마우스의 등쪽 피하 지방 상공 회의소에서 허혈성 조직 손상 : 피부 플랩 모델은 급성 영구 허혈을 조사하기
Summary
제시 한 쥐의 등쪽 피하 지방 챔버의 창은 musculocutaneous 플랩의 급성 지속적인 허혈 영역을 시각화. 미세 혈관 및 혈류 역학의 정량의 직접적이고 반복적 인 평가를위한 생체 내에 에피 형광 현미경 수 있습니다. 형태 학적 및 혈역학 적 결과는 더 조직 학적 및 분자 분석과 관련 될 수있다.
Abstract
깊은 전문 지식과 첨단 수술 기법에도 불구하고, 광범위한 조직 괴사에 상처 고장에 이르기까지 허혈에 의한 합병증은 여전히 특히 재건 플랩 수술에서 발생한다. 여러 실험 플랩 모델은 근본 원인과 메커니즘을 분석하고 허혈성 합병증을 예방하는 치료 전략을 조사하기 위해 개발되었다. 대부분의 모델의 제한 요소는 직접 반복적으로 미세 혈관 구조와 혈류 역학을 시각화하는 부족 가능성이다. 프로토콜의 목적은 앞서 언급이 부족한 요소 affiliating 잘 확립 된 마우스 모델을 제시하는 것이었다. 세게 등은. 치료 유지가 10 일 후에 50 %의 괴사 ~ 급성 지속적 허혈 및 결과를 거쳐 임의의 관류 패턴 musculocutaneous 플랩의 모델을 개발했다. 생체 내에 에피 형광 현미경의 도움으로,이 모델은 챔버의 반복적 시각화를 허용형태와 시간에 관심의 다른 지역에서 혈역학. 이러한 세포 사멸, 염증, 미세 혈관 누출 및 혈관 신생과 같은 관련 프로세스 조사 및 단백질 분자 및 면역 분석법에 상관 될 수있다. 지금까지 모델은 ischemically 도전 조직의 전, 수술 주변의 효과와 postconditioning을 조사 여러 출판 실험 연구에서 타당성과 재현성을 입증했다.
Introduction
재건 수술에 노출 힘줄, 뼈와 임플란트 재료의 범위가 플랩의 사용에 의존한다. 플랩은 동맥 유입과 정맥 유출을 보장 혈관 척추 경에 전송되는 조직의 블록입니다. 폭 넓은 전문 지식과 전송 될 플랩의 다양한 가능성에도 불구하고, 전체 조직의 손실에 상처 고장에 이르기까지 허혈에 의한 합병증은 여전히 발생하고 있습니다. 보조 의사에 의한 보존 적 치료와 치유가 작은 조직 괴사 후 예상 할 수있는 반면, 상당한 플랩 괴사는 일반적으로 변연 절제술, 상처 조절 및 보조 재건을 포함하여 수술 개정을 필요로합니다. 이것은, 이환율을 증가 입원 기간을 연장하고 결과적으로 증가 건강 관리 비용을 초래.
동맥 유입에서 가장 먼 먼 영역에서 혈관의 정의되지 않은 패턴 또는 무작위로 살포 지역과 플랩은 허혈성 손상에 특히 경향이있다. ACCO rdingly 수많은 실험 및 임상 연구 모두에서 괴사 현상을 평가 한 축 패턴 플랩 (정의 혈액 공급) 및 임의의 패턴 플랩 (정의되지 않은 혈액 공급) 1-3. 주요 연구 결과는 일반적으로 괴사 영역의 크기의 거시적 평가를 기준으로합니다. 원인과 조직 괴사 기전을 평가하기 위해 더 자세하게, 몇몇 연구는 미세 순환의 분석에 초점을 맞추었다. 다른 기술은 폴라 전극들 4-5을 사용하여 조직 산소 장력의 분석뿐만 아니라, 레이저 도플러 flowmetry 6-7, 염료 확산 8 및 미소 9-10를 이용하여 혈류량의 측정을 포함하여, 조직 관류를 측정하는 데 사용되어왔다. 이러한 기술은, 단, 조직 관류의 간접 파라미터를 측정하기위한 허용 플랩의 관심 영역 내에 개별 microhemodynamic 임의의 공정 형태소 해석을 가능하게하지 않는다.
t "> Sandison 그는 토끼 (11)에서 수행 생체 내 연구에 연장을위한 투명 챔버를 사용하는 한 사람을 첫 번째로 알려져있다 1943 년 -. 약 20 년 후 – Algire는 적용 할 수 이러한 투명 챔버를 적용하는 첫번째이었다 종양 세포 (12)의 마이크로 임플란트의 행동을 연구하기 위해 쥐. 때문에 마우스가 느슨한 피부 동물을 소위 다음과 같은 년 동안 몇 가지 기술적 인 개선 후, 레어와 동료 등을 적용 할 수 있었다는 사실에 작고 가벼운 티탄 챔버 개발 등쪽 피하 지방 챔버.이 챔버는 생체 내에 형광 현미경, 형태 학적 및 미세 순환 기능의 수와 다른 생리 학적 및 병태 생리 학적 조건에서 시간에 따른 이들의 변화를 직접 반복적 시각화를 허용하는 기술 등을 이용하여 평가를 활성화 허혈 – 재관류 손상 13.PE의 조사에정상 및 병적 인 상태에서 피부, 근육과 뼈 플랩의 rfusion 두 가지 추세가 발생했습니다 : 첫째, 마우스 (14)의 유경 귀 플랩으로 등쪽 피하 지방 챔버를 사용하지 않는 "급성"플랩 모델, 측면을 기반으로 섬 피부 플랩 햄스터 (15)와 쥐 (16)의 유경 복합 플랩. 둘째, 등쪽 피하 지방 챔버 허가 반복적 인 미세과 플랩의 조합이 생체 내에 형광 현미경으로 몇 일 동안 분석 "만성"플랩 모델. 그것은 마우스 (17)의 피하 지방 챔버에 통합되어 무작위로 관류 musculocutaneous 플랩으로 구성되어 있습니다. 그 폭과 길이의 비율은 영구 급성 허혈 상황 일관 10-14일 플랩 입면 후 50 % 플랩 조직 괴사 ~ 결과 것으로 선택되었다. 조직 괴사의이 재현 범위는, 보호 (즉, 개발 레 모두의 추가적인 평가를 할 수 있습니다의 괴사) 및 유해 요인 (즉, 플랩 병태 생리에 대한 자세한 괴사의 개발). 지난 년 동안, 다른 주 산기 사전, 및 조직 보호 물질 18-24의 관리 및 열 (25)과 충격파 (26)과 같은 생리 학적 스트레스의 로컬 응용 프로그램을 포함하여 사후 조절 절차의 효과를 입증하는 여러 가지 실험 출판물, 등장했다.
괴사, 미세 혈관 모폴로지 및 미세 파라미터의 정량적 분석은 또한 면역 분석 및 단백질 분석과 상관 될 수있다. 혈관 내피 성장 인자 (VEGF), 산화 질소 합성 효소 (NOS), 핵 인자 카파 B (NF-κB) 및 열 충격 단백질 (HSP-32을 포함하는 다양한 단백질 및 분자 : 헴 시게나 1 (HO-1) 및 HSP- 70) 조직의 보호에 중요한 역할을하는 것으로 나타났다. 이 챔버 플랩 모델에 기초하여, 두 개의 변형 순으로 하였다 개발되어왔다R은 축 패턴 관류 (28)와 유경 플랩 피부 이식 치료 (27)과 혈관 개발하는 동안 신생 혈관 및 미세 순환을 분석합니다. 우리는 마우스 피하 지방 챔버 ischemically 도전 musculocutaneous 플랩 포함 재현성 및 신뢰성있는 모델을 제시한다. 이 모델은 생체 내에 에피 형광 현미경에 의한 미세 순환 및 혈류 역학의 시각화 및 정량화 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
임상 결과 허혈성 합병증을 감소시켜 개선하기 위해, 비판적으로 관류 플랩 조직의 병태 생리 학적 과정의 자세한 지식이 필요합니다. 급성 허혈 영구 모방 새로운 동물 모델의 개발 따라서 필수적이다. 따라서, 우리는 샘플링 플랩 조직의 면역 조직 화학 및 분자 분석과 상관 될 수 근육 및 피부 맥관계의 다양한 파라미터의 반복적 형태학 다이나믹 및 기능적 실시간 평가를 허용 쉽고 신뢰성 있?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 이미지 편집을위한 카타리나 Haberland 감사합니다. 자금 조달 : 수석 저자는 새로운 연구 실험실을 설정 뮌헨 공과 대학교에서 KKF 그랜트를 받았다.
Materials
| Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| C57Bl/6 mice 6-8w 20-22g | Charles River | ||
| depilation cream | Veet | any depilation cream | |
| titanium chamber | Irola | 160001 | Halteblech M |
| slotted cheese head screw | Screws and More | 842210 | DIN84 M2x10 |
| hexagon full nut | Screws and More | 93422 | DIN934 M2 |
| snap ring | Schaefer-Peters | 472212 | DIN472 J12x1,0 |
| cover glass | Volab | custom-made cover glass 11,8mm in diameter | |
| fixing foam | tesamoll | 05559-100 | tesamoll Standard I-Profile |
| ketamine hydrochloride | Parke Davis | Ketavet® | |
| dihydroxylidinothiazine hydrochloride | Bayer | Rompun® | |
| Buprenorphin | Essex Pharma | Temgesic® | |
| Saline 0,9% | |||
| desinfection alcohol | |||
| Vicryl 5-0 | Ethicon | V 490 H | |
| Ethilon 5-0 | Ethicon | EH 7823 H | |
| 1ml syringes | |||
| surgical skin marker with flexible ruler | Purple surgical | PS3151 | any surgical skin marker and flexible ruler |
| pointed scissors | |||
| Micro-Scissors | |||
| normal scissors | |||
| 2 clamps | |||
| fine anatomic forceps | |||
| micro-forceps | |||
| hex nuter driver | wiha | 1018 | |
| screwdriver | wiha | 685 | |
| snap ring plier | Knipex | 4411J1 | 12-25mm |
| wire cutter | Knipex | 70 02 160 | Wire cutter is used to cut screws short; 160mm |
| trans-illumination light | IKEA | 501.632.02 | LED light Jansjö; any light |
| magnification glasses | |||
| intravital microscope | Zeiss | 490035-0001-000 | Scope.A1.Axiotech |
| LED system | Zeiss | 423052-9501-000 | Colibri.2 |
| LED module 365nm | Zeiss | 423052-9011-000 | |
| LED module 470nm | Zeiss | 423052-9052-000 | |
| LED module 540-580nm | Zeiss | 423052-9121-000 | |
| Filter set 62 62 HE BFP + GFP + HcRed | Zeiss | 489062-9901-000 | range 1: 350-390nm excitation wavelength split 395 / 402-448nm; range 2: 460-488nm, split 495nm / 500-557nm; range 3: 567-602nm, split 610nm / 615-infinite |
| Filter set 20 Rhodamine | Zeiss | 485020-0000-000 | 540-552nm, split 560, emission 575-640nm |
| 2,5x objective NA=0,06 | Zeiss | 421020-9900-000 | A-Plan 2,5x/0.06 |
| 5x objective NA=0,16 | Zeiss | 420330-9901-000 | EC Plan-Neofluar 5x/0.16 M27 |
| 10x objetive NA=0,30 | Zeiss | 420340-9901-000 | EC Plan-Neofluar 10x/0.30 M27 |
| 20x objective NA=0.50 | Zeiss | 420350-9900-000 | EC Plan-Neofluar 20x/0.50 M27 |
| 50x objective NA=0,55 | Zeiss | 422472-9960-000 | LD Epiplan-Neofluar 50x/0.55 DIC 27 |
| ZEN imaging software | Zeiss | ZenPro 2012 | |
| CapImage | Dr. Zeintl | ||
| Fluorescein isothiocyanate-dextran | Sigma-Aldrich | 45946 | |
| bisBenzimide H 33342 trihydrochloride | Sigma-Aldrich | B2261 | harmful if swallowed; causes severe skin burns and eye damage, may cause repiratory irritat |
| Rhodamine 6G chloride | Invitrogen | R634 | harmful if swallowed; may cause genetic defects; may cause cancer; may damage fertility or the unborn child |
| Pentobarbital | Merial | Narcoren® |
References
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