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방법 논문

동물의 신속한 유전자형은 뇌 신경 세포의 차 문화 구축에 이어

16.1K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/51879

⸱

2015년 1월 29일

 ,  ,  , 
1Department of Molecular Physiology & Biophysics, University of Iowa Carver College of Medicine, 2Department of Psychiatry, University of Iowa Carver College of Medicine, 3EZ BioResearch LLC

* These authors contributed equally

이 논문에서

요약

우리는 라벨 및 신생아 쥐의 유전형과 그들로부터 차의 연결을 문화를 생성하는 절차에 대해 설명합니다. 유전자형은 신속하고 효율적이며 신뢰성 및 자동 핵산 추출 할 수 있습니다. 이 neonatally 치명적인 마우스와 유전자형의 이전 완료를 필요로 그들의 문화에 특히 유용합니다.

초록

포유류 신경 세포의 형태와 기능의 고해상도 분석은 종종 뉴런의 일차 배양 분석 하였다 개별 동물의 유전자형을 필요로한다. 유전자형되는 신생아 마우스, 빠른 유전자형 레이블, 이러한 마우스의 뇌 신경 세포의 저밀도 문화를 확립 : 우리는 절차의 집합을 설명합니다. 개별 마우스는 성인이 지속되는 장기 식별 할 수 있습니다 문신에 의해 표시되어 있습니다. 설명 프로토콜에 의한 유전자형 빠르고 효율적이며, 좋은 안정성과 핵산 자동 추출 할 수 있습니다. 이 신생아 치사 고통 생쥐에서, 예를 들어 기존의 유전자형 충분한 시간을 사용할 수없는 상황에서 유용합니다. 기본의 연결을 문화가 높은 공간 해상도 이미징 실험을 가능하게 낮은 밀도에서 생성됩니다. 이 배양법 종래 신경 교세포 도금 세포층의 제조를 필요로한다. Protocol은 운동 장애 DYT1 된 근긴장 (ΔE-torsinA 녹아웃 생쥐)의 마우스 모델에 전체적으로 도포하고, 신경 세포 배양은 이들 마우스의 해마, 대뇌 피질 및 선조체로부터 제조된다. 이 프로토콜은 다른 종의 동물뿐만 아니라, 다른 유전 적 돌연변이 마우스에 적용 할 수있다. 또한, 프로토콜의 개별 구성 요소는 격리 된 서브 프로젝트를 위해 사용될 수있다. 따라서이 프로토콜은 신경 과학뿐만 아니라 생물학 및 의료 과학의 다른 분야에서뿐만 아니라 다양한 응용 프로그램을해야합니다.

서론

유전병의 설치류 모델은 정상 단백질과 핵산뿐만 아니라, 이들의 결함의 병태 생리 학적 결과의 생리 기능을 확립하는데 유용 입증되었다. 예로는 주요 세포 기능에 관여하는 단백질 결핍 마우스뿐만 아니라 알츠하이머 질환과 같은 질환의 마우스 모델을 포함한다. 그러나, 특정 유전자 조작 곧 신생아 치사 또는 출생 후 몇 일이 발생할 수 있습니다. 이 경우, 일차 세포 배양 생균 사망 전 배아 또는 신생아 새끼로부터 획득 될 수 있기 때문에 중요한 도구들은 시험 관내에서의 적어도 몇 주 동안 유지 될 수 있으며,이 시간 동안 초기 신경 발달은 다음 수 생화학 적 기능과 형태 학적 실험. 차 배양 들어, 저밀도 뉴런 판형 것이 유익 할 수있다; 이것은 개별 세포체, 수상 돌기 축삭 통로 및 신경 TERMI을 시각화하는 것을 가능하게높은 공간 해상도 NALS. 그러나, 낮은 밀도에서 뉴런의 생존과 분화는 일반적으로 그들이 신경교 영양 세포층에 플레이 팅되는 것을 필요로 공 배양 한 신경교 의해 컨디셔닝 물리적 그들과 접촉, 또는 배지에서의 부재와 신경 교세포.

아교 세포층에 저밀도의 연결을 문화의 설립은 사전에 신속하고 신뢰할 수 유전자형에 종속 될 수 있습니다 - 몇 일에 대비 몇 시간 내에. 신경 유전자형 미리 준비된 신경교 세​​포층의 것과 일치해야 할 때 속도는 특히 중요하다. 더 구체적인 예로서, 그 유전자형이 새끼 실험의 효율을 최적화하기 위해, 생성 배양에 사용할 것인지를 결정하는 것이 필요할 수있다.

여기에서 우리는 이전의 출판물 2-6, 빠르고 간단하고 신뢰할 수있는 마우스 유전자형에 사용 된 작업 프로토콜을 보여줍니다. 마우스 꼬리와시중에서 판매하는 키트가 사용된다. 이 프로토콜은 조직으로부터의 단일 핵산 추출 단계를 포함하고, ( '정지 용액'), 핵산 정제 공정이나 종단 버퍼의 이용도를 필요로한다. 유전자형이 방법의 신뢰성은 차이 시험편의 개시 량, 동물의 연령 및 PCR 증폭 산물의 길이에 대하여 소개하는 경우 일련의 테스트의 결과를 제시하여 설명한다. 이 키트는 자동 추출 및 신뢰성의 이점을 제공한다.

포괄적 인 위해, 유전자형 생쥐의 장기 식별 문신의 용도도 설명된다. 문신 (표피 하) 피부의 진피 문신 잉크를 적용함으로써 달성된다 7. 절차가 이러한 꼬리 문신 발가락 등 신체의 다른 부분에 적용 할 수 있지만, 신생아 또는 1 일된 쥐의 발바닥 문신에 기술되고,하기 ANIM모든 연령의 루게릭 병. 또한 절차는 신경교 세포층 2,8의 다른 유형의 최적화에 기초하여 제조, 저농도 마우스 뉴런 도금 및 배양 입증 될 것이다.

(; p.Glu302del / p.Glu303del c.904_906delGAG / c.907_909delGAG) 9 유전자 TOR1A의 돌연변이에 의해 발생하는 상 염색체 지배적 인 운동 장애 - 우리는 상속 된 신경 학적 장애 DYT1의 근육 긴장의 유전 마우스 모델을 사용하고 있습니다. 단백질 전개, 단백질 복잡한 분해, 막 인신 매매 및 소포 융합 : 인코딩 된 단백질, torsinA는, 누구의 회원 일반적으로, 보호자와 같은 기능을 수행에서 지원 (단 +) 단백질의 가족, "다양한 세포 활동과 연관 -ATPase를"에 속하는 10-13. 돌연변이 글루탐산에 대한 코돈의에서 프레임 삭제하고 따라서 '조기 발병 일반화 고립 된 근육 긴장 이상'14, 15의 발현으로 이어질 수 있습니다. 그러나, 경로이 질환에 대한 책임 ophysiological 메커니즘을 제대로 이해 남아있다. 녹아웃 마우스 모델에서, 돌연변이 대립 유전자 Tor1a ΔE로 이하 언급 Tor1a tm2Wtd이다. 이형 ΔE-torsinA 녹아웃 생쥐 DYT1의 근육 긴장 이상으로 실행 가능하고 유 전적으로 모방 인간의 환자이며, 반면에 동형 접합 노크에 쥐가 유전 적 배경 (18)에 의해 영향을받는 출생 후 사망에 대기 시간, 출생 16, 17 후 죽는다. 동형 접합 노크에서 마우스의 조기 사망은 동물의 유전자형과의 연결을 문화의 설립이 모두 빠르게 완료되었는지 필요로한다. 유전자형의 다른 예로서, Tfap2a (전사 인자는 AP-2α, 인핸서 2α 단백질 결합을 활성화하는) 사용될 것이다. 이 유전자에 의해 코딩되는 단백질은 증식, 분화, 생존 및 사멸 (19) 같은 다수의 세포 과정을 조절하는 것이 중요하다.

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프로토콜

참고 : 본 연구에서 수행되는 모든 동물 절차는 아이오와 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

발 패드를 문신 사용하여 마우스 1. 장기 식별

  1. 실험에 직면 발 패드 (발바닥 표면)과 발을 고정. 엄지 손가락과 집게 손가락으로 발바닥을 잡아. 발을 끼지 않도록주의하십시오.
    주 : 안정 고정화 문신 안료 발 패드의 진피 내로 배치되도록하는 것이 중요하고, 따라서 영구 7이다.
  2. 거즈 스폰지 또는 면봉에 70 % 에탄올로 발 패드를 면봉.
  3. 면봉에 스킨 오일을 적용하고 부드럽게 발 패드 차례의 표면에 대한 팁을 누릅니다. 피부 오일의 소량만을 사용; 존재하는 경우 다량으로, 그것은 피부에 도달하는 문신 안료를 방지 할 것이다.
  4. 직전 문신 잉크로 문신 바늘의 팁을 찍어문신에. 통증 및 감염의 가능성을 감소하고, 또한 문신 효율을 높이기 위해, 깨끗하고 선명한 무균 문신 바늘을 사용한다.
  5. 발 패드 표면은 피부의 기름으로 덮여 있지만, 발 패드의 중앙에 수직으로 피부에 가볍게 문신 바늘 팁을 누르고, 여러 번 잉크를 분사. 전기 문신 시스템에 대한 자세한 내용은 재료 / 장비의 표를 참조하십시오.
  6. 부드럽게, 거즈 스폰지에 70 % 에탄올 스프레이 피부 표면에 여분의 문신 색소를 제거하는 발에 대해 그것을 누르고, 문신의 품질을 검사합니다. 발 패드의 중간 정상 피부 착색과 다른 어두운 둥근 반점을 가지고 있는지 확인하십시오. 문신 어둡거나 쉽게 볼 충분하지 않은 경우, 종래 문신 단계를 반복한다.

고속 PCR 유전자형 키트를 사용하여 2. 유전자형 신생아 마우스

  1. 70 % 에탄올 마우스 꼬리의 말단부 소독 꼬리 5mm 이하 잘라팁 및 PCR에 사용 된 형태의 8 튜브 스트립의 튜브에 옮긴다. 시편 간의 교차 오염을 방지하기 위해 각 강아지 미사용 면도날을 사용한다. 대안 적으로, 가위를 사용하지만,이 경우에는, 빠짐없이주의 70 % 에탄올을 사용하여 블레이드의 나머지 조직을 제거. 출혈을 확인합니다. 출혈이 발생하면 출혈이 멈출 때까지, 거즈 스폰지로 꼬리의 절단 부분에 압력을 적용합니다.
  2. 표본을 포함하는 각 PCR 튜브에 DNA 추출 용액 200 μl를 추가합니다. 키트에 대한 조성 및 정보 재료 / 장비의 표를 참조하십시오.
  3. PCR 서멀 사이 클러로 튜브 스트립을 배치하고, 다음 프로그램을 이용하여 DNA 추출을 시작하는 1 사이클을 55 ° C에서 10 분, 10 분 동안 95 ° C에서 1주기, 4 ℃에서 들고.
    주 :이 나중에 PCR에 사용 된 것과 동일한 PCR 서열 증폭기이다.
  4. DNA 추출이 완료되면, 유전자 증폭기의 튜브로부터 스트립을 제거차 5 번 반전.
  5. 미사용 8 튜브 스트립의 튜브 및 혼합 각 시편의 전송 솔루션 (DNA 추출물)의 4 μL : 2X PCR 준비 믹스 II의 10 μL, 앞으로 및 역방향 프라이머를 혼합 2 μL (에 권장 0.5 μM, 각 시료에 대한 핵산 분해 효소가없는 H 2 O의 시퀀스 재료 / 장비의 표 참조), 4 μL. 탁상 형 원심 분리기를 사용하여 스핀 짧게 (예를 들어, 3 초). 처리하는 경우를 제외하고는 항상 얼음에 튜브를 유지합니다.
  6. 열 순환을 수행합니다. 참조 열 프로그램에 대한 재료 / 장비의 표.
  7. 증폭 된 DNA의 제품을 감지합니다. 직접 아가 로스 젤의 우물에 PCR (20 μL)에서 총 반응 액을 넣습니다. 별도의 우물에 분자량 마커를로드합니다. 전기장을 적용합니다.
  8. 자외선 아래 밴드의 형광 이미지를 획득.

마우스 뇌 신경 세포의 3 차 문화폐해 세포층에의

참고 : 뇌 해부 및 세포 해리 (3.1)에 대한 절차는 모든 후속 절차에 공통입니다. 마우스 아교 세포 배양을위한 절차 (3.2), 쥐 아교 세포 배양 (3.3), 마우스의 연결을 문화 (3.4) 이후에 별도​​로 설명되어 있습니다.

  1. 뇌 해부 및 세포 Dissocaiation
    1. 신속하게 뇌를 제거하고 행크스 '솔루션으로 배치, 잘린 하나의 마우스 또는 쥐 새끼를 희생 (조성은 표 1 참조) + 20 % (얼음에 보관) 35mm 접시에 소 태아 혈청 (FBS).
    2. 두 개의 반구로 중간 선을 통해 뇌를 잘라. 뇌의 각 반구에서 관심 영역 (예를 들어, 대뇌 피질, 선조체 (striatum)와 해마)를 제거합니다. 표면의 수막 및 주요 혈관을 제거합니다. 수술 블레이드를 사용하여 4-10 얇은 조각으로 뇌 영역을 잘라.
    3. 재치되면, 15 ML의 원심 분리 관에 뇌 조각을 씻어시간 행크스 '솔루션 + 20 % FBS, 행크스와 다음 3 회'(혈청이없는 즉,) 솔루션 (4 ° C에서). 린스 5-10 ml의 용액을 추가 슬라이스 튜브 바닥에 침전 뇌, 위에서 용액을 흡인하도록하고 신선한 용액을 첨가한다. 솔루션을 흡입하여 세척 절차를 마칩니다.
    4. 3 ㎖ 주사기가 0.2㎛ 시린지 필터를 사용 트립신 - 함유 소화 용액 (조성은 표 1 참조) 2 ㎖를 여과하고 뇌 조각을 함유하는 튜브에 직접 여액을 추가한다. 트립신은 실온에서 13 분 동안 진행하자.
    5. 그것의 대부분을 흡입하여 다음 7 ~ 10 ml의 행크스 '솔루션 + 20 % FBS (4 ° C)의 추가하여 먼저 트립신 용액을 중화.
    6. 행크스 두 번, 뇌 조각을 씻어 '솔루션 + 20 % FBS 및 행크스와 3 회'솔루션 (즉, 혈청없이) (4 ° C에서). 오디오 솔루션을 흡입하여 세척 절차를 완료이온.
    7. 3 ㎖ 주사기가 0.2㎛ 시린지 필터를 이용하여 해리 용액 (조성은 표 1 참조) 2 ㎖를 필터링 및 뇌 슬라이스 튜브에 직접 여액을 추가한다.
    8. 기계적으로 보이는 조직 조각이 사라질 때까지 부드럽게, 10 ~ 20 시간을 분쇄하여하여 세포를 떼어 놓다. 솜 연결, 화재 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 분쇄하는 동안 거품을 피하십시오.
    9. 작은 조각이 정착을 위해 3 분을 기다립니다.
    10. 용액의 대부분을 이동시켜 (~ 1.5 ㎖, 하단 일부 용액을 떠나)을 사용하여, 3 ㎖ 행크 용액 + 20 % FBS 용액 (39 °의 C)를 포함하는 15 ml의 원심 분리 튜브에 목화 꽂혀, 방화 광택 파스퇴르 피펫. 맨 아래에있는 퇴적물의 포함은 일반적으로 문화의 저하를 초래하기 때문에 모든 솔루션을 전송하지 마십시오.
    11. 4 ° C에서 ~ 185g (~ 1,100 RPM)에서 13 분 동안 원심 분리기.
    12. 조심스럽게 뜨는을 대기음,추가 1 ml의 미리 예열 펠릿 중간 (37 ° C)을 도금, 부드럽게 솜 연결, 화재 광택 파스퇴르 피펫을 사용하여 여러 번 피펫 팅하여 재현 탁.
      주 : 매체 도금 세 종류의 다른 배양 목적에 사용된다 : 마우스 뉴런 배지 -2- 도금, 마우스 신경교 세포 용 배지 -1- 도금 및 래트 뉴런 및 신경교 세포 배지 -3- 도금 (조성물은 표 1을 참조) .
    13. 또는 자동 혈구 세포 계수기를 사용하여, 세포 현탁액 10㎕를 꺼내 0.4 % 트리 판 블루 용액 10 μL와 혼합하고, 생균의 밀도를 측정한다.
  2. 마우스 폐해 문화
    1. 마우스 세포의 건강한 문화를 확립하는 데 도움이 된 커버를 세척 할 것.
      1. 유리 페트리 접시에서 70 % 질산에 커버 글라스 (원형, 12mm 직경)을 담근다. 알루미늄 호일을 사용하여 빛으로부터 보호하고, 진탕 기의 O / N에 놓습니다.
      2. 유리 coversli을 씻어증류수로 페트리 접시에서 PS 세 번 이상. 증류 된 물에 담가. 진탕 O를 /의 N에 접시를 놓습니다.
      3. 생물 안전 캐비닛 와트 150mm 필터 종이에 커버 슬립을 건조.
      4. 커버 슬립을 압력솥.
      5. 24 웰 배양 접시로 된 커버를 놓습니다.
    2. 1 단계와 2 단계에 따라 레이블 및 유전자형 신생아 쥐.
    3. 3.1 단계에 따라, 마우스 새끼의 뇌 세포를 얻습니다.
      참고 : 대뇌 피질의 사용은 마우스 아교 세포층을 준비하기위한 전형이다. 그러나, 해마 및 선조체 같은 다른 뇌 영역은 인해 상이한 개수 및 상이한 영역에서 세포의 수율 셀 밀도의 조정 후 적절한 작동 할 것이다.
    4. 미리 예열 최종 세포 현탁액 중간-1 도금 ~ 4 ML을 추가 (1 ~ ㎖). 사전 온난화 문화 미디어의 경우, 문화 인큐베이터에서 솔루션 (5 % CO 2 -95 %의 O 2, 37 ° C) O / N,에 배치온도와 산도 값이 안정 될 수 있도록.
    5. 목화 연결, 화재 연마 파스퇴르 피펫을 사용하여, 코팅 T25 문화 플라스크에 세포 현탁액을 전송합니다. 문화 인큐베이터에서 플라스크를 놓습니다.
    6. 시험 관내 (DIV)에서 일일에서 두 번 도금와 T25 플라스크에서 배양 된 세포를 씻어 매체-1 (4 ° C). 인큐베이터로 플라스크를 놓습니다. 소용돌이 모션에서 여러 번 새로운 배지의 ~ 5 mL를 추가, 완전히 파스퇴르 피펫, 플라스크 내부 매체를 흡입 조심스럽게 플라스크를 기울여 세척 수행합니다.
    7. 6-9 DIV에서 (즉, 하나의 트립신 전날과 3.2.8-3.2.13 단계에서, 된 커버에 도금), (세포 외 기질 단백질로 코팅 재료의 100 μl를 배치에 대한 의견을 재료 / 장비의 표를 참조 코팅 배양 접시에서 커버 글라스에 재료), 그리고 문화 인큐베이터에서 배양 접시를 놓습니다.
    8. DIV 7-10에서, 세포를 20-4 때0 % 합류 (공간적으로 연속)는 이들을를 Trypsinize.
      1. 플라스크 내의 모든 솔루션을 흡입하고 ~ 행크스 '솔루션 (4 ° C)의 13 ml에 추가하여, 한 번 플라스크를 씻어 부드럽게 소용돌이 치는 동작으로 플라스크를 여러 번 기울 완전히 솔루션을 대기음.
      2. 4 ml의 트립신 EDTA 용액에 DNase의 용액 (최종 농도 750 단위 / ㎖)의 40 μL를 추가 0.2 μm의 주사기 필터를 통해 용액을 통과하고, 플라스크 내의 세포에 직접 여액을 추가한다.
      3. 트립신은 인큐베이터에서 37 ° C에서 13 분 동안 진행하자.
      4. 플라스크에 100 % FBS (39 ° C) 2 ㎖을 첨가함으로써 트립신을 중화 용액.
      5. 행크스 '솔루션 + 20 %의 FBS (4 ° C)에서 원심 분리기 ~ 4를 가하여 5 ~ 10 ㎖의 피펫을 사용하여 15 ㎖의 원심 분리 튜브에 트립신 세포로 이동 ~ 185g, 13 분 동안 4 ° C 상층 액을 대기음.
    9. 사전 warme 1 ㎖에 펠렛을 재현 탁D 도금 매체-1.
    10. 단계 3.1.13에 따른 세포의 밀도를 측정한다.
    11. 커버 슬립에 재현 탁 ~ 신경교 세​​포의 50 μL를 도포 커버 글라스 완전히 재료 및 기음 플레이트.
      참고 :이 세포는 아교 세포층을 설정합니다.
    12. 인큐베이터 된 커버와 배양 접시를 놓습니다.
    13. 20 ~ 60 분 후, 미리 예열이 잘 각 매체-1 도금 1 ㎖를 추가하고 인큐베이터에서 접시를 놓습니다. 주 : 도금 배지 첨가 동안, 커버 슬립이 배지에서 부유하지 않도록, (어떠한 도금 세포가없는) 커버 슬립의 주연을 눌러 다른 피펫을 사용하는 것이 도움이 될 것이다.
    14. (유리 커버 슬립에서 예) 폐해 세포층 1 DIV에서 1 ml의 배지를 교체 미리 예열 도금 중간 1 웰 모든 용액을 흡입 한 다음 신선한 배지로 채워서.
    15. 아교 세포층의 2-3 DIV에서 때 CEL각 웰에 따라서 DNA 복제 및 행을 억제하기 위해, LS는 유사 분열 억제제 (81.2 및 204.8 μM의 최종 농도 각각 5- 플루오로 -2'- 데 옥시 우리 딘 + 우리 딘의 혼합물을 10 μL)을 추가 80-100 %의 합류 아르 신경교 세​​포 증식을 억제.
    16. 세포 90-100 %의 컨 플루 언트 (폐해 세포층에 뉴런 도금 전 1-2 시간) 7-9 DIV 경우에서와 배지를 교체 미리 예열 도금 중간이 (37 ° C).
      주 : 뉴런 단계 3.4를 사용하여, 같은 날에 플레이 팅한다.
  3. 쥐 폐해 문화
    1. 코트 같은 도료와 T25 플라스크 배양.
      주 :이 단계 3.3.5 비 부착 세포의 제거 이후에​​ 필요하다.
      1. 플라스크에 코팅 재료의 2.0 ML을 추가하고, 문화 인큐베이터에서 플라스크를 배치합니다.
      2. 2-3 시간 후, 플라스크의 바닥 건조가되도록 완전히 도료 대기음.
    2. 세포를 얻기래트 새끼로부터 3.1 단계에있어서.
      주 : 해마 CA1-CA3 영역 래트 신경아 피더 층의 제조에 사용된다. 그러나, 대뇌 피질 및 선조체 같은 다른 뇌 영역은 인해 상이한 개수 및 상이한 영역에서 세포의 수율 셀 밀도의 차이를 보정 한 후에 작동 할 것이다.
    3. 미리 예열 최종 세포 현탁액에 중간 3 도금 ~ 4 ML을 추가 (1 ~ ㎖).
    4. 목화 연결, 화재 연마 파스퇴르 피펫을 사용하여, 코팅 T25 문화 플라스크에 세포 현탁액을 전송합니다. 문화 인큐베이터 (5 % CO 2 -95 %의 O 2, 37 ° C)에서 플라스크를 놓습니다.
    5. 2-3 DIV에서 세포 20-40 %의 컨 플루 언트 될 때, 단단히 뚜껑을 닫은 플라스크를 흔들어, 미부착 된 또는 약하게 부착 세포를 제거 격렬 ~ 10 배, 용액을 흡인하고, 도금 4-5 mL를 넣은 매체-3 (4 ° C에서). 한 번이 절차를 반복합니다. 예를 들어 (전체 플라스크 바닥에서 배양 된 세포를 검사,완전히 제거된다) 전지 본체의 외부 테두리가 위상 밝다 해당되는 즉 신경을 (나타날 것과 확인하는 위상차 현미경)을 사용. 이러한 세포를 제거하고 인큐베이터에 플라스크를 반환 할 필요 시마다 절차를 반복합니다.
      참고 : 강도와 개별 실험자 다를 수 있습니다 필요한 '쉐이크'의 총 수. 중요한 것은 일련 번호 쉐이크의 총 수를 유지하는 것이 아니라 신경 세포 유사 세포를 제거하는 것을 확인하기 위해이 아니다.
    6. 6-8 DIV에서, 세포 90-100 %의 합류 통로 단계 3.2.8에서 그들을 trypsinizing으로 아교 세포를 때.
    7. 원심 분리 후, 코팅되지 않은 T75 플라스크에 트립신으로 세포를 전송 매체-3 (39 ° C)를 도금의 10 mL를 넣어 배양 이들을 매체에서는-3 (39 ° C)을 도금 한 ㎖에 펠렛을 재현 탁 인큐베이터.
      참고 : 쥐 신경 교세포 두 번 계대됩니다; 대조 마우스 아교 세포는 아칸소그들은 여러 통로 후 건강에 해로운 될 수 있기 때문에 전자는 한 번만 계대. 쥐 신경교 세​​포는 임의의 코팅 재료로 코팅되지 않은 T75 플라스크에서 계대 배양된다. 코팅은 쥐 아교 세포가 너무 빨리 성장하고 나중에 신경 세포의 배양 조건을 저하됩니다 많은 섬 모세포 (추정 뇌실막 세포)를 얻을 수 있습니다.
    8. 플라스크에 아교 문화의 17-19 DIV에서 (즉, 십일일 계대 및 트립신 하루 전날과 3.3.9-3.3.14 단계로 된 커버에 도금 후), (씻지 않은 커버 글라스에 코팅 재료의 100 μl를 배치 라운드, 12mm 직경) 배양 접시에서 배양 인큐베이터에서 배양 접시를 놓습니다.
      참고 : 쥐 아교 세포 배양를 들어, 차이가 있거나 된 커버를 세척하지 않고 배양 결과에 발견되지 않았습니다.
    9. 플라스크에 아교 문화의 18-20 DIV에서 (즉, 계대 후 12 일), 세인트에 따르면, 배양 된 세포를 trypsinizing하여 아교 세포층을 준비EP 3.2.8.
    10. 원심 동안, 커버 글라스에서 완전히 도료 대기음.
    11. 원심 분리 후, 단계 3.1.13 항에있어서, 중간 3 (39 ° C)를 1 ml의 도금에 펠렛을 재현 탁하고, 세포 밀도를 측정한다.
    12. 라이브 104 세포 / ml로 폐해 농도를 조정하고 피복 된 유리 커버 슬립에 아교 세포 현탁액 100 μl를 접시.
      참고 :이 세포는 아교 세포층을 설정합니다.
    13. 20 ~ 60 분 동안 인큐베이터로 된 커버와 배양 접시를 놓습니다.
    14. 각 웰에 중간 3 (4 ° C)을 도금 한 ML을 추가하고, 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.
    15. 커버 슬립에 세포 40-80% 합류 때 폐해 세포층 3-4 DIV에서, 상기 예열 된 증식 배지 1 ㎖를 추가 (시토신 β-D 아라 비노 푸라 노 시드를 포함하는 (조성물은 표 1을 참조) ARAÇ, 4 μM의 최종 농도)는 아교 세포 증식을 정지합니다. 플레이트 신경신경교 세​​포층의 7-9 DIV들에서 세포를 이용하여 단계 3.4 60-80 % 컨 플루 언트 (confluent) 상태 인 경우.
  4. 마우스의 연결을 문화
    1. 1 단계와 2 단계에 따라 레이블 및 유전자형 신생아 쥐.
    2. 단계 3.1 마우스 새끼를 사용합니다.
    3. 살아있는 세포 현탁액의 농도를 조절하기 ~하여 2.0 × 105 세포 / ml 미리 예열 매체 -2- 마우스 신경교 세포 도금, 또는 사용하는 금도금 매체 -3- 래트 신경교 세포상의 도금.
    4. 부드럽게 각각의 배지에 균체 현탁액을 첨가하여 웰, 신경교 피더 레이어 상에 세포를 접시. 주의 : 첨가되는 세포 현탁액의 부피는 웰 배양 세포의 목표 수에 의해 결정된다. 예를 들면, 플레이트는 ~ 세포 현탁액 60 μL은 / 웰 12,000 세포를 달성했다.
    5. 뉴런은 도금 후 해결책 변경이 필요하지 않습니다. 문화의 과정을 통해, 내부 O를 가습하여 우물에서 솔루션의 증발을 방지하기 위해주의문화 인큐베이터 바.

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결과

이 프로토콜의 적용 예를 들어, 대표적인 결과는 다양한 실험 조건 하에서 문신, 신뢰할 수있는 유전자형으로 마우스를 라벨 및 아교 피더 레이어에 기본의 연결을 문화를 확립 표시됩니다.

문신

신생아 새끼 (그림 1에서 '신생아') 문신 시스템을 사용하여 발바닥에 표시 하였다. 라벨 3 주에서 명확하게 볼 남아 ( '3 주짜리')과 연령의 32주 ('32 '주 이상 된). 개별 마우스 고유 네 발 (번호 1-16)에 문신의 조합에 의해 그리고 동물 케이지, 또는 더 복잡한 넘버링 스킴에 대한 정보에 의해 식별 될 수있다 (도시 생략).

유전자형

유전자형의 한 대표적인 예는 (그림 2) 표시됩니다. 야생형의 ...

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토론

여기에 제시된 프로토콜에는 마우스를 표시/식별하기 위한 문신, 꼬리 끝에서 마우스의 유전자형 분석, 저밀도에서 마우스 뇌 뉴런을 배양하기 위한 절차가 포함됩니다. 6-8마리의 새끼를 사용한 한 차례의 실험에서 이러한 절차는 일반적으로 총 6-7시간에서 각각 ~0.5시간, ~4시간 및 ~2시간이 필요합니다. 이를 통해 한 명의 실험자가 새끼의 출생부터 신경 세포 배양 도금까지 필요한 모든 절차를 영업일 기준 하루 이내에 완료할 수 있습니다(신경교 피더 층의 사전 준비 제외).

문신

동물의 장기적인 식별은 조직학, 세포 기능 및 동물 행동 분석과 같은 육종 및 과학적 연구의 목적을 위해 필요합니다. 갓 태어난 동물에게 문신을 하는 것은 신속하게 수행할 수 있고 동물의 일생 대부분 동안 지속되기 때문에 유리합니다 7,22-25. 발 패드에 문신을 하는 것은 테스트 가능한 행동을 보존하는 것과 관련하여...

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공개 사항

저자(Zhengmin Huang)는 이 기사에 설명된 시약을 생산하는 EZ BioResearch LLC의 사장입니다.

감사의 글

저자는 선조체 배양에 대한 지침과 유용한 의견을 제공해 준 아이오와 대학의 연구원 Luis Tecedor, Ines Martins, Beverly Davidson 박사에게 감사를 표하고, 유전형 분석에 도움을 준 Kara Gordon, Nicole Bode 및 Pedro Gonzalez-Alegre 박사에게 감사를 표합니다. 또한 문신에 관해 유익한 의견을 제시해 주신 Eric Weyand 박사(Animal Identification and Marking Systems)와 쥐 문화에 관해 유익한 의견을 제공해 주신 Shutaro Katsurabayashi 박사(후쿠오카 대학)에게도 감사드립니다. 이 연구는 미국심장협회(American Heart Association), 국방부(Department of Defense, Peer Reviewed Medical Research Program award W81XWH-14-1-0301), 디스토니아 의학 연구 재단(Dystonia Medical Research Foundation), 에드워드 말린크로트 주니어 재단(Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation), 국립과학재단(National Science Foundation) 및 화이트홀 재단(Whitehall Foundation, N.C.H.)의 보조금으로 지원되었습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
시약 - 문신
기계 세척제동물 식별 및 마킹 시스템, Inc.NMCR3문신 후 바늘과 홀더를 청소하는 데 사용됩니다.
기계 건조제동물 식별 및 마킹 시스템, Inc.NDAR4세척 후 바늘과 홀더를 건조시키는 데 사용됩니다.
신생아 문신 블랙 피그동물 식별 및 마킹 시스템, Inc.NBP01
스킨 프렙 애플리케이터동물 식별 및 마킹 시스템, Inc.NSPA1Q-팁.
피부 준비 솔루션Animal Identification and Marking Systems, Inc.NSP01이 시약은 문신의 효율성을 향상시키고 문신이 퇴색하는 것을 방지하는 얇은 오일 층을 제공합니다 (공급 업체의 정보) : 1) 문신을하지 않은 피부가 일시적으로 얼룩지는 것을 방지하여 강아지가 집 케이지로 돌아 가기 전에 발 패드 문신의 품질을 쉽게 평가할 수 있습니다. 얼룩진 피부 표면은 문신을 한 피부와 혼동될 수 있으며, 2) 문신 &ndash 중 피부 손상 감소; 피부를 부드럽게 하고 바늘에 윤활유를 바르면 바늘이 피부 손상을 일으키지 않고 피부에 침투하는 데 도움이 되며, 3) 분자 산소가 피부에 들어가는 것을 방지하여 생성할 수 있는 활성 산소종에 대한 염증 반응을 줄일 수 있습니다.
시약 - 유전형 분석
EZ Fast Tissue/Tail PCR 유전형 분석 키트(스트립 튜브 형식)EZ BioResearch LLCG2001-100
2X PCR Ready Mix IIEZ BioResearch LLCG2001-100전기영동을 위한 적색 로딩 염료가 2X PCR Ready Mix 용액에 포함되어 있습니다.
조직 용해 솔루션 AEZ BioResearch LLCG2001-10020 µ를 혼합하여 DNA 추출 솔루션을 준비합니다. 조직 용해 해결책 A와 180 &마이크로의 l; l의 Tissue Lysis 해결책 B의 견본당
조직 용해 용액 BEZ BioResearch LLCG2001-10020 µ를 혼합하여 DNA 추출 용액을 준비합니다. 조직 용해 해결책 A와 180 &마이크로의 l; l의 Tissue Lysis 해결책 B의 견본당
아세트산, 빙하VWRBDH 3092
아가로스 최적화 등급, 분자 생물학 등급rpiA20090-500 당사는 SYBR Safe DNA 겔 염색(10,000배 희석) 또는 에티듐 브로마이드(0.5 µ g/ml 젤 부피).
에티듐 브로마이드시그마-알드리치E7637-1G
에틸렌디아민 테트라아세트산, 디소듐 염 이수화물 (EDTA)FisherBP120-500
필터링 피펫 팁, 에어로졸-프리, 0.1-10 &마이크로; lDot Scientific IncUG104-96RS 멸균 상태이며 DNA, RNase 및 DNase가 없는 피펫 팁을 사용하십시오. DNA와 관련된 모든 단계에서 교차 오염을 방지하기 위해 여과된 피펫 팁을 사용하십시오.
필터링된 피펫 팁, 프리미엄 핏 필터 팁, 0.5-20 &마이크로; lDot Scientific IncUG2020-RS멸균되고 DNA, RNase 및 DNase가 없는 피펫 팁을 사용하십시오. DNA와 관련된 모든 단계에서 교차 오염을 방지하기 위해 여과된 피펫 팁을 사용하십시오.
필터링된 피펫 팁, 프리미엄 핏 필터 팁, 1-200 &마이크로; lDot Scientific IncUG2812-RS멸균되고 DNA, RNase 및 DNase가 없는 피펫 팁을 사용하십시오. DNA와 관련된 모든 단계에서 교차 오염을 방지하기 위해 여과된 피펫 팁을 사용하십시오.
분자량 마커, EZ DNA Even Ladders 100 bpEZ BioResearch LLCL1001우리는 이 세 가지 분자량 마커 중 하나를 사용합니다.
분자량 마커, EZ DNA Even Ladders 1000 bpEZ BioResearch LLCL1010
분자량 마커, TrackIt, 100 bp DNA LadderGIBCO-Invitrogen10488-058
PCR 튜브, 개별적으로 부착된 돔 탑 캡이 있는 8-튜브 스트립, 자연, 0.2 ml USA Scientific1402-2900멸균 상태이며 DNA, RNase 및 DNase가 없는 튜브를 사용하십시오. 8-튜브 스트립은 개별 튜브보다 취급 및 표본 그룹화가 용이합니다.
PCR 튜브, Ultraflux Individual rpi145660멸균 상태이며 DNA, RNase 및 DNase가 없는 튜브를 사용하십시오.
Seal-Rite 0.5ml 마이크로 원심분리기 튜브, 천연USA Scientific1605-0000멸균 및 DNA, RNase 및 DNase가 없는 튜브를 사용하십시오.
SYBR Safe DNA gel stain * DMSOGIBCO-InvitrogenS33102
Tris baserpiT60040-1000
&Delta에서 Tor1a 유전자를 증폭하기 위한 프라이머; E-torsinA 넉인 마우스5'-AGT, CTG, TGG, CTG, GCT, CTC, CC-3'(앞으로) 및 5'-CCT, CAG, GCT, GCT, CAC, AAC, CAC-3'(리버스)(참고 18). 이 프라이머는 1.0 ng/µ의 최종 농도에서 사용되었습니다. l (~0.16 &마이크로; M) (참조 2).
야생형 마우스5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3'(정방향), 5'-CGT GTG GCT GGG GTT GTT GGTT GAG GTA-3'(역방향), 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3'(순방향), 983-BP 앰플리콘용 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3'(역방향), 및 1990-BP 앰플리콘의 경우 5'-CAC, CCT, ATC, AGG, GGA, GGA, CAA, CTT, TCG-3'(앞으로), 5'-ACA GTG, TAG, TAA, GGC, AAA, GCA, AGG, AG-3'(역방향). 이 프라이머는 0.5 &M.에서 사용됩니다.
시약 - 세포 배양
5-Fluoro-2′-deoxyuridineSigma-AldrichF0503-100MG자세한 내용은 uridine의 설명 섹션을 참조하십시오.
B-27 보충제GIBCO-Invitrogen17504-044
세포 배양 접시 35 x 10mm 접시, 조직 배양 처리BD 팔콘353001
세포 배양 플라스크, T25, 조직 배양 처리, 경사 넥, 플러그 씰 캡, 25cm2 성장 영역, 70mlBD 팔콘353082
세포 배양 플라스크, T75, 조직 배양 처리, 경사 목, 통풍 캡, 75 cm2 성장 영역, 250 mlBD 팔콘353136
원뿔형 튜브, 폴리프로필렌, 15 mlBD 팔콘352095
Countess (세포 수 카운터) 챔버 슬라이드GIBCO-InvitrogenC10312
Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride)Sigma-AldrichC6645-100mg
D-(+)-포도당(포도당) 무수, SigmaUltra, 99.5% (GC)Sigma-AldrichG7528-250G
접시, 페트리 유리 100 x 15mmPyrex3160-101
증류수GIBCO-Invitrogen15230-147
DNase Type IISigma-AldrichD4527-200KU원액은 1,500 units/20 &mu로 준비됩니다. L = 증류수에 있는 75,000 단위/ml.
Dulbecco의 Modified Eagle Medium (DMEM), 고포도당, GlutaMAX, 피루브산GIBCO-Invitrogen10569-010, 500 ml
Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µ m 기공 크기Nalgene568-0020
빠른 PES 필터 장치, 500 ml, 90 mm 직경 멤브레인, 0.2 &마이크로; m Pore SizeNalgene569-0020
Fetal bovine serum (FBS)GIBCO-Invitrogen26140-079
유리 커버슬립, 12 mm 라운드, 두께 0.09– 0.12mm, No. 0Carolina633017
GlutaMAX-IGIBCO-Invitrogen35050-061
행크스의 균형 잡힌 염Sigma-AldrichH2387-10X
HEPES, ≥ 99.5% (적정)Sigma-AldrichH3375-250G
염산, 37%, A.C.S 시약Sigma-Aldrich258148-100 ML
인슐린Sigma-AldrichI5500-250 mg
마그네슘 황산염 헵타하이드레이트, MgSO4•( 7H2O), 바이오울트라, ≥ 99.5% (Fluka)Sigma-Aldrich63138-250G
Matrigel Basement Membrane Matrix 솔루션, Phenol Red-FreeBD Biosciences356237이것은 커버슬립 및 플라스크의 코팅 재료입니다.1) 준비하려면 Matrigel Basement Membrane Matrix 용액을 얼음에서 해동하며 일반적으로 ~1일이 소요됩니다. 사전 냉각된 피펫을 사용하여 해동된 용액을 얼음 위의 사전 냉각된 T25 플라스크에 분취하고 플라스크를 -20°C에서 보관합니다. 작동하는 Matrigel 용액을 준비하려면 얼음 위의 플라스크에서 부분 표본 Matrigel을 해동하고 사전 냉각된 MEM 용액을 추가하여 50배 희석한 다음 희석된 용액을 4°C로 유지합니다. 커버슬립 코팅 중과 후를 제외하고 Matrigel과 접촉하는 모든 배양기 및 매체를 예냉각하여 젤이 조기에 형성되는 것을 방지하는 것이 중요합니다. 2) 유리 커버슬립 또는 배양 플라스크를 Matrigel로 코팅하려면 Matrigel 용액을 표면에 도포합니다. 세포를 도금하기 전에 표면을 완전히 건조시키는 것이 중요합니다. 이를 위해 세포를 도금하기 직전에 세포 원심분리 중에 Matrigel을 흡인하고 건조를 위한 충분한 시간을 확보하는 것이 도움이 될 수 있습니다.
최소 필수 배지(MEM)GIBCO-Invitrogen51200-038
MITO+ 혈청 증량제, 5mlBD Biosciences355006
멀티웰 플레이트, 조직 배양 처리된 24웰 플레이트BD falcon353047
Multiwell 플레이트, 조직 배양 처리된 6웰 플레이트BD falcon353046
Neurobasal-A Medium(1X), 액체GIBCO-Invitrogen10888-022
질산VWRbdh 3044
NS (뉴런 보충제) 21 실험실출처: reference 69
Pasteur pipets, 5 ¾ ”  Fisher13-678-6A이 면플러그 5 ¾를 사용하십시오; ” 세포 분쇄를 위한 파스퇴르 피펫. 미리 팁을 파이어 폴리싱하여 절단면을 매끄럽게 하고 내부 직경을 원본의 50-80%로 줄입니다. 팁이 너무 작으면 세포가 파괴되어 세포 생존율이 감소하지만 팁이 너무 크면 분쇄의 효율성이 떨어집니다.
파스퇴르 피펫, 9"  Fisher13-678-6B
염화칼륨(KCl), SigmaUltra, ≥ 99.0%Sigma-AldrichP9333-500G
혈청학 피펫, 2 mlBD falcon357507
혈청학 피펫, 5 ml BD falcon357543
Serological 피펫, 10 mlBD falcon357551
Serological 피펫, 25 mlBD falcon357525
Serological 피펫, 50 ml BD falcon357550
중탄산나트륨 (NaHCO3, 탄산수소나트륨), SigmaUltra, ≥ 99.5%Sigma-AldrichS6297-250G
염화나트륨(NaCl), SigmaUltra, ≥ 99.5%Sigma-AldrichS7653-250G
수산화나트륨(NaOH), 펠릿, 99.998% 미량 금속 기준Sigma-Aldrich480878-250G
인산나트륨 이염기성 헵타하이드레이트(Na2HPO4•( 7H2O)), ≥ 99.99%, 알드리치시그마-알드리치431478-250G
설탕, 시그마울트라, ≥ 99.5% (GC)Sigma-AldrichS7903-250G
주사기 필터, 멸균, 0.2 &마이크로; mCorning431219
Syringe, 3 mlBD falcon309585
Transferrin, Holo, bovine plasmaCalbiochem616420
Trypan Blue stain, 0.4%GIBCO-InvitrogenT10282이것은 살아있는/죽은 세포를 계수하는 데 사용됩니다. 오래된 트리판 블루 용액을 여러 번 재사용하면(예: 몇 주 동안 일주일에 여러 번) 침전물을 형성하여 세포 밀도의 잘못된 판독을 초래할 수 있으므로
트립신, 유형 XI시그마-알드리치T1005-5G
트립신-EDTA 용액, 0.25% GIBCO-Invitrogen25200-056
우리딘시그마-알드리치U3003-5G원액은 25ml DMEM(각각 8.12 및 20.48mM)에서 50mg 5-플루오로-2'-데옥시우리딘 및 125mg 우리딘으로 제조됩니다.
시약 - 면역세포화학
항체, 토끼 다클론 항-MAP2Merck MilliporeAB5622
항체, 마우스 단클론 항-GFAP 칵테일Merck MilliporeNE1015
장비 - 문신
AIMSAnimal Identification and Marking Systems, Inc.네오– 9이 신생아 설치류 문신 시스템은 1점 또는 3점식 문신 바늘을 피부 속으로 수직으로 빠르게 움직여 작동하는 전기 시스템입니다. 타투 기계를 약 0.5초 동안 한 번 작동시키고, 타투 바늘 끝은 피부 표면에 수직을 유지한다. 우리는 문신이 있는 부위를 최대화하기 위해 세 바늘 문신을 선호하지만 한 바늘 문신은 발가락과 같은 좁은 영역예: 또는 미세한 기계적 제어가 필요한 경우 숫자를 문신할 때 예: 에 효과적입니다. 가장 느린 속도(3단계 중 "1" 설정)로 두 차례의 문신을 하면 일반적으로 발 패드의 눈에 띄고 오래 지속되는 문신을 만들기에 충분합니다.
장비 - 유전형 전기
영동 시스템, 수평, Wide Mini– 서브 셀 GTBIO– RAD170– 4405일반적인 전기영동 매개변수는 6V/cm의 전기장 강도와 10cm 겔의 경우 25분 지속입니다.
FluorChem 8800ProteinSimpleFluorChem 8800
PCR, MJ Mini Thermal CyclerBIO-RADPTC-1148EDU우리의 PCR 반응은 Δ의 Tor1a 유전자에 대한 것입니다. E-torsinA knock-in 마우스는 다음과 같습니다 : 94 &# 176에서 변성의 1 사이클; C 3 분 동안, 94에서 35 사이클의 변성 &# 176; C 30 초 동안, 58 &# 176에서 어닐링; C 30초 동안, 72에서 확장 ° C 2분 동안 그 다음에는 72 °에서 최종 확장이 이어집니다. C를 10분 동안 누르고 4 °C를 유지합니다.
전원 공급 장치, PowerPac BasicBIO-RAD164-5050
장비 - 세포 배양
자동 세포 계수기, CountessGIBCO-InvitrogenC10310이 자동 세포 계수기는 살아있는 세포와 죽은 세포의 밀도를 별도로 측정합니다(각각 트리판 블루로 염색되지 않음 및 염색됨). 밀도 측정의 최적 범위를 아는 것이 중요합니다 : 우리가 사용하는 카운터는 1 x 105< / sup>에서 4 x 106< / sup> cells / ml 범위에서 가장 높은 정확도를 가지고 있습니다. 측정된 세포 밀도 값이 권장 범위를 벗어나면 재부유 부피를 적절하게 조정하십시오.
생물 안전 작업대, Class II, Type A2NUAIRENU-425-400이 후드는 뇌 박리를 제외한 모든 세포 배양 절차에 사용됩니다.
CO2 인큐베이터, AutoFlow, 습도 조절 워터 재킷NUAIRENU-4850
수평 클린 벤치NUAIRENU-201-330이 클린 벤치는 뇌 해부에 사용됩니다("뇌 해부 및 세포 해리"의 3.1.1 및 3.1.2 단계).
Orbit LS 저속 셰이커LabnetS2030-LS-B
SORVALL RC-6 Plus Superspeed CentrifugeFisher46910 (원심분리기)/46922 (로터)
먼트 Primers의 10,000x 농도 에서 Tfap2a 유전자를 증폭하기 위한 프라이머 에서 준비 갱신하십시오.

참고문헌

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