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방법 논문

유동 세포 계측법에 의한 신장 상피 세포에서 세포 내 칼슘 측정

15.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51857

⸱

2014년 10월 28일

 , 
1Institute for Physiology, Pathophysiology, & Toxicology, Centre for Biomedical Research and Training (ZBAF), University of Witten/Herdecke, 2Institute for Immunology & Experimental Oncology, Centre for Biomedical Research and Training (ZBAF), University of Witten/Herdecke

이 논문에서

요약

칼슘이 많은 생리 학적 및 병태 생리 학적 신호 전달 경로에 참여하고있다. 라이브 세포 이미징 전문 장비가 필요하고 많은 시간이 소요될 수 있습니다. 현탁액하게 부착 상피 세포에서 사이토 졸 칼슘의 상대적 변화를 결정하는 유동 세포 계측기를 사용하여 신속하고 간단한 방법을 최적화 하였다.

초록

생리생리학적, 병태생리학적인 다양한 세포 과정에는 엑소사이토시스, 미토콘드리아 기능, 세포 사멸, 세포 대사 및 세포 이동을 포함하여 칼슘이 필요하거나 칼슘에 의해 지배됩니다. 세포질 칼슘은 일반적으로 낮은 나노몰 농도로 유지됩니다. 오히려 그것은 소포체, 미토콘드리아 기질 및 세포 외 구획에서 높은 마이크로 몰에서 밀리 몰 농도로 발견됩니다. 자극 시, 세포질 칼슘의 일시적인 증가는 다운스트림 이벤트를 알리는 역할을 합니다. 세포질 칼슘의 변화 감지는 일반적으로 칼슘 결합 염료로 설정된 살아있는 세포 이미징을 사용하여 수행되며, 이는 형광 강도의 증가 또는 칼슘 결합 시 방출 파장의 이동을 나타냅니다. 그러나 모든 연구자가 라이브 셀 이미징 설정에 무료로 액세스할 수 있는 것은 아닙니다. 유세포 분석을 통한 면역학적 세포와 형광 마이크로플레이트 리더를 통한 비면역학적 부착 세포에 대한 대체 검출 방법이 최적화되었습니다. 여기에서는 단일 파장 칼슘 결합 염료를 사용하여 유세포 분석으로 상피 세포의 변화를 감지하기 위한 최적화되고 간단한 방법에 대해 설명합니다. 일반적으로 염료로 적재하기 어려운 부착 신장 근위세뇨관 상피 세포는 프로베네시드(probenecid)가 있는 상태에서 형광 세포 투과성 칼슘 결합 염료를 적재하여 현탁액으로 가져오고 칼슘 신호를 탑시가르진(thapsigargin), 투니카마이신(tunicamycin) 및 이오노마이신(ionomycin) 첨가 전후에 모니터링했습니다.

서론

칼슘은 세포 생리 및 병리 생리 학적 신호 (1)의 전송을 담당하는 중요한 초 메신저. 세포질 칼슘 농도는 칼슘 펌프 및 칼슘 교환기의 활성을 낮게 유지된다. 근질 / 소포체 칼슘 ATP 아제 (SERCA)는 ATP 의존적 방식 모두에서 세포막 칼슘 ATPase를 (PMCA)는 세포 외 구획 칼슘 압출 반면 "펌프 누출"시스템의 일부로서 소포체 (ER) 칼슘 저장소 리필 2. 이러한 호르몬 또는 신경 전달 물질과 같은 생리 메신저, G 단백질 커플 링 수용체, 디아 실 글리세롤 및 이노시톨 트리 포스페이트 (IP3) (3)를 생성하는 세포막에 포스파티딜 이노시톨 4,5- 비스 포스페이트 (PIP2)을 가수 분해 포스 포 리파제 C의 활성화를 통해 신호를 전송한다. 디아 실 글리세롤은 세포막에 남아있는 반면, IP3은 세포질 내로 확산되어 IP3 수용체에 결합ER 막과 칼슘에서 발견 리간드 칼슘 채널 활성화의 (IP3Rs)는, 세포질 칼슘 농도 4의 증가에서 남중 소포체 내강 저장소에서 해제됩니다. 세포질에 도달하는 칼슘 대체 경로는 세포막에 존재하는 칼슘 채널 교환기 통해서이다. 이 두 구획 사이의 크로스 토크 설명 하였다 : 칼슘에 의한 칼슘의 세포 외 칼슘이 ER 저장 5에서 칼슘 방출을 유도 릴리스 (CICR), 저장이 STIM에 의해 감지 된 ER 저장 비우는 칼슘 항목 (SOCE)를 운영하고 Orai의 개방 원인 세포막에있는 칼슘 채널 ER 저장소 (6)의 재 충진을 촉진.

병태 생리 학적 조건 하에서, 세포 칼슘 응답 생리적 자극 (1)의 부재하에 탈과 사이토 졸 칼슘 증가이다. 칼슘 응답은 다수의 방식으로 영향을받을 수있다 : 칼슘 장기간신호, 세포질에서 칼슘 제거, 칼슘 저장 또는 칼슘의 지역화 변경의 고갈을 지연. 또한, 미토콘드리아는 버퍼링의 중심 역할을 수행하고 칼슘 (7)을 발표. 장기간 및 / 또는 supramaximal 세포질 칼슘 증가는 죽음을 셀에 연결됩니다. 사실, 칼슘보다 종종 셀룰러 병태 생리 학적 반응에 관여하며, 주로 세포 사멸과 관련된 신경 퇴행성 질병, 심장 질환, 암, 골 질환 및 신장 질환과 같은 질병의 광범위한 배열의 키 이벤트하지보다 손실 또는 장기 나 조직 기능 8-10의 변화와. 또한, 칼슘 신호의 섭동 셀룰러 적응 및 세포 기능과 응답의 변화에​​ 연결되었다.

전통적으로, 칼슘 신호는 세포 투과성 아세 (AM) 에스테르 형태로 세포 내로로드 음전하 형광 칼슘 지표로 측정된다. 일단 세포 esteras에 의해 절단ES, 형광 지표 세포 내 구획 내에 남아 칼슘이 결합하면 형광 강도의 증가. 가장 잘 알려진 및 사용 칼슘 표시기는 비율 계량의 Fura-2 로저 첸과 동료 (11)에 의해 개발되고있다. 칼슘 : 서로 다른 친화력과 칼슘 지표는 다른 칼슘 풀을 모니터링 할 수 있습니다. 검출 방법은 살아있는 세포 이미징, 형광 마이크로 플레이트 리더를 포함 유동 세포 계측법. (일반적으로 분 몇 초 이내) 칼슘 신호의 상대적으로 빠른 반응 속도는 칼슘 신호의 특성에 대한 대부분의 정보를 얻는 가장 좋은 방법 이미징 살아있는 세포를 만든다. 이외에도 (밀리 초 이내) 칼슘 신호의 빠른 동역학에서, 생균 이미징은 단일 셀 (12) 내 칼슘 신호 전달의 셀룰러 구획화를 연구하기위한 더 나은 방법이다. 절대 칼슘 농도는 칼슘 산업사의 최소 및 최대 형광을 결정함으로써 계산 될 수있다Grynkiewicz 등. (11)에 의해 기술 된 바와 같이, 각각 칼슘 킬레이트 제를 첨가하고 세포를 permeabilizing 의해 icator.

칼슘 신호를 측정하기 위해 유세포의 사용은 제 기회는 막 무결성 및 세포 집단을 분리하고, 단일 파장의 개발과 결합 현탁액 중의 세포의 요건과 같은 여러 파라미터를 측정하는 위치를 면역 세포에서 1980 년대에 개발 된 칼슘 지표는 이상과 convenientdetection 방법 13-15 유동 세포 계측법을했다. 부착 세포에서는 생균 이미징 칼슘 시그널링, 가장 중요한 키네틱 관한 대부분의 정보를 제공하지만, 취득하는 온도 등의 형광 현미경, 관류 시스템, 셀룰러 환경의 유지를 포함하는 복잡한 설정 및 특수 현미경 소프트웨어가 필요 데이터 분석. 이러한 형광 마이크로 플레이트 리더 또는 pharmacol 등의 다른 방법칼슘 킬레이트의 사용을 통해 ogical 수단이 얻은 정보의 측면에서 비교할 수 있습니다. 유동 세포 계측법은 더 넓게, 대부분의 연구에 불구하고 측정이 수행되는 경우에만 최종 점 접착 세포에서 사이토 졸 칼슘을 모니터링하는 데 사용되어 가고있다. 초기 게르 겔리 등의 문헌에 의해 개발 된 방법을 사용. 면역 B 세포 (16)에 실시간 속도론과 유세포 및 샘플 모집단 개별 셀에서 형광 강도를 모니터링하여 세포질 유리 칼슘 농도의 변화가 성공적 경부암 상피 세포에서 측정 된 암 줄기 세포는 17 잡종. 이 방법은 더 칼슘 지표 (18)로드하기 어려운 부착 상피 세포에 사용하기 위해 적응했다.

여기서, 쥐 신장 근위 세뇨관 (c12에 WKPT-0293) (19)의 S1 세그먼트로부터 유도 된 무한 증식 자기편 상피 세포주를 사용하여, 우리는 최적의 간략화를 설명 m유동 세포 계측법에 의해 세포 내 칼슘 농도의 변화를 측정하는 ethod. 많은 상피 세포는 음이온 성 화합물에 대한 유기 운송의 번호를 가지고 있기 때문에, 칼슘 표시기 세포의 로딩은 도전이 될 증명할 수 있습니다. 칼슘 지표, 프로 베네 시드, 페니실린 (20)의 신장 배설을 감소하기 위해 개발 된 원래 원형 유기 음이온 수송의 억제제와의 유출을 방지하기 위해, 배양 매체에 동시에 적용된다. 세포는 칼슘 인디케이터 로딩 단층 유지 화합물 첨가 후 즉시 검출 할 수 현탁액 칼슘 신호로된다.

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프로토콜

시약 및 솔루션 1. 준비

  1. 수정 된 행크의 균형 소금 용액 (HBSS) 준비 (mm 단위 : 136.9 염화나트륨, 5.37의 KCl, 0.34 나 2 HPO 4, 0.44 KH 2 PO 4, 4.17의 NaHCO3, pH를 7.2, 아니 페놀 레드). 4 ℃에서 보관.
  2. 1.5 M CaCl2를 2 M 4- (2- 히드 록시 에틸) -1- 피페 라진 에탄 술폰산 (HEPES) (pH를 7.2) 증류수 원액 만들기.
  3. 프로 베네 시드의 250 mM의 주식 솔루션을 준비합니다. ,, 1 N의 NaOH에 베네 시드 파우더를 녹여 증류수로 최종 부피의 3/4 채우고 천천히 1 N HCl로 pH를 7.4로 적정 유리 산 형태의 경우 (불용성으로 종종 지칭). 4 ℃에서 보관.
  4. 1mM이 스톡 농도 무수 디메틸 설폭 사이드 (DMSO)의 형광 막 투과성 칼슘 결합 염료 녹인다. 어둠 속에서 -20 ° C에 보관하십시오.
  5. 각 실험에 앞서, 갓 제조 베네 시드를 함유 H하여 BSS 플럭스 (PHF) 버퍼 (최종 농도) 1.5 mM의 염화칼슘 2, 10 mM의 HEPES, pH를 7.2, 5 % 소 태아 혈청, 2 MM의 프로 베네 시드, 및 5.55 mM의 포도당과 HBSS를 수정 결합하는. 37 ° C의 따뜻한.

2. 세포 배양

  1. 표준 배지에서 6 웰 플레이트 또는 35mm 접시의 웰 플레이트 당 2.5 × 10 5 신장 근위 세뇨관 세포 (c12에 WKPT-0293)과 약 70 % 포화 상태에 도달하는 2 일 동안 성장한다.

3. 칼슘 염료로드

  1. 각 웰 또는 접시를 들어, 5 % 소 태아 혈청, 4 μM 세포 투과성 칼슘 결합 염료 및 2 밀리미터 베네 시드를 함유하는 1 ml의 배지를 섞는다.
  2. 각 웰에 1 ml의 로딩 염료 혼합물과 배양 배지를 교체하고, 5 % CO 2의 가습 인큐베이터에서 30 분 동안 37 ° C에서 배양한다. 형광 표시기의 표백을 방지하기 위해 알루미늄 호일로 접시를 커버.

Ce의 제 담유동 세포 계측법에 대한 LLS

  1. 37 ° C의 따뜻한 0.05 % 트립신 에틸렌 디아민 테트라 아세트산 (EDTA) 솔루션입니다.
  2. 대기음 칼슘 로딩 염료 각 웰의 솔루션과는 우물의 벽을 따라 1 ml의 트립신을 추가합니다.
  3. 모든 세포가 분리 될 때까지 37 ° C에서 품어.
  4. 1 분 10,000 g에서의 microcentrifuge에서 원심 분리하여 1.5 ML 튜브 및 펠렛 세포를 전송합니다.
  5. 조심스럽게 펠렛을 방해하지 않고 뜨는을 대기음.
  6. 로 pipetting 아래로 1 ML의 PHF 버퍼에 resuspend을 추가하여 세포를 씻으십시오.
  7. 1 분 10,000 g에서 원심 분리하여 세포 펠렛.
  8. 반복 4.6 단계를 반복합니다. 4.7. 또 두 번.
  9. 500 μL의 PHF 완충액 최종 부피 세포를 재현 탁하고, 1 시간 내에 실험에 셀을 사용한다.
  10. 선택적 : 카운트 세포는 세포 농도를 결정하고, 5 × 104 사용할 - 측정 당 1 × 105 세포.

5. 흐름 CYT오 미터 설치

  1. , 흐름 cytometer 시작 플루이 딕스 서랍을 열고 시스 유체 탱크의 공기 압력을 증가시키는 통기 밸브 토글 스위치 플립.
  2. "프라임"내측 튜브 및 유동 챔버 내에서 잠재적 상주하는 공기 방울을 제거하는 기기.
  3. 유동 세포 계측법 소프트웨어에서 열린 두 점 플롯 창.
    1. 첫 번째 점 플롯은 앞으로 각각의 크기와 입도 (granularity)를 통해 시료 내에서 세포의 품질을 제어 할 수있는 Y 매개 변수의 X 매개 변수 및 측면 산란광 (SSC)에 대한 산란광 (FSC)가 필요합니다.
    2. 제 도트 플롯은 칼슘 - 결합 된 염료의 형광 강도를 측정한다. 리니어 스케일의 X 매개 변수에 대해 초 단위로 로그 스케일와 시간을 사용하여 Y 매개 변수에 대한 적절한 형광 검출 채널을 선택합니다.
  4. '높은'에 유량을 설정합니다.

6. 유동 세포 계측법 M전 측정

  1. RT에서 측정을 수행합니다. 샘플 튜브 (11.5 X 75mm) 유세포에서, 480 μL의 PHF 버퍼를 추가합니다.
  2. 혼합 20 μL 세포 현탁액 간략하게 소용돌이를 추가합니다.
  3. 측으로 튜브지지 암을 이동시키고 기밀 밀봉이 형성 될 때까지 시료 주입 관을 통해 샘플 튜브를 위치. 원래 중심 위치로 튜브 지지대를 돌려줍니다.
  4. 샘플의 평균 형광 강도가 약 10이 y 축상되도록 형광 채널을 조정하여 측정을 최적화. 저장하고 다음 실험을 위해 사용합니다.
  5. 실험을 시작하려면, 반복은 6.3에 6.1 단계를 반복합니다.
  6. 50 초 동안 기록 기준 형광.
  7. 간단히 추가, 관심, 소용돌이의 화합물을 샘플 튜브를 제거하고 시료 주입 관으로 돌아가 측정을 일시 중지합니다. 이 단계는 15 개 이상의 초를 복용해서는 안된다.
  8. 측정을 다시 시작하고 204.8 초 총 계속합니다.
  9. 칼슘 사용 ionophore 같은 이오 노마 이신 (10 μM), 및 에틸렌 글리콜 디아민 테트라 아세트산 (EGTA) 같은 칼슘 킬레이트 제, MnCl 2의 CoCl2 (2 mM)을 각각 양성 및 음성 대조군에 대한.

7. 데이터 분석

  1. 이러한 WinMDI (유동 세포 계측법 용 Windows 다중 문서 인터페이스), 스크립스 연구소, 유동 세포 계측법 핵심 시설에 조 트로터가 개발 한 무료 소프트웨어 패키지와 오프라인 분석을 위해 전용 유동 세포 계측법 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석 할 수 있습니다.
  2. SSC와 FSC 매개 변수를 사용하여 도트 플롯을 엽니 다.
  3. "지역"도구를 사용하여 분석을위한 세포의 지역을 선택 죽은 세포 또는 데이터 분석에서 왼쪽 하단에있는 세포 파편 (그림 1)를 제외 (이미지에 마우스 오른쪽 단추로 클릭).
  4. 쿼드런트 분석 (그림 2)
    1. y 축상의 x 축과 형광 강도에 시간 밀도 플롯을 연다. 모든 이벤트를 사용합니다.
    2. 우리7.3과 동일한 게이팅 영역 전자.
    3. "사분면"도구를 사용하여 데이터를 정량화.
    4. 수직선은 화합물 첨가시에 놓이고 수평 라인이 대조군에서 기준선 형광의 중앙에 위치되도록 사분면 세퍼레이터를 조정. 사분면 구분의 위치가 모든 샘플에서 동일한 지 확인합니다.
    5. 각 사분면에있는 세포의 비율은 각 모서리 (그림 2)에 표시됩니다. 샘플 사이의 사분면 (UR)를 비교한다.
  5. 히스토그램 분석 (그림 3)
    1. y 축상의 x 축 및 이벤트에 대한 형광 강도 히스토그램 창에서 제어 데이터를 연다. 모든 이벤트를 사용합니다.
    2. 화보 개요, 오버레이 플롯으로 제어 플롯 (파일 → 오버레이 → 파일 열기 → 파일로 이동)에 비교하는 테스트 데이터를 추가 할 수 있습니다.
    3. 정량 분석​​의 경우, 하나의 히스토그램은 승리dows 사용해야합니다. 게이트 단계 7.3에서 영역 R1을 사용하여 세포 집단.
    4. 비 처리 제어에서, 최대 형광 강도의 최소값과 제어 피크의 최대 형광과 끝점 사이 중간 지점에서 시작하는 분석 영역을 표시하기 위해 ( "마커") 마커 기능을 사용한다. 이 영역에서의 세포의 비율이 계산된다.
    5. 통계 창에서 데이터를 검색합니다. 분석을 위해 동일한 표시된 영역을 이용하여 데이터 파일을 나머지에 대해 반복.
  6. 형광 강도 분석 (그림 4)
    1. y 축상의 x 축과 형광 강도의 시간 도트 플롯을 연다. 모든 이벤트를 사용합니다.
    2. "속도론 모드"와 "오버레이 속도론 라인"을 사용합니다. 파란색 선은 평균 형광 강도를 나타내는 도트 플롯에 나타납니다.
    3. 여러 사각형 영역을 만들어 상대 칼슘 유입을 정량화. 각 지역은 아 있어야한다"10 초"에 해당 "50", 약 idth. 15 사각형 영역을 정의.
    4. 통계 창에서 정량화를 검색하고 스프레드 시트에 복사합니다.
    5. 분석을 위해 Y-평균 데이터를 사용합니다. 20 초 50에 해당 R6에 R2의 평균을 계산합니다. 이 기준값이다.
    6. 칼슘 유입 분석 (발병, 기간 및 강도에 따라 다름)에 대한 적절한 시간 간격을 선택합니다.
    7. , 평균 기준값이 시간 간격 내에서 상대 100 %로 설정되는 화합물을 첨가 전에 즉, 형광 신호를 각 영역에서의 칼슘 신호를 계산한다. 화합물 첨가를 게시 평균 및 표준 편차의 영역을 결정하고; 이 화합물에 의해 유발 된 평균 칼슘 신호이다.

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결과

세포질 칼슘을 증가시키기 위해, 두 약물 화합물은 세포 투과성 칼슘 결합 염료, FLUO-3-AM로드 신장 근위 세뇨관 세포 (WKPT-0293 c12에)에 적용되었다. Nontreated 대조 시료는 베네 시드의 존재하에 칼슘 결합 염료로드 된 혼합 그러나 어떤 화합물의 첨가없이 하였다. 쌥시 가르 긴 (TG)는 ER에서 누출로 이어지는 증가 세포질 칼슘의 결과로 SERCA 펌프의 고전적인 억제제이다. Tunicamycin (TUN) 블록 펼쳐진 단백질 반응의 활성화로 이어지는 단백질의 N-당화뿐만 아니라 세포질 칼슘 18,21 증가합니다. 양성 대조군, 이오 노마 이신 (IONO)로서, 세포 외 칼슘 세포막 투과성 만드는 칼슘 이온 운반체를 사용 하였다. 분석을 위해, 세포 집단은 (도 1에 R1) SSC / FSC 도트 플롯에서 지역을 선택하여 게이팅 하였다. 대 시간 형광 강도 대 밀도 플롯은 각각의 데이터 파일을 작성. 사분면 함수를 사용함으로써 도트 플롯 기준선 형광...

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토론

칼슘은 제 메신저 신호 전달 분자로서, 또한 ER 및 미토콘드리아 사이에서 통신하기위한 수단으로 작용하는 다수의 세포 과정에 키 이벤트이다. 자유 세포질 칼슘 농도의 변화를 측정하는 능력은 세포 생물학의 모든 영역에 적용 할 수있는 유용한 기술이다. 사이토 졸 칼슘 신호를 검출하기위한 다양한 방법이있다. 고전 등의 Fura-2와 같은 칼슘 비율 계량 표시기로부터의 신호는, 형광 촬상 설정 및 절대 칼슘 농도를 이용하여 살아있는 세포에서 모니터링이 최소 및 최대 형광 강도를 결정하는 단계로부터 유도 될 수있다. 그러나,이 기술은 형광 현미경, 설정 생균 이미징 및 분석 소프트웨어와 같은, 특수 장비를 필요로한다. 여기서, 우리는 대부분의 실험실에 액세스 유세포 분석기를 사용하여 부착 성 상피 세포의 시토 졸, 칼슘 검출을위한 간단한 방법을 설명한다.

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

실험실에서 연구 프리츠 - 벤더 재단, 뮌헨, 독일 (TD에)와 (W.-KL에) 위튼 / Herdecke 내부 연구비의 대학 재정 지원된다. 우리는 도움이 제안을 (생리학, 병태 생리 및 독성, 위튼 대학 / Herdecke 연구소) 교수 박사 박사 프랭크 Thévenod에게 감사의 말씀을 전합니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
플루오-3, AM인비트로젠F-1241 세포 투과성
프로베네시드시그마-알드리치P-8761수불용성, 1 N NaOH
0.05% 트립신-EDTA (1X)인비트로겐25300-062
아이오노마이신시그마-알드리치I9657
타프시가르진토크리스 생명과학1138
투니카마이신시그마-알드리치T7765
FACS칼리버 유세포분석기 + CELLQuest softwareBecton Dickinson
Windows Multiple Document Interface for Flow Cytometry (WinMDI)JoeTrotter, The Scripps Institute이 응용 프로그램은 FCS 2.0 호환 파일을 읽지만 FCS 3.0 디지털 데이터는 인식하지 못하는 구형 16비트 응용 프로그램입니다.
WKPT-0293 Cl.2 쥐 신장 근위세뇨관 세포주Dr. Ulrich Hopfer(생리학 및 생리학과)에 의해 제공됨 생물물리학, Case
Western Reserve University, Cleveland, OH)

참고문헌

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