칸 릴리스에 대한 β-제거하고, 직접 (C)과 메틸화 및 위상 파티션. 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

1. 젤 절제 젤 유래 오염 물질의 제거

  1. 절차를 시작하기 전에, 재료 목록에 화학 물질과 시약을 준비합니다.
  2. 표준 트리스 - 글리신 버퍼 시스템을 사용하여 SDS-PAGE 겔상의 단백질을 해결. 얼룩은 쿠마시 브릴리언트 블루 또는 실버 얼룩 중 하나와 단백질을 해결. 일반적으로, 실버 스테인드 젤에서 O 연결 글리 칸의 회복은 코마에서 달성 복구의 약 80~90%가 젤 스테인드입니다.
  3. 전기 영동 후, 유리판 및 소비세 t에 겔을 배치깨끗한 메스 또는 면도날을 사용하여 관심의 그는 지역.
  4. 오 글리 칸의 수율을 증가 다른 유리 접시에 관심의 겔 밴드를 전송하고 약 2mm 큐브로 적출 된 젤 조각을 잘라합니다. 글리 칸 복구가 감소되기 때문에 젤 조각을 1 mm보다 작 큐브를 피합니다. 스테인리스 microspatula와 나사 상부 유리관 (13 × 100 ㎜)로 작은 겔 조각을 전송.
  5. 샘플 튜브에 25 mM의 중탄산 암모늄 (AMBIC, 3 NH 4 HCO) 1 ml를, 테플론 늘어선 나사 상단 뚜껑과 유리 튜브 캡 추가하고 부드럽게 10 분간 방치시키는 전에 튜브를 쓸어 넘겨 섞는다. 겔 조각들을 추출 피하기 위하여 격렬하게 교반을 채용하지 않는다.
  6. 조심스럽게 유리 파스퇴르 피펫 또는 매우 긴 플라스틱 팁 장착 피펫을 사용하여 유리 튜브로부터 제거 AMBIC. 스매싱과 AMBIC 솔루션을 제거하는 동안 작은 젤 조각을 전송하지 마십시오.
  7. 아세토 니트릴 (ACN)의 1 ML을 추가유리 튜브, 모자, 부드럽게 10 분간 방치셔서 전에 튜브를 쓸어 넘겨 섞는다. 겔 조각이 완전히 용매로 덮여 있는지 확인합니다. 필요한 경우, 튜브 벽의 해제 및 피펫 팁과 용매에 젤 조각을 밀어 넣습니다.
  8. 유리관에서 ACN을 피펫과 밝은 푸른 색이 제거 될 때까지 반복 1.5-1.7 단계를 반복합니다. 필요한 경우 다섯 순차적 AMBIC / ACN 세척의 최소를 반복합니다. 실버 스테인드 젤의 경우, destain 키트를 사용합니다. 겔 조각이 ACN에 균일하게 흰색 동안 켤 때 다음 단계로 진행합니다.
  9. 유리 튜브에서 액체를 피펫 튜브를 요약하자면, AMBIC 1 ㎖를 추가하고 5 분 동안 서 보자.
  10. AMBIC를 제거하고 유리관에 에틸 아세테이트 (EtOAc로) 2 ㎖를 추가한다. 또는 엔드 오버 엔드 교반 또는 야간에 4 ° C에서 테플론 늘어선 모자와 장소 요점을 되풀이 튜브 30 분 각각 실온에서 세 EtOAc로 세척을 수행합니다. 이상을 EtOAc 세척, 오염 물질의보다 효율적으로 제거.
  11. 제거최종 EtOAc를 씻고 H 2 O 2 ㎖ 세 세척을 각각 수행 EtOAc로의 완전한 제거는 강력한 환원 β-제거 반응을 보장합니다.
  12. H 2 O를 피펫 ACN 1 ㎖로 한번 세정함으로써 겔을 탈수.
    참고 : 건조 후, 탈수 젤에서 젤 β-제거를위한 준비가되어 있습니다. 탈수 겔 조각을 사용할 때까지 -20 ° C에서 저장 될 수있다.
  13. 무관 겔에 적용되는 버퍼 또는 용액 중, 어느 단계에서 세척 공정을 중지하고 밤새 39 ° C에서 겔 조각을 저장 (AMBIC, ACN, H 2 O). 다음 2 일 이내에 언제든지 샘플 준비를 다시 시작합니다.
  14. 표준 프로 테오 믹 방법에 의해 단백질 ID 용 탈색 탈수 젤 조각의 일부를 사용한다.

환원 적 β-제거 2.에서 젤 O-글리 칸 출시

  1. 사용할 때까지 4 ° C에서 50 %의 NaOH 또는 고체의 NaOH 및 저장소를 사용하여 1 M 수산화 나트륨 (NaOH) 원액을 준비합니다.
      50 %의 NaOH (또는 고체의 NaOH 4g) 5.2 mL를 취하여 1 M NaOH 용액을 100 ml의 볼륨을 조절합니다. 환원 β-제거 반응 효율의 손실없이 최대 6 개월 4 ° C에 저장할 수 있습니다 100 mM의 NaOH를,에 1 M 수산화 나트륨 원액을 희석.
  • 100 mM의 2 M NaOH를 수소화 붕소 나트륨 (에 NaBH 4) 확인. 100 mM의 NaOH를 0.5 ml의의 NaBH 4의 38 mg을 녹인다. 일반적으로, 각각의 샘플에 대한 보로 하이드 라이드 0.5-1.0 ml의 용액을 사용한다. 단계 1에서 제조 한 건조 겔 조각의 양에 반응 용액의 부피가 1-2 절제 겔 조각 (단계 1.3)에 대한 보로 하이드 라이드 용액 0.5㎖의 사용을 기대 바리.
  • 탈수 젤 조각에 100 mM의 NaOH를 500 μl를 추가하고 글리 칸 복구를 향상 기본 조건에 젤을 평형하기 위해 얼음에 3 ~ 5 분간 방치 할 수 있습니다.
  • 1 M의 NaBH의 최종 농도의 결과로, 100 mM의 NaOH를 2 M의 NaBH 4의 500 μl를 추가
  • 배양의 첫 번째 시간 동안 부드럽게 튜브마다 15 분을 섞는다. 이 겔 조각을 조각 낼 수 있기 때문에, 강한 교반을 피하십시오. 잘 평형화 배양기 / 또는 오븐에서 가열 블록에서 반응을 수행한다. 겔 조각이 반응 용액으로 덮여 있는지 확인합니다.
  • 인큐베이터 또는 가열 블록으로부터 샘플 튜브를 제거하고 얼음에 배치하여 반응을 중지.
    NOTE : β-제거 반응이 18 시간 동안 진행시킨 후, 탈염 처리가 당일 내에서 수행되어야한다.

    • 양이온 교환 크로마토 그래피 3. 탈염

    1. 얼음 샘플 튜브를 유지하는 것은 과도한 열이 형성되지 않도록하면서 천천히 염기 중화 10 % 아세트산 (아세트산) 적가 하였다. 부드럽게 아세트산의 추가 사이의 샘플 튜브를 소용돌이. 천천히 산을 추가 할주의와 additi으로 현명한 드롭산에 거품의 "화산"을 생성합니다. 필요한 경우, 기포를 제거하고 유출을 방지하기 위해 튜브를 원심 분리기.
      1. 반응 혼합물에 나트륨의 다량을 제거하기 위해, 작은 양이온 교환 칼럼 (웩스 또는 AG-50W-X8 수지, H + 형)를 통해 반응 혼합물을 전달한다.
      2. 1 M의 NaOH와 함께 양이온 교환 수지를 씻어 1 M HCl을 수지는 분석 등급의 경우에도, MS 분석을 방해 오염물을 제거하기 위해 사용 전에.
      3. 1 M의 NaOH에 수지를 만끽하고 경사 분리하여 용액을 제거. 다음 1 M 염산을 추가, 물을 제거, 탈 이온수를 추가합니다.
    2. 수지 위의 액이 무색이 될 때까지이 단계를 반복합니다. 4 ° C에서 5 % 아세트산에 탈 이온수 및 저장소와 청소 수지를 씻으십시오.
    3. 작은 유리 칼럼, 스크래치하고 피펫 팁의 테이퍼는 대략 1cm 길이가되도록 세라믹 커터를 사용하여 유리 파스퇴르 피펫 팁을 끊어도. 글래스 울 플러그 떨어져 애타게 수지 베드를위한​​ 지원을 형성 팁쪽으로 밀어. 유리 테스트 튜브를 통해 클램프 또는 빨래와 장소 피펫 열을 고정합니다.
    4. 1 ml의 메탄올 (메탄올) 및 3 ㎖의 5 % 아세트산으로 빈 피펫을 씻으십시오. 소용돌이 H + 웩스 AG50 또는 양이온 교환 수지 슬러리를 5 % 아세트산에 저장하고 파스퇴르 피펫 열에 1ml의 베드 볼륨을 생성하기 위해, 슬러리의 충분한 옮긴다.
    5. 5 % 아세트산의 5 권을 사용하여 열을 씻어. 수지 입자의 외관 흐를 수지가 검출되는 경우에 열을 사용하지 않는 체크.
    6. 새로운 나사 위에 유리 튜브 (16 × 125mm) 및로드 샘플을 통해 열을 놓습니다. 통한 유동을 수집하고 동일한 튜브에 5 % 아세트산 중 적어도 3 볼륨으로 글리 칸을 용출.
    7. 파라 필름으로 관을 덮고 바늘로 작은 구멍을합니다. -80 ° C 또는 드라이 아이스에 샘플 튜브를 놓습니다. 동결되면, 동결 건조하여 샘플을 건조. -20 °에서 건조 된 물질을 저장사용할 때까지 C.

    4. 붕산염 제거

    1. 메탄올 10 % 아세트산을 준비합니다. 빙초산 10 mL를 취하여 메탄올 100 ㎖에 볼륨을 조정합니다. 최대 6 개월 테플론 늘어선 모자와 유리 병에서이 시약을 보관하십시오.
    2. 건조, 동결 건조 된 샘플 튜브와 소용돌이에 메탄올 10 % 아세트산 300 μL를 추가합니다. N 2 스트림에서 증발에 의한 결과 트리메틸 보레이트를 제거합니다.
      참고 : 산성 조건에서 메탄올로 보레이트 염을 혼합 휘발성 화합물 인 트리메틸 보레이트를 생성합니다.
    3. 37 ° C에서 N 2 스트림에서 건조. 4.2 단계에 설명 된대로 건조 후, 메탄올의 아세트산의 또 다른 나누어지는를 추가합니다. 질소 하에서 5 분 (N 2) 37 ° C에서 스트림 액체를 건조.
      1. 반복 재 부상 및 건조 적어도 3 회. 사용할 때까지 -20 ° C에서 건조 된 물질을 저장합니다.

    5. C18 정리

    1. C18 카트리지 열 평형ACN의 세 권과 5 % 아세트산의 5 권을 사용 (크기 1 ml를, 100 mg의 수지). 온화한 포지티브 공기압의인가에 의해 평형화 용액의 통과를 가속화.
    2. 탈염과 붕산염 무료 샘플 튜브에 5 % 아세트산 500 μL를 추가하고 소용돌이에 의해 용해.
    3. 평형 C18 컬럼으로 재현 탁 샘플을로드하고 유리 스크류 캡 튜브 (13 × 100 ㎜)로 통해 흐름을 수집합니다. 용출 O 글리 칸 같은 튜브에 5 % 아세트산 3 ㎖와.
    4. 튜브를 파라 필름 작은 바늘로 작은 구멍을 만들거나 튜브를 다루 느슨하게 밀폐 된 PTFE가 늘어선 캡을 사용하고, -80 ° C 또는 드라이 아이스에 샘플을 동결. 동결 건조하여 용매를 제거합니다. 사용할 때까지 -20 ° C에서 건조 된 샘플을 저장합니다.

    메틸화 6. 자료 준비

    참고 : 강력한 메틸화를 달성의 NaOH를 슬러리 신선한을 준비하기 위해. 메틸화 반응에 사용되는 모든 유리 제품은 광범위하게 청소해야합니다.

    1. , 메틸화에 대한 기본 시약을 준비 깨끗한 유리 나사 탑 튜브 (13 × 100 mm)의 50 % NaOH를 400 μl를 추가합니다. 무수 메탄올와 소용돌이의 800 μl를 추가합니다.
    2. 백색 침전물을 생성하기 위해 무수 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)와 소용돌이 4㎖를 추가.
    3. 침전물을 펠렛 1 분 동안 600 XG에 원심 분리기. 상층 액을 피펫 버린다. 펠렛에 무수 DMSO의 추가 4 ML을 추가합니다. 소용돌이.
    4. 단계를 반복 6.2 세 번이나 더 흰색 침전물이 형성 될 때까지 6.3 최소.
    5. 3 ㎖ 무수 DMSO의 펠렛 기반을 녹여 부드럽게 깨끗한 파스퇴르 피펫으로 상하를 피펫 팅하여 혼합한다.
    6. 이 저장 될 수있는 다음의 메틸화 반응에 즉시베이스를 사용한다.

    출시 글리 칸의 7 메틸화

    1. C18 정제 시료와 소용돌이 또는 재현 탁하는 초음파 처리에 무수 DMSO 200 μl를 추가합니다.
    2. resusp 300 μl를 추가샘플에 종단 기본 슬러리 즉시 요오드 메탄 100 ㎕ (메이)를 추가합니다. 테플론 늘어선 모자와 튜브를 봉인하고 적극적으로 소용돌이에 의해 5 분간 섞는다.
    3. , 메틸화 반응을 중지 얼음 소용돌이에 5 % 아세트산 2 ㎖를 추가합니다. 피펫 솔루션 위아래로 5 회 증발 된 Mel의 남은 양을 줄일 수 있습니다.
      주 : 아세트산이 용액을 중화 메이의 제거 단계 파티션 중에 수상으로 황산 화 글리 칸의 추출 효율을 증가시킨다.
    4. 디클로로 메탄 (DCM)와 소용돌이의 2 ML을 추가합니다. 실온에서 1 분 동안 600 XG에 원심 분리기 수성 및 유기 상을 분리한다.
    5. 새로운 유리관 (13 × 100 ㎜)로 상부층 (메틸화 황산 화 글리 칸의 대부분을 포함 성상)을 전송.
    6. 유기상와 소용돌이에 H 2 O 2 ㎖를 추가합니다. 600 XG 1 분 원심 분리기는 수성 및 유기 상을 분리하고, 전나무와이 두 번째 수상을 결합세인트 수상 (단계 7.5).
    7. 반복 단계 7.6 및 7.5 세 번 이상하지만 이후의 파티션에서 얻어진 수성 상을 저장할 필요가 없다.
    8. 바닥층 (유기상)로부터 가능한 한 많은 최종 상부 층 (성상)을 제거하고 깨끗한 파스퇴르 피펫을 사용하여 별도의 새로운 유리관에 바닥층 (유기상)을 전송.
    9. 42 ° C에서 N 2 스트림에서 유기상을 건조.
    10. 사용할 때까지 -20 ° C에서 파​​라 필름과 관과 상점을 커버.

    수성 단계에서 메틸화 황산염 O-글리 칸의 8 C18 정리

    1. ACN의 세 권과 5 % 아세트산의 5 권과 C18 카트리지 열 평형.
    2. 수집 단계 컬럼으로 7.5과 7.6에서 결합 수성 상을로드합니다.
    3. 탈염을위한 H 2 O 10 mL로 컬럼을 세척 할 것.
    4. 용출 메틸화 황산 2 mL를 새 유리 튜브에 O-글리 칸50 % ACN의. 큰 올리고당에 메틸화 황산 O-글리 칸의 회복을 향상시키기 위해 85 % ACN으로 추가 용출을 사용합니다.
    5. 42 ° C에서 질소 기류 하에서 건조 용출액.
    6. MS 분석 이전에 6개월에 -20 ° C의 최대의 건조물을 저장합니다.

    메틸화 O-글리 칸의 9 질량 분석

    1. 210 ° C의 온도에서 모세관 0.40-0.60 μL / 분의 주사기 유량 nanoelectrospray 소스를 사용하여 적절한 질량 분석기로 직접 주입함으로써 메틸화 O 글리 칸 분석. MS / MS 및 이온 트랩 악기의 MS N에서 CID에 의해 분열를 들어 30 ~ 40 %의 충돌 에너지를 적용합니다.
    2. 음이온 모드의 재구성 메틸화 설페이트 O 글리 칸 메탄올 / 2- 프로판올 / 1- 프로판올 50 μL에 / 13 mM의 아세트산 암모늄 수용액 (16 : 3 : 3 : 2 부피비). 양이온 모드의 경우, 1 mM 염화나트륨 하이드로 50㎕의 중성 / O 시알 릴화 된 글리 칸을 메틸화 재구성메탄올 / 물 xide (1 : 1).
    3. 개별 O-글리 칸 구조 13, 19, 21, 23의 특성을의 MSN 분석 Xcalibur 소프트웨어 패키지 버전 2.0의 총 이온 매핑 (TIM) 및 중립 손실 스캔 (NL 스캔) 기능을 사용합니다.

    액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

    결과

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    인 - 젤 환원 적 β-제거에 에틸 아세테이트 치료의 효과 이전

    에 - 겔 환원 β-제거를 사용하여 점액 소에서 방출 메틸화 O 연결된 글리 칸 샘플의 대표적인 질량 스펙트럼은 그림 3과 같다. 겔 조각의 EtOAc로 세척 효과적으로 이후 MS 분석 (27)을 방해 SDS와 폴리 아크릴 오염 물질을 제거합니다.

    figure-results-1
    이전에 젤 환원 β-제거에 폴리 아크릴 아마이드 젤 조각 그림 3. 에틸 아세테이트 세척 출시 글리 칸의 검출을 향상시킵니다. 에틸 아세테이트, 소 submaxillary 점액에서 젤 β-제거가 발표 한 메틸화 O 연...

    액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

    토론

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    겔 내 환원성 β 제거와 수성-유기 추출을 결합하면 SDS-PAGE에 의해 다른 단백질에서 분해된 소량의 뮤신형 당단백질에서 수확된 황산화 및 비황산화 O-결합 글리칸을 특성화하기 위해 획득할 수 있는 구조 데이터의 감도와 깊이가 향상됩니다. 이 연구에서 제시된 기술적 접근 방식의 본질적인 발전은 다음과 같습니다: (a) 간단한 세척 단계로 젤 유래 오염 물질을 쉽게 제거; (b) 빠른 물-DCM 분할 후 수성상에서 과메틸화된 설포글리칸의 정량적 회수. 여기에 설명된 워크플로는 생물학적 샘플에서 생리학적 수준으로 발현되는 당단백질에서 방출되는 황산화 및 비황산화 글리칸에 대한 검출 민감을 획기적으로 향상시킵니다.

    여기에 설명된 방법은 표준 분석 관행에 세심한 주의를 기울여 적용할 때 강력하고 재현성이 높지만, 가능한 오염원에 관한 몇 가지 고려 사항은 간략하게 언급할 가치가 있습니다. 모든 유리 제품이 매우 깨끗하고 먼지와 세제가 없는지 확인하는 것이 중요합니다. MS 스펙트럼...

    액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

    공개 사항

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    저자는 경쟁적인 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.

    감사의 글

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

    이 작업은 NHLBI/NIH의 보조금 P01HL107151 지원받았습니다. 저자는 또한 NIGMS/NIH의 보조금 P41GM103490을 통해 제공되는 기기에 대한 지원과 접근에 감사를 표합니다.

    액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

    재료

    이 논문에 사용된 재료 목록
    이름회사카탈로그 번호댓글
    물, 탈 이온수Sigma-Aldrich 270733-4LCHROMASOLV, HPLC
    아세트산 용, 빙하피셔A38-500인증 ACS≥ 99.7% w/w
    메탄올시그마-알드리치 34860-4L-RCHROMASOLV, HPLC 용, ≥ 99.9%
    암모늄 바이카보네이플루카09830-500GBioUltra, ≥ 99.5% (T), 1단계
    아세토니트릴시그마-알드리치 34998-4LCHROMASOLV Plus, HPLC 용, ≥ 99.9%, 단계 1
    에틸 아세테이Fluka34972-1L-RLC-MS CHROMASOLV, 단계 1
    나트륨 보로하이드라이드Aldrich213462-25GReagentPlus, 99%, 단계 2
    요오도메탄시그마-알드리치 289566-100G시약플러스, 99.5%,  6단계.  4 °에 저장; C를 사용할 때까지.  사용하기 전에 실온에 두십시오.
    수산화나트륨 용액, 50% w/wFisherSS254-1인증, Step 6
    디메틸 설폭사이드, 무수Sigma-Aldrich 276855-1L무수, ≥ 99.9%, 단계 6
    메탄올, 무수시그마-알드리치 322415-100ML무수, 99.8%, 단계 6
    디클로로메탄시그마-알드리치 34856-4LCHROMASOL®, HPLC용, ≥ 99.8%, 안정제로 아밀렌 포함, 단계 7
    Dowex 50WX8 수소 형태수소 형태 100-200  메쉬시그마-알드리치 217506-500G단계 3
    AG 50W-X8 수지 Bio-Rad142-1441단계 3
    BAKERBOND spe 1 ml x 100 mg 고체상 추출 컬럼, PP, 옥타데실 (C18) 역위상JT BakerJT-7020-01단계 5 및 8
    7.5% 미니-PROTEAN TGX 프리캐스트 젤 Bio-RadStep 1
    Bio-Safe Coomassie 염색 Bio-Rad161-0786G-250, 스텝 1
    실버 스테인 키트 질량 분석용피어스24600스텝 1
    올리고당 키트 (말토트리오스, dp3: R474140)Supelco 47265
    올리고당 키트 (Maltotetraose, Dp4: R474135)Supelco 47265
    일회용 파스퇴르 피펫, 유리, 짧은 팁VWR14673-010사용 전 세척
    PYREX 13 x 100 mm 일회용 둥근 바닥 나사 배양 튜브Corning99447-13사용 전 세척
    PYREX 16 x 125 mm 일회용 둥근 바닥 나사 배양 튜브Corning99447-16사용 전 세척
    PTFE 표면 고무 라이너가있는 페놀 캡 / 클로저Kimble45066C-13사용 전 세척
    Phenolic Caps/Closures with PTFE Faced Rubber LinerKimble45066C-15사용 전 세척
    Hamilton HPLC 주사기HAMILTON81265볼륨 500  &뮤; l, 바늘 크기 22 G
    Hamilton HPLC 주사기HAMILTON81165볼륨 250  &뮤; l, 바늘 크기 22 G
    Hamilton HPLC 주사기HAMILTON81065볼륨 100  &뮤; l, 바늘 크기 22s G
    Hamilton HPLC 주사기HAMILTON80965볼륨 50  &뮤; l, 바늘 크기 22s G
    Hamilton 보정 주사기HAMILTON80300볼륨 10  &뮤; l, 바늘 크기 26s G
    페트리 식기 유리 100 mm x 15mmGSC INTERNATIONAL INC1500-4사용 전 세척, 1단계
    Bard-Parker 수술용 칼날Fisher3713101단계
    Reacti-Therm 가열/교반 모듈Pierce188701, 4 및 7
    가열 블록Fisher125D2
    단계Pyrex 섬유 유리 울 보로실리케이트 모공 크기 8  &뮤; m AldrichCLS3950Step 3
    Fused Silica CutterTubing cutteralltech3194Step 3
    Multi-tube vortexers VWR444-7063단계 6
    동결건조기 25EL 프리즈모빌Virtis25EL
    원심분리기VWR임상 50
    LTQ Orbitrap DiscoveryThermo Fisher Scientific
    트 트 단계

    참고문헌

    $$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
    1. Varki, A. Biological roles of oligosaccharides: all of the theories are correct. Glycobiology. 3 (2), 97-130 (1993).
    2. Ohtsubo, K., Marth, J. D. Glycosylation in cellular mechanisms of health and disease. Cell. 126 (5), 855-867 (2006).
    3. Moremen, K. W., Tiemeyer, M., Nairn, A. V. Vertebrate protein glycosylation: diversity, synthesis and function. Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 13 (7), 448-462 (2012).
    4. Lowe, J. B., Marth, J. D. A genetic approach to Mammalian glycan function. Annu. Rev. Biochem. 72, 643-691 (2003).
    5. Yan, A., Lennarz, W. J. Unraveling the mechanism of protein N-glycosylation. J. Biol. Chem. 280 (5), 3121-3124 (2005).
    6. Washburn, M. P. Utilisation of proteomics datasets generated via multidimensional protein identification technology (MudPIT). Brief Funct. Genomic Proteomic. 3 (3), 280-286 (2004).
    7. Rosenfeld, J., Capdevielle, J., Guillemot, J. C., Ferrara, P. In-gel digestion of proteins for internal sequence analysis after one- or two-dimensional gel electrophoresis. Anal. Biochem. 203 (1), 173-179 (1992).
    8. Hellman, U., Wernstedt, C., Gonez, J., Heldin, C. H. Improvement of an 'In-Gel' digestion procedure for the micropreparation of internal protein fragments for amino acid sequencing. Anal. Biochem. 224 (1), 451-455 (1995).
    9. Morelle, W., Canis, K., Chirat, F., Faid, V., Michalski, J. C. The use of mass spectrometry for the proteomic analysis of glycosylation. Proteomics. 6 (14), 3993-4015 (2006).
    10. Mortz, E., Sareneva, T., Haebel, S., Julkunen, I., Roepstorff, P. Mass spectrometric characterization of glycosylated interferon-gamma variants separated by gel electrophoresis. Electrophoresis. 17 (5), 925-931 (1996).
    11. Kuster, B., Wheeler, S. F., Hunter, A. P., Dwek, R. A., Harvey, D. J. Sequencing of N-linked oligosaccharides directly from protein gels: in-gel deglycosylation followed by matrix-assisted laser desorption/ionization mass spectrometry and normal-phase high-performance liquid chromatography. Anal. Biochem. 250 (1), 82-101 (1997).
    12. Kuster, B., Mann, M. 18O-labeling of N-glycosylation sites to improve the identification of gel-separated glycoproteins using peptide mass mapping and database searching. Anal. Chem. 71 (7), 1431-1440 (1999).
    13. Aoki, K., et al. The diversity of O-linked glycans expressed during Drosophila melanogaster development reflects stage- and tissue-specific requirements for cell signaling. J. Biol. Chem. 283 (44), 30385-30400 (2008).
    14. Kozak, R. P., Royle, L., Gardner, R. A., Fernandes, D. L., Wuhrer, M. Suppression of peeling during the release of O-glycans by hydrazinolysis. Anal. Biochem. 423 (1), 119-128 (2012).
    15. Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. Small-scale analysis of O-linked oligosaccharides from glycoproteins and mucins separated by gel electrophoresis. Anal. Chem. 74 (23), 6088-6097 (2002).
    16. Thomsson, K. A., Schulz, B. L., Packer, N. H., Karlsson, N. G. MUC5B glycosylation in human saliva reflects blood group and secretor status. Glycobiology. 15 (8), 791-804 (2005).
    17. Taylor, A. M., Holst, O., Thomas-Oates, J. Mass spectrometric profiling of O-linked glycans released directly from glycoproteins in gels using in-gel reductive β-elimination. Proteomics. 6 (10), 2936-2946 (2006).
    18. Anumula, K. R., Taylor, P. B. A comprehensive procedure for preparation of partially methylated alditol acetates from glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem. 203 (1), 101-108 (1992).
    19. Aoki, K., Perlman, M., Lim, J. M., Cantu, R., Wells, L., Tiemeyer, M. Dynamic developmental elaboration of N-linked glycan complexity in the Drosophila melanogaster embryo. J. Biol. Chem. 282 (12), 9127-9142 (2007).
    20. Domon, B., Costello, C. E. A Systematic Nomenclature for Carbohydrate Fragmentations in Fab-Ms Ms Spectra of Glycoconjugates. Glycoconj. J. 5 (4), 397-409 (1988).
    21. Ashline, D., Singh, S., Hanneman, A., Reinhold, V. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 1. Mining structural details by MSn. Anal. Chem. 77 (19), 6250-6262 (2005).
    22. Lapadula, A. J., et al. Congruent strategies for carbohydrate sequencing. 3. OSCAR: an algorithm for assigning oligosaccharide topology from MSn data. Anal. Chem. 77 (19), 6271-6279 (2005).
    23. Ashline, D. J., et al. Carbohydrate structural isomers analyzed by sequential mass spectrometry. Anal. Chem. 79 (10), 3830-3842 (2007).
    24. Thomsson, K. A., et al. The salivary mucin MG1 (MUC5B) carries a repertoire of unique oligosaccharides that is large and diverse. Glycobiology. 12 (1), 1-14 (2002).
    25. Yu, S. Y., Wu, S. W., Hsiao, H. H., Khoo, K. H. Enabling techniques and strategic workflow for sulfoglycomics based on mass spectrometry mapping and sequencing of permethylated sulfated glycans. Glycobiology. 19 (10), 1136-1149 (2009).
    26. Yu, S. Y., et al. Priming mass spectrometry-based sulfoglycomic mapping for identification of terminal sulfated lacdiNAc glycotope. Glycoconj J. 30 (2), 183-194 (2013).
    27. Kumagai, T., Katoh, T., Nix, D. B., Tiemeyer, M., Aoki, K. In-gel β-elimination and aqueous-organic partition for improved O- and sulfoglycomics. Anal. Chem. 85 (18), 8692-8699 (2013).

    액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.

    재인쇄 및 허가

    이 JoVE 논문의 텍스트 또는 그림 재사용 허가 요청

    허가 요청

    태그

    OSDS PAGEC18

    관련 논문