우리는 라벨 및 신생아 쥐의 유전형과 그들로부터 차의 연결을 문화를 생성하는 절차에 대해 설명합니다. 유전자형은 신속하고 효율적이며 신뢰성 및 자동 핵산 추출 할 수 있습니다. 이 neonatally 치명적인 마우스와 유전자형의 이전 완료를 필요로 그들의 문화에 특히 유용합니다.
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방법 논문
동물의 신속한 유전자형은 뇌 신경 세포의 차 문화 구축에 이어
* These authors contributed equally
이 논문에서
요약
초록
포유류 신경 세포의 형태와 기능의 고해상도 분석은 종종 뉴런의 일차 배양 분석 하였다 개별 동물의 유전자형을 필요로한다. 유전자형되는 신생아 마우스, 빠른 유전자형 레이블, 이러한 마우스의 뇌 신경 세포의 저밀도 문화를 확립 : 우리는 절차의 집합을 설명합니다. 개별 마우스는 성인이 지속되는 장기 식별 할 수 있습니다 문신에 의해 표시되어 있습니다. 설명 프로토콜에 의한 유전자형 빠르고 효율적이며, 좋은 안정성과 핵산 자동 추출 할 수 있습니다. 이 신생아 치사 고통 생쥐에서, 예를 들어 기존의 유전자형 충분한 시간을 사용할 수없는 상황에서 유용합니다. 기본의 연결을 문화가 높은 공간 해상도 이미징 실험을 가능하게 낮은 밀도에서 생성됩니다. 이 배양법 종래 신경 교세포 도금 세포층의 제조를 필요로한다. Protocol은 운동 장애 DYT1 된 근긴장 (ΔE-torsinA 녹아웃 생쥐)의 마우스 모델에 전체적으로 도포하고, 신경 세포 배양은 이들 마우스의 해마, 대뇌 피질 및 선조체로부터 제조된다. 이 프로토콜은 다른 종의 동물뿐만 아니라, 다른 유전 적 돌연변이 마우스에 적용 할 수있다. 또한, 프로토콜의 개별 구성 요소는 격리 된 서브 프로젝트를 위해 사용될 수있다. 따라서이 프로토콜은 신경 과학뿐만 아니라 생물학 및 의료 과학의 다른 분야에서뿐만 아니라 다양한 응용 프로그램을해야합니다.
서론
유전병의 설치류 모델은 정상 단백질과 핵산뿐만 아니라, 이들의 결함의 병태 생리 학적 결과의 생리 기능을 확립하는데 유용 입증되었다. 예로는 주요 세포 기능에 관여하는 단백질 결핍 마우스뿐만 아니라 알츠하이머 질환과 같은 질환의 마우스 모델을 포함한다. 그러나, 특정 유전자 조작 곧 신생아 치사 또는 출생 후 몇 일이 발생할 수 있습니다. 이 경우, 일차 세포 배양 생균 사망 전 배아 또는 신생아 새끼로부터 획득 될 수 있기 때문에 중요한 도구들은 시험 관내에서의 적어도 몇 주 동안 유지 될 수 있으며,이 시간 동안 초기 신경 발달은 다음 수 생화학 적 기능과 형태 학적 실험. 차 배양 들어, 저밀도 뉴런 판형 것이 유익 할 수있다; 이것은 개별 세포체, 수상 돌기 축삭 통로 및 신경 TERMI을 시각화하는 것을 가능하게높은 공간 해상도 NALS. 그러나, 낮은 밀도에서 뉴런의 생존과 분화는 일반적으로 그들이 신경교 영양 세포층에 플레이 팅되는 것을 필요로 공 배양 한 신경교 의해 컨디셔닝 물리적 그들과 접촉, 또는 배지에서의 부재와 신경 교세포.
아교 세포층에 저밀도의 연결을 문화의 설립은 사전에 신속하고 신뢰할 수 유전자형에 종속 될 수 있습니다 - 몇 일에 대비 몇 시간 내에. 신경 유전자형 미리 ....
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프로토콜
참고 : 본 연구에서 수행되는 모든 동물 절차는 아이오와 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.
발 패드를 문신 사용하여 마우스 1. 장기 식별
- 실험에 직면 발 패드 (발바닥 표면)과 발을 고정. 엄지 손가락과 집게 손가락으로 발바닥을 잡아. 발을 끼지 않도록주의하십시오.
주 : 안정 고정화 문신 안료 발 패드의 진피 내로 배치되도록하는 것이 중요하고, 따라서 영구 7이다. - 거즈 스폰지 또는 면봉에 70 % 에탄올로 발 패드를 면봉.
- 면봉에 스킨 오일을 적용하고 부드럽게 발 패드 차례의 표면에 대한 팁을 누릅니다. 피부 오일의 소량만을 사용; 존재하는 경우 다량으로, 그것은 피부에 도달하는 문신 안료를 방지 할 것이다.
- 직전 문신 잉크로 문신 바늘의 팁을 찍어문신에. 통증 및 감염의 가능성을 감소하고, 또한 문신 효율을 높이기 위해, 깨끗하고 선명한 무균 문신 바늘을 사용한다.
- 발 패드 표면은 피부의 기름으로 덮여 있지만, 발 패드의 중앙에 수직으로 피부에 가볍게 문신 바늘 팁을 누르고, 여러 번 잉크를 분사. 전기 문신 시스템에 대한 자세한 내용은 재료 / 장비의 표를 참조하십시오. <....
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결과
이 프로토콜의 적용 예를 들어, 대표적인 결과는 다양한 실험 조건 하에서 문신, 신뢰할 수있는 유전자형으로 마우스를 라벨 및 아교 피더 레이어에 기본의 연결을 문화를 확립 표시됩니다.
문신
신생아 새끼 (그림 1에서 '신생아') 문신 시스템을 사용하여 발바닥에 표시 하였다. 라벨 3 주에서 명확하게 볼 남아 ( '3 주짜리')과 연령의 32주 ('32 '주 이상 된). 개별 마우스 고유 네 발 (번호 1-16)에 문신의 조합에 의해 그리고 동물 케이지, 또는 더 복잡한 넘버링 스킴에 대한 정보에 의해 식별 될 수있다 (도시 생략).
유전자형
유전자형의 한 대표적인 예는 (그림 2) 표시됩니다. 야생형의 .......
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토론
여기에 제시된 프로토콜에는 마우스를 표시/식별하기 위한 문신, 꼬리 끝에서 마우스의 유전자형 분석, 저밀도에서 마우스 뇌 뉴런을 배양하기 위한 절차가 포함됩니다. 6-8마리의 새끼를 사용한 한 차례의 실험에서 이러한 절차는 일반적으로 총 6-7시간에서 각각 ~0.5시간, ~4시간 및 ~2시간이 필요합니다. 이를 통해 한 명의 실험자가 새끼의 출생부터 신경 세포 배양 도금까지 필요한 모든 절차를 영업일 기준 하루 이내에 완료할 수 있습니다(신경교 피더 층의 사전 준비 제외).
문신
동물의 장기적인 식별은 조직학, 세포 기능 및 동물 행동 분석과 같은 육종 및 과학적 연구의 목적을 위해 필요합니다. 갓 태어난 동물에게 문신을 하는 것은 신속하게 수행할 수 있고 동물의 일생 대부분 동안 지속되기 때문에 유리합니다 7,22-25. 발 패드에 문신을 하는 것은 테스트 가능한 행동을 보존하는 것과 관련하여.......
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공개 사항
저자(Zhengmin Huang)는 이 기사에 설명된 시약을 생산하는 EZ BioResearch LLC의 사장입니다.
감사의 글
저자는 선조체 배양에 대한 지침과 유용한 의견을 제공해 준 아이오와 대학의 연구원 Luis Tecedor, Ines Martins, Beverly Davidson 박사에게 감사를 표하고, 유전형 분석에 도움을 준 Kara Gordon, Nicole Bode 및 Pedro Gonzalez-Alegre 박사에게 감사를 표합니다. 또한 문신에 관해 유익한 의견을 제시해 주신 Eric Weyand 박사(Animal Identification and Marking Systems)와 쥐 문화에 관해 유익한 의견을 제공해 주신 Shutaro Katsurabayashi 박사(후쿠오카 대학)에게도 감사드립니다. 이 연구는 미국심장협회(American Heart Association), 국방부(Department of Defense, Peer Reviewed Medical Research Program award W81XWH-14-1-0301), 디스토니아 의학 연구 재단(Dystonia Medical Research Foundation), 에드워드 말린크로트 주니어 재단(Edward Mallinckrodt, Jr. Foundation), 국립과학재단(National Science Foundation) 및 화이트홀 재단(Whitehall Foundation, N.C.H.)의 보조금으로 지원되었습니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 시약 - 문신 | |||
| 기계 세척제 | 동물 식별 및 마킹 시스템, Inc. | NMCR3 | 문신 후 바늘과 홀더를 청소하는 데 사용됩니다. |
| 기계 건조제 | 동물 식별 및 마킹 시스템, Inc. | NDAR4 | 세척 후 바늘과 홀더를 건조시키는 데 사용됩니다. |
| 신생아 문신 블랙 피그 | 동물 식별 및 마킹 시스템, Inc. | NBP01 | |
| 스킨 프렙 애플리케이터 | 동물 식별 및 마킹 시스템, Inc. | NSPA1 | Q-팁. |
| 피부 준비 솔루션 | Animal Identification and Marking Systems, Inc. | NSP01 | 이 시약은 문신의 효율성을 향상시키고 문신이 퇴색하는 것을 방지하는 얇은 오일 층을 제공합니다 (공급 업체의 정보) : 1) 문신을하지 않은 피부가 일시적으로 얼룩지는 것을 방지하여 강아지가 집 케이지로 돌아 가기 전에 발 패드 문신의 품질을 쉽게 평가할 수 있습니다. 얼룩진 피부 표면은 문신을 한 피부와 혼동될 수 있으며, 2) 문신 &ndash 중 피부 손상 감소; 피부를 부드럽게 하고 바늘에 윤활유를 바르면 바늘이 피부 손상을 일으키지 않고 피부에 침투하는 데 도움이 되며, 3) 분자 산소가 피부에 들어가는 것을 방지하여 생성할 수 있는 활성 산소종에 대한 염증 반응을 줄일 수 있습니다. |
| 시약 - 유전형 분석 | |||
| EZ Fast Tissue/Tail PCR 유전형 분석 키트(스트립 튜브 형식) | EZ BioResearch LLC | G2001-100 | |
| 2X PCR Ready Mix II | EZ BioResearch LLC | G2001-100 | 전기영동을 위한 적색 로딩 염료가 2X PCR Ready Mix 용액에 포함되어 있습니다. |
| 조직 용해 솔루션 A | EZ BioResearch LLC | G2001-100 | 20 µ를 혼합하여 DNA 추출 솔루션을 준비합니다. 조직 용해 해결책 A와 180 &마이크로의 l; l의 Tissue Lysis 해결책 B의 견본당 |
| 조직 용해 용액 B | EZ BioResearch LLC | G2001-100 | 20 µ를 혼합하여 DNA 추출 용액을 준비합니다. 조직 용해 해결책 A와 180 &마이크로의 l; l의 Tissue Lysis 해결책 B의 견본당 |
| 아세트산, 빙하 | VWR | BDH 3092 | |
| 아가로스 최적화 등급, 분자 생물학 등급 | rpi | A20090-500 | 당사는 SYBR Safe DNA 겔 염색(10,000배 희석) 또는 에티듐 브로마이드(0.5 µ g/ml 젤 부피). |
| 에티듐 브로마이드 | 시그마-알드리치 | E7637-1G | |
| 에틸렌디아민 테트라아세트산, 디소듐 염 이수화물 (EDTA) | Fisher | BP120-500 | |
| 필터링 피펫 팁, 에어로졸-프리, 0.1-10 &마이크로; l | Dot Scientific Inc | UG104-96RS | 멸균 상태이며 DNA, RNase 및 DNase가 없는 피펫 팁을 사용하십시오. DNA와 관련된 모든 단계에서 교차 오염을 방지하기 위해 여과된 피펫 팁을 사용하십시오. |
| 필터링된 피펫 팁, 프리미엄 핏 필터 팁, 0.5-20 &마이크로; l | Dot Scientific Inc | UG2020-RS | 멸균되고 DNA, RNase 및 DNase가 없는 피펫 팁을 사용하십시오. DNA와 관련된 모든 단계에서 교차 오염을 방지하기 위해 여과된 피펫 팁을 사용하십시오. |
| 필터링된 피펫 팁, 프리미엄 핏 필터 팁, 1-200 &마이크로; l | Dot Scientific Inc | UG2812-RS | 멸균되고 DNA, RNase 및 DNase가 없는 피펫 팁을 사용하십시오. DNA와 관련된 모든 단계에서 교차 오염을 방지하기 위해 여과된 피펫 팁을 사용하십시오. |
| 분자량 마커, EZ DNA Even Ladders 100 bp | EZ BioResearch LLC | L1001 | 우리는 이 세 가지 분자량 마커 중 하나를 사용합니다. |
| 분자량 마커, EZ DNA Even Ladders 1000 bp | EZ BioResearch LLC | L1010 | |
| 분자량 마커, TrackIt, 100 bp DNA Ladder | GIBCO-Invitrogen | 10488-058 | |
| PCR 튜브, 개별적으로 부착된 돔 탑 캡이 있는 8-튜브 스트립, 자연, 0.2 ml | USA Scientific | 1402-2900 | 멸균 상태이며 DNA, RNase 및 DNase가 없는 튜브를 사용하십시오. 8-튜브 스트립은 개별 튜브보다 취급 및 표본 그룹화가 용이합니다. |
| PCR 튜브, Ultraflux Individual | rpi | 145660 | 멸균 상태이며 DNA, RNase 및 DNase가 없는 튜브를 사용하십시오. |
| Seal-Rite 0.5ml 마이크로 원심분리기 튜브, 천연 | USA Scientific | 1605-0000 | 멸균 및 DNA, RNase 및 DNase가 없는 튜브를 사용하십시오. |
| SYBR Safe DNA gel stain * DMSO | GIBCO-Invitrogen | S33102 | |
| Tris base | rpi | T60040-1000 | |
| &Delta에서 Tor1a 유전자를 증폭하기 위한 프라이머; E-torsinA 넉인 마우스 | 5'-AGT, CTG, TGG, CTG, GCT, CTC, CC-3'(앞으로) 및 5'-CCT, CAG, GCT, GCT, CAC, AAC, CAC-3'(리버스)(참고 18). 이 프라이머는 1.0 ng/µ의 최종 농도에서 사용되었습니다. l (~0.16 &마이크로; M) (참조 2). | ||
| 야생형 마우스 | 5'-GAA AGG TGT AGG CAG AAG TTT GTC AGG GC-3'(정방향), 5'-CGT GTG GCT GGG GTT GTT GGTT GAG GTA-3'(역방향), 5'-CAC CCT ATC AGG GGA GGA CAA CTT TCG-3'(순방향), 983-BP 앰플리콘용 5'-AGA CAC TCG GGC TTT GGA GAT CAT TC-3'(역방향), 및 1990-BP 앰플리콘의 경우 5'-CAC, CCT, ATC, AGG, GGA, GGA, CAA, CTT, TCG-3'(앞으로), 5'-ACA GTG, TAG, TAA, GGC, AAA, GCA, AGG, AG-3'(역방향). 이 프라이머는 0.5 &M.에서 사용됩니다. | ||
| 시약 - 세포 배양 | |||
| 5-Fluoro-2′-deoxyuridine | Sigma-Aldrich | F0503-100MG | 자세한 내용은 uridine의 설명 섹션을 참조하십시오. |
| B-27 보충제 | GIBCO-Invitrogen | 17504-044 | |
| 세포 배양 접시 35 x 10mm 접시, 조직 배양 처리 | BD 팔콘 | 353001 | |
| 세포 배양 플라스크, T25, 조직 배양 처리, 경사 넥, 플러그 씰 캡, 25cm2 성장 영역, 70ml | BD 팔콘 | 353082 | |
| 세포 배양 플라스크, T75, 조직 배양 처리, 경사 목, 통풍 캡, 75 cm2 성장 영역, 250 ml | BD 팔콘 | 353136 | |
| 원뿔형 튜브, 폴리프로필렌, 15 ml | BD 팔콘 | 352095 | |
| Countess (세포 수 카운터) 챔버 슬라이드 | GIBCO-Invitrogen | C10312 | |
| Cytosine β-D-Arabinofuranoside hydrochloride (Ara-C hydrochloride) | Sigma-Aldrich | C6645-100mg | |
| D-(+)-포도당(포도당) 무수, SigmaUltra, 99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | G7528-250G | |
| 접시, 페트리 유리 100 x 15mm | Pyrex | 3160-101 | |
| 증류수 | GIBCO-Invitrogen | 15230-147 | |
| DNase Type II | Sigma-Aldrich | D4527-200KU | 원액은 1,500 units/20 &mu로 준비됩니다. L = 증류수에 있는 75,000 단위/ml. |
| Dulbecco의 Modified Eagle Medium (DMEM), 고포도당, GlutaMAX, 피루브산 | GIBCO-Invitrogen | 10569-010, 500 ml | |
| Fast PES Filter Unit, 250 ml, 50 mm diameter membrane, 0.2 µ m 기공 크기 | Nalgene | 568-0020 | |
| 빠른 PES 필터 장치, 500 ml, 90 mm 직경 멤브레인, 0.2 &마이크로; m Pore Size | Nalgene | 569-0020 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | GIBCO-Invitrogen | 26140-079 | |
| 유리 커버슬립, 12 mm 라운드, 두께 0.09– 0.12mm, No. 0 | Carolina | 633017 | |
| GlutaMAX-I | GIBCO-Invitrogen | 35050-061 | |
| 행크스의 균형 잡힌 염 | Sigma-Aldrich | H2387-10X | |
| HEPES, ≥ 99.5% (적정) | Sigma-Aldrich | H3375-250G | |
| 염산, 37%, A.C.S 시약 | Sigma-Aldrich | 258148-100 ML | |
| 인슐린 | Sigma-Aldrich | I5500-250 mg | |
| 마그네슘 황산염 헵타하이드레이트, MgSO4•( 7H2O), 바이오울트라, ≥ 99.5% (Fluka) | Sigma-Aldrich | 63138-250G | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix 솔루션, Phenol Red-Free | BD Biosciences | 356237 | 이것은 커버슬립 및 플라스크의 코팅 재료입니다.1) 준비하려면 Matrigel Basement Membrane Matrix 용액을 얼음에서 해동하며 일반적으로 ~1일이 소요됩니다. 사전 냉각된 피펫을 사용하여 해동된 용액을 얼음 위의 사전 냉각된 T25 플라스크에 분취하고 플라스크를 -20°C에서 보관합니다. 작동하는 Matrigel 용액을 준비하려면 얼음 위의 플라스크에서 부분 표본 Matrigel을 해동하고 사전 냉각된 MEM 용액을 추가하여 50배 희석한 다음 희석된 용액을 4°C로 유지합니다. 커버슬립 코팅 중과 후를 제외하고 Matrigel과 접촉하는 모든 배양기 및 매체를 예냉각하여 젤이 조기에 형성되는 것을 방지하는 것이 중요합니다. 2) 유리 커버슬립 또는 배양 플라스크를 Matrigel로 코팅하려면 Matrigel 용액을 표면에 도포합니다. 세포를 도금하기 전에 표면을 완전히 건조시키는 것이 중요합니다. 이를 위해 세포를 도금하기 직전에 세포 원심분리 중에 Matrigel을 흡인하고 건조를 위한 충분한 시간을 확보하는 것이 도움이 될 수 있습니다. |
| 최소 필수 배지(MEM) | GIBCO-Invitrogen | 51200-038 | |
| MITO+ 혈청 증량제, 5ml | BD Biosciences | 355006 | |
| 멀티웰 플레이트, 조직 배양 처리된 24웰 플레이트 | BD falcon | 353047 | |
| Multiwell 플레이트, 조직 배양 처리된 6웰 플레이트 | BD falcon | 353046 | |
| Neurobasal-A Medium(1X), 액체 | GIBCO-Invitrogen | 10888-022 | |
| 질산 | VWR | bdh 3044 | |
| NS (뉴런 보충제) 21 | 실험실 | 출처: reference 69 | |
| Pasteur pipets, 5 ¾ ” | Fisher | 13-678-6A | 이 면플러그 5 ¾를 사용하십시오; ” 세포 분쇄를 위한 파스퇴르 피펫. 미리 팁을 파이어 폴리싱하여 절단면을 매끄럽게 하고 내부 직경을 원본의 50-80%로 줄입니다. 팁이 너무 작으면 세포가 파괴되어 세포 생존율이 감소하지만 팁이 너무 크면 분쇄의 효율성이 떨어집니다. |
| 파스퇴르 피펫, 9" | Fisher | 13-678-6B | |
| 염화칼륨(KCl), SigmaUltra, ≥ 99.0% | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| 혈청학 피펫, 2 ml | BD falcon | 357507 | |
| 혈청학 피펫, 5 ml | BD falcon | 357543 | |
| Serological 피펫, 10 ml | BD falcon | 357551 | |
| Serological 피펫, 25 ml | BD falcon | 357525 | |
| Serological 피펫, 50 ml | BD falcon | 357550 | |
| 중탄산나트륨 (NaHCO3, 탄산수소나트륨), SigmaUltra, ≥ 99.5% | Sigma-Aldrich | S6297-250G | |
| 염화나트륨(NaCl), SigmaUltra, ≥ 99.5% | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| 수산화나트륨(NaOH), 펠릿, 99.998% 미량 금속 기준 | Sigma-Aldrich | 480878-250G | |
| 인산나트륨 이염기성 헵타하이드레이트(Na2HPO4•( 7H2O)), ≥ 99.99%, 알드리치 | 시그마-알드리치 | 431478-250G | |
| 설탕, 시그마울트라, ≥ 99.5% (GC) | Sigma-Aldrich | S7903-250G | |
| 주사기 필터, 멸균, 0.2 &마이크로; m | Corning | 431219 | |
| Syringe, 3 ml | BD falcon | 309585 | |
| Transferrin, Holo, bovine plasma | Calbiochem | 616420 | |
| Trypan Blue stain, 0.4% | GIBCO-Invitrogen | T10282 | 이것은 살아있는/죽은 세포를 계수하는 데 사용됩니다. 오래된 트리판 블루 용액을 여러 번 재사용하면(예: 몇 주 동안 일주일에 여러 번) 침전물을 형성하여 세포 밀도의 잘못된 판독을 초래할 수 있으므로 |
| 트립신, 유형 XI | 시그마-알드리치 | T1005-5G | |
| 트립신-EDTA 용액, 0.25% | GIBCO-Invitrogen | 25200-056 | |
| 우리딘 | 시그마-알드리치 | U3003-5G | 원액은 25ml DMEM(각각 8.12 및 20.48mM)에서 50mg 5-플루오로-2'-데옥시우리딘 및 125mg 우리딘으로 제조됩니다. |
| 시약 - 면역세포화학 | |||
| 항체, 토끼 다클론 항-MAP2 | Merck Millipore | AB5622 | |
| 항체, 마우스 단클론 항-GFAP 칵테일 | Merck Millipore | NE1015 | |
| 장비 - 문신 | |||
| AIMS | Animal Identification and Marking Systems, Inc. | 네오– 9 | 이 신생아 설치류 문신 시스템은 1점 또는 3점식 문신 바늘을 피부 속으로 수직으로 빠르게 움직여 작동하는 전기 시스템입니다. 타투 기계를 약 0.5초 동안 한 번 작동시키고, 타투 바늘 끝은 피부 표면에 수직을 유지한다. 우리는 문신이 있는 부위를 최대화하기 위해 세 바늘 문신을 선호하지만 한 바늘 문신은 발가락과 같은 좁은 영역예: 또는 미세한 기계적 제어가 필요한 경우 숫자를 문신할 때 예: 에 효과적입니다. 가장 느린 속도(3단계 중 "1" 설정)로 두 차례의 문신을 하면 일반적으로 발 패드의 눈에 띄고 오래 지속되는 문신을 만들기에 충분합니다. |
| 장비 - 유전형 전기 | |||
| 영동 시스템, 수평, Wide Mini– 서브 셀 GT | BIO– RAD | 170– 4405 | 일반적인 전기영동 매개변수는 6V/cm의 전기장 강도와 10cm 겔의 경우 25분 지속입니다. |
| FluorChem 8800 | ProteinSimple | FluorChem 8800 | |
| PCR, MJ Mini Thermal Cycler | BIO-RAD | PTC-1148EDU | 우리의 PCR 반응은 Δ의 Tor1a 유전자에 대한 것입니다. E-torsinA knock-in 마우스는 다음과 같습니다 : 94 &# 176에서 변성의 1 사이클; C 3 분 동안, 94에서 35 사이클의 변성 &# 176; C 30 초 동안, 58 &# 176에서 어닐링; C 30초 동안, 72에서 확장 ° C 2분 동안 그 다음에는 72 °에서 최종 확장이 이어집니다. C를 10분 동안 누르고 4 °C를 유지합니다. |
| 전원 공급 장치, PowerPac Basic | BIO-RAD | 164-5050 | |
| 장비 - 세포 배양 | |||
| 자동 세포 계수기, Countess | GIBCO-Invitrogen | C10310 | 이 자동 세포 계수기는 살아있는 세포와 죽은 세포의 밀도를 별도로 측정합니다(각각 트리판 블루로 염색되지 않음 및 염색됨). 밀도 측정의 최적 범위를 아는 것이 중요합니다 : 우리가 사용하는 카운터는 1 x 105< / sup>에서 4 x 106< / sup> cells / ml 범위에서 가장 높은 정확도를 가지고 있습니다. 측정된 세포 밀도 값이 권장 범위를 벗어나면 재부유 부피를 적절하게 조정하십시오. |
| 생물 안전 작업대, Class II, Type A2 | NUAIRE | NU-425-400 | 이 후드는 뇌 박리를 제외한 모든 세포 배양 절차에 사용됩니다. |
| CO2 인큐베이터, AutoFlow, 습도 조절 워터 재킷 | NUAIRE | NU-4850 | |
| 수평 클린 벤치 | NUAIRE | NU-201-330 | 이 클린 벤치는 뇌 해부에 사용됩니다("뇌 해부 및 세포 해리"의 3.1.1 및 3.1.2 단계). |
| Orbit LS 저속 셰이커 | Labnet | S2030-LS-B | |
| SORVALL RC-6 Plus Superspeed Centrifuge | Fisher | 46910 (원심분리기)/46922 (로터) |
참고문헌
- Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G. Ch. 13. Culturing Nerve Cells. Banker, G., Goslin, K. , MIT Press. 339-370 (1998).
- Kakazu, Y., Koh, J. Y., Ho, K. W., Gonzalez-Alegre, P., Harata, N. C. Synaptic vesicle recycling is enhanced by torsinA that harbors the DYT1 dystonia mutation. Synapse. 66, 453-464 (2012).
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재인쇄 및 허가
