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Methodenartikel

Ischämischen Gewebeschädigung des Rückenhautkammer der Maus: Ein Hautlappen Modell zu Akute Persistent Ischämie Untersuchen

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DOI:

10.3791/51900

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17. November 2014

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1Department of Plastic Surgery and Hand Surgery, Klinikum rechts der Isar, Technische Universität München, 2Department of Plastic, Reconstructive, Aesthetic and Hand Surgery, University Hospital of Basel, 3Institute for Clinical and Experimental Surgery, University of Saarland, 4Division of Plastic and Hand Surgery, University Hospital Zurich

In diesem Artikel

Zusammenfassung

Das Fenster des murinen Rückenhautkammer dargestellt visualisiert eine Zone von akuter Ischämie persistent eines muskulokutanen Klappe. Intravital Epifluoreszenzmikroskopie Genehmigungen für direkte und wiederholte Bewertung der Mikrogefäß und Quantifizierung der Hämodynamik. Morphologische und hämodynamische Ergebnisse kann weiter mit histologischen und molekularen Analysen korreliert werden.

Zusammenfassung

Trotz tiefen Erfahrung und die moderne Operationstechniken werden Ischämie-induzierten Komplikationen reichen von Wund Aufschlüsselung umfangreiche Gewebsnekrose noch auftritt, vor allem in der rekonstruktiven Klappenchirurgie. Mehrere experimentelle Klappenmodelle wurden entwickelt, um die Ursachen und Mechanismen zu analysieren und Behandlungsstrategien zu untersuchen, um ischämische Komplikationen zu verhindern. Der limitierende Faktor der meisten Modelle ist die fehlende Möglichkeit, mikrovaskuläre Architektur und Hämodynamik direkt und wiederholt zu visualisieren. Das Ziel des Protokolls war es, ein gut etabliertes Mausmodell Gunter diese bereits erwähnt fehlt Elemente präsentieren. Härtere et al. Haben ein Modell eines musculocutaneus Klappe mit einem zufälligen Perfusion Muster, das akute persistent Ischämie und Ergebnisse in ~ 50% Nekrose nach 10 Tagen, wenn unbehandelt gehalten erfährt entwickelt. Mit Hilfe der intravital Epifluoreszenzmikroskopie ermöglicht dieses Modell Kammer wiederholende VisualisierungMorphologie und Hämodynamik in verschiedenen Regionen von Interesse über die Zeit. Verbundenen Prozesse wie Apoptose, Entzündung und Angiogenese mikrovaskulären Leckage untersucht und immunhistochemische und molekular Protein-Assays korreliert werden. Bis heute hat das Modell Durchführbarkeit und Reproduzierbarkeit in mehreren veröffentlichten experimentellen Studien zur Untersuchung der Wirkung von prä-, peri- und Postkonditionierung ischämisch fochten Gewebe bewährt.

Einleitung

Abdeckung der freiliegenden Sehnen, Knochen und Implantatmaterial in der rekonstruktiven Chirurgie beruht auf der Verwendung von Klappen. Eine Klappe ist ein Block von Gewebe, das an seiner Gefäßstiel, der arteriellen Zustroms und eines venösen Abflusses garantiert übertragen wird. Trotz breiten Know-how und die Verfügbarkeit von einer Vielzahl von Klappen zu übertragen ist, werden Ischämie-induzierten Komplikationen reichen von Wund Aufschlüsselung der Gesamtgewebeverlust noch angetroffen. Während konservative Behandlung und Heilung durch sekundäre Absicht kann nach kleineren Gewebsnekrose erwarten, signifikante Lappennekrose erfordert in der Regel chirurgische Revision, einschließlich Debridement, Wundanlage und sekundäre Rekonstruktion. Dies erhöht die Morbidität, verlängert Krankenhausaufenthalt und damit zu erhöhten Kosten im Gesundheitswesen.

Klappen mit einem undefinierten Muster Vaskulatur oder zufällig perfundiert Bereiche in dem distalen Bereich der am weitesten von der arteriellen Zustrom sind besonders anfällig für ischämische Schädigung. Acco rdingly wurden zahlreiche experimentelle und klinische Studien, die Entwicklung der Nekrose sowohl ausgewertet, axialen Musterklappen (definiert Blutversorgung) und Zufallsmuster Klappen (undefined Blutversorgung) 1-3. Die wichtigsten Ergebnisse sind häufig auf makroskopische Auswertung der Größe des nekrotischen Bereich basiert. Um die Ursachen und Mechanismen der Gewebenekrose beurteilen näher konzentrierte mehrere Studien auf der Analyse der Mikrozirkulation. Verschiedene Techniken wurden eingesetzt, um die Gewebedurchblutung zu messen, einschließlich der Analyse von Gewebesauerstoffspannung mit polarographischen Elektroden 4-5, sowie die Messung der Blutströmung unter Verwendung der Laser-Doppler-Flussmessung 6-7, Farbstoffdiffusions 8 und 9-10 Mikrokügelchen. Diese Techniken sind jedoch nur für Mess indirekte Parameter der Gewebedurchblutung zu ermöglichen und keine morphologischen Analyse der microhemodynamic Prozesse innerhalb eines einzelnen interessierenden Bereich einer Klappe zu ermöglichen.

t "> Sandison ist bekannt, dass der erste, der eine transparente Kammer eingesetzt hat für die in vivo Studien, die er bei Kaninchen 11 geführt verlängert sein 1943 -. etwa 20 Jahre später - Algire war der erste, wie eine transparente Kammer anzupassen anwendbar zu sein bei Mäusen, um das Verhalten von Mikroimplantate von Tumorzellen 12 zu studieren. Aufgrund der Tatsache, dass Mäuse sind so genannte lose Haut Tieren und nach einigen technischen Raffinessen in den folgenden Jahren waren Lehr und Mitarbeiter in der Lage, sich anzupassen wie eine Rückenhautkammer der Entwicklung eines kleineren und leichteren Titankammer. Diese Kammer aktiviert Auswertung mittels Intravitalfluoreszenzmikroskopie, eine Technik, die direkten und wiederholenden Darstellung von einer Reihe von morphologischen und Mikrozirkulationsmerkmale und deren Veränderungen im Laufe der Zeit unter verschiedenen physiologischen und pathophysiologischen Bedingungen ermöglicht, wie Ischämie-Reperfusionsschaden 13.

Bei der Untersuchung von PErfusion von Haut, Muskeln und Knochen Klappen unter normalen und pathologischen Bedingungen zwei Trends aufgetreten: Erstens, die "akut" Klappe Modelle, die nicht die Rückenhautkammer verwenden wie die gestielten Ohrenklappe in der Maus 14, die seitlich auf der Basis Insel Hautlappen im Hamster 15 und der Verbund gestielten Lappen bei der Ratte 16. Zweitens, die "chronische" Klappe Modell, bei dem die Kombination von einer Klappe mit einer Rückenhautkammer erlaubt wiederholende Mikrozirkulation über mehrere Tage mit Intravitalfluoreszenzmikroskopie analysiert. Es besteht aus einem zufällig perfundiert muskulokutanen Klappe, die in der Hautkammer der Maus 17 integriert ist. Seine Breite-zu-Länge-Verhältnis wurde gewählt, dass eine Situation der akuten persistent Ischämie führt durchweg in ~ 50% Klappen Gewebsnekrose 10 bis 14 Tage nach Lappenhebung. Diese reproduzierbare Ausmaß der Gewebsnekrose ermöglicht die weitere Auswertung der beiden, Schutz (dh Entwicklung less Nekrose) und schädlichen Faktoren (dh Entwicklung von mehr Nekrose) auf der Klappe Pathophysiologie. In den letzten Jahren wurden mehrere experimentelle Publikationen, die die Wirkung von verschiedenen prä-, peri- und postKonditionierungsVerfahren, einschließlich der Verabreichung von Tissue-Schutzsubstanzen 18-24 und der lokalen Anwendung der physiologischen Stressfaktoren wie Wärmeschockwellen 25 und 26, entstanden.

Die quantitativen Analysen der Nekrose, mikrovaskulären Morphologie und Mikrozirkulationsparameter kann weiter auf immunhistochemischen Analysen und Protein-Assays korreliert werden. Verschiedene Proteine ​​und Moleküle, einschließlich vaskulärer endothelialer Wachstumsfaktor (VEGF), Stickstoffmonoxid-Synthasen (NOS), Nuklearfaktor kappa B (NF-kB), und Hitzeschockproteinen (HSP-32: Häm-Oxygenase-1 (HO-1) und HSP- 70) haben gezeigt, dass eine Rolle bei der Gewebeschutz spielen. Auf der Grundlage dieser Kammer Klappe Modell wurden zwei Modifikationen in orde entwickeltr zu Neovaskularisation und Mikrozirkulation während Hauttransplantation Heilung 27 und angiogene Entwicklungen in einem gestielten Klappe mit axialen Muster Perfusion 28 zu analysieren. Wir präsentieren eine reproduzierbare und zuverlässige Modell, das eine ischämisch fochten musculocutaneus Klappe in der Maus Hautkammer enthält. Dieses Modell ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung der Mikrozirkulation und die Hämodynamik durch Intravital Auflicht-Fluoreszenz-Mikroskopie.

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Protokoll

HINWEIS: Vor Durchführung des vorgestellten Modells, müssen die entsprechenden Tierschutzgesetze eingesehen werden und muss eine Genehmigung der örtlichen Behörden erhalten werden. In dieser Arbeit wurden alle Experimente in Übereinstimmung mit den Leitlinien für die Forschung mit Tieren und der deutschen Rechtsvorschriften über den Schutz von Tieren durchgeführt. Die Versuche wurden von der örtlichen Tierpflegekommission genehmigt.

1. Vorbereitung der Tiere und chirurgische Elevation der Klappe

  1. Halten Sie Tiere in Einzelkäfigen bei Raumtemperatur von 22-24 ° C und bei einer relativen Luftfeuchtigkeit von 60-65% mit einem 12-Stunden-Tag-und-Nacht-Zyklus. Lassen Mäuse freien Zugang zu Trinkwasser und Standardlaborfutter. Halten Sie immer sterile Bedingungen während Überleben Chirurgie.
  2. Betäuben die Maus durch intraperitoneale (ip) Injektion von 0,1 ml Salzlösung pro 10 g Körpergewicht, die 90 mg / kg Körpergewicht Ketamin-Hydrochlorid und 25 mg /kg KG dihydroxylidinothiazine Hydrochlorid. Anästhesie ist für die Tier Vorbereitung, Operation und anschließende Mikroskopie notwendig. Überprüfen Sie die Betäubung durch Überprüfung der Reaktion auf einen schmerzhaften Reiz. Während der Zeit der Anästhesie, gelten Tierarzt Salbe auf die Augen, um Trockenheit zu verhindern.
  3. Nach Einleitung der Narkose ausreichend, enthaaren die Rückseite mit einem elektrischen Rasierer. Hiernach gelten Enthaarungscreme auf die rasierte Fläche, um die restlichen Haare zu entfernen.
  4. Während Verweilzeit der Enthaarungscreme von ~ 7-10 min, bereiten Instrumente, einschließlich Hautzange und Mikro Zangen, Scheren und Mikro Schere, Nahtmaterial und einem Filzstift. Desinfizieren und bereiten die Titankammer, indem die beiden Schrauben mit der Mutter an der Kammerbasis und durch Befestigen selbstklebenden Schaumstoff (Fig. 1 AC) um das Fenster von der Kammer Gegen Dichtigkeit des Kammersystems zu gewährleisten.
  5. Entfernen Sie alle Enthaarungscreme von der Rückseite durch Waschenes mit lauwarmem Wasser. Dann trocknen und desinfizieren Sie die Haut mit einer alkoholhaltigen Lösung.
  6. Platzieren Sie die Maus in Bauchlage und definieren die Mittellinie des Rückens. Fassen Sie die Haut zentral und heben Sie ihn in eine Falte (Abb. 2A) zu erstellen. Durch Transillumination mit jeder Art von Lichtquelle, entscheiden, wo sie provisorisch platzieren Sie den Titanrahmen (Abb. 2B). Stellen Sie sicher, dass die distalen Äste der seitlichen Brustwandarterie (LTA) kranial und der Arteria circumflexa ilium profunda (DCIA) kaudal natürlich durch die Mitte der Fenster der Kammer (Fig. 2B-D). Sobald die Positionierung der Kammer durchgeführt wird, zu perforieren beide Hautschichten ganz am Boden der Falte zur späteren Fixierung der Titanrahmen. Entfernen Sie nun die Titanrahmen, platzieren Sie die Maus in Bauchlage und definieren die Mittellinie des Rückens, wenn nötig.
  7. Umriss der Klappe senkrecht auf die Wirbelsäule ausgehend von der Mittellinie mit einem Breite-zu-Länge-Verhältnis von 15 x 11 mm in einer seitlich auf und zufällig perfundiert Klappe führen. Dann beschreiben eine zusätzliche Hautfläche von 2 mm erstreckt, um der Gegenseite (Fig. 2C, D). Dieser Bereich ist mit der Pinzette aufgenommen und später an den Titanrahmen vernäht, ohne mit dem Klappenbereich sichtbar.
  8. Nach der endgültigen Kennzeichnung, einzuschneiden die Klappe. Dabei durchtrennen sowohl das LTA und DCIA und heben die Klappe (Fig. 2E). Es besteht keine Notwendigkeit für die Koagulation oder die Ligation der durchtrennten Gefäße.
  9. Platzieren der Kammer Schraube durch den zuvor hergestellten Haut Perforationen (Fig. 2F) und fixieren den skinfold sowohl vorne und nach hinten innerhalb des Kammerrahmens des erhöhten Klappe an der Rückseite Teil des Rahmens unter Verwendung der Löcher der Kammerrahmen und einem 5-0 Knopfnähten (Abb. 2G).
  10. Naht der vertikalen Schenkeln der Klappe zurück in die umgebende Haut mit Hilfe von 5-0 Nähten ( Abb. 2H, I).
  11. Zuschneiden eine halbkreisförmige Bereich der Haut seitlich der kleinen Hautstreifen von 2 mm, das heißt, auf der anderen Seite der Klappe, um die Klappe des Gefäßsystems zu beobachten. Dies ermöglicht den direkten Blick durch das Sichtfenster der Kammer, die eine Fläche von 90 mm ​​2 hat.
  12. Entfernen Sie die gelatineartigen losen Zellgewebe von der quergestreiften Muskulatur mit mikrochirurgischen Instrumenten und optische Lupe oder Mikroskop, um die Bildqualität während der Mikroskopie verbessern. Versuchen Sie nicht für Schiffe innerhalb der muskulären Gewebeschichten beschädigen.
  13. Schließlich Abdichtung der Kammer durch die Montage des Gegen des Rahmens, der zuvor mit selbsthaftenden Schaumstoffstreifen vorne begabt wurde, kranial und posterior, bedew der Klappe mit topischen Bisbenzimid und Kochsalzlösung (Fig. 2J). Danach gelten die Beobachtungsfenster mit einem Deckglas mit einem Sprengring. Versuchen Sie nicht, alle Luftblasen unter dem Glas einzuschließen (Abb. 2K, L). Die Haut wird auf dem Deckglas durch Adhäsionskräfte haften.

2. Intravital Epifluoreszenzmikroskopie

  1. Wartezeit von 24 Stunden nach der chirurgischen Vorbereitung der ersten mikroskopischen Analyse für optimale optische Qualität. Diese Analyse stellt die Grundlinie der Mikroskopie und wird an Tag 3, 5, 7 und 10 nach der Operation wiederholt. Jedes Mal, betäuben die Maus wie in Schritt 1.2 beschrieben. Legen Sie das Tier in einer lateralen Dekubitusposition auf einer maßgeschneiderten Plexiglas Träger. So das Muskelgewebe Schichten der Klappe an der Abdeckung Glas anhaftende Blick up-Stationen.
  2. Injizieren von 0,05 ml 5% grüne Fluoreszenz Dextran (Molekulargewicht 150.000) und 0,05 ml 1% stark fluoreszierenden Rhodamin-Farbstoff-Familie in eine Schwanzvene oder retrobulbären Venenplexus. Die grün fluoreszierenden Dextran färbt die nicht-zelluläre Bestandteile des Blutes, wenn intravenös angewendet (iv). Das fluoreszierende Rhodamin Flecken Leukozyten und Blutplättchen, die dist sein könnenvon anderen zellulären und nicht-zellulären Komponenten inguished. Schließlich Bisbenzimid färbt Kernkomponenten, die mehr oder weniger Fluoreszenz zu emittieren nach dem Stand der Kondensation.
  3. Anschließend platzieren Sie die Maus unter dem Mikroskop. Stellen Sie sicher, das Mikroskop enthält eine LED-System - LED-Lichtstrahl-Kombinationen für 470 & 425 nm, 365 & 490 nm und 540 & 580 nm sowie die entsprechenden Filtersätzen (62 HE BFP / GFP / HcRed, Bereich 1: 350 bis 390 nm Anregungswellenlänge, aufgeteilt 395 nm / 402-448 nm; Bereich 2: 460-488 nm, geteilt 495 nm / 500-557 nm; Bereich 3: 567-602 nm, geteilt 610 nm / 615 nm bis unendlich 20 Rhodamin, Bereich. : 540-552 nm, geteilt 560 nm, Emission 575 bis 640 nm).
  4. Notieren Sie die Standbilder und Motion-Bilder mit einem Charge-Coupled Device Videokamera und speichern Sie sie auf einer Computer-Festplatte für weitere Offline-Analyse.
  5. Verwenden Sie unterschiedliche Ziele (2.5X, NA (numerische Apertur) = 0,06 für Panoramablick auf die Kammer; 5X,NA = 0,16; 10X, NA = 0,32; 20X, NA = 0,50; 50X, NA = 0,55) für Aufnahmen der Regionen von Interesse.
  6. Praktisch, teilen die Klappenfläche, die durch das Fenster der Kammer in drei Bereiche von gleicher Höhe, also einen proximalen, einen mittleren und einen distalen Bereich der am weitesten von der Gefäß Zulauf (Fig. 3F) sichtbar ist. Für die Bildaufnahme, gehen auf folgende Weise zu jeder Beobachtungszeit Punkt:
    1. Scannen Sie den Gewebe Bild für Bild in das Fenster der Kammer von proximal nach distal mit der 5X Ziel.
    2. In jedem Bereich der Klappe, wählen zweiter oder dritter Ordnung Arteriolen und die sie begleitenden Venolen mit leicht identifizierbaren Verzweigungsmuster. Mit dem 5X, 10X oder 20X Ziel, stellen Sie Ausdrucke der arteriolovenular Bündel, um einfach wieder zu lokalisieren die Bündel im gesamten Beobachtungszeitraum.
    3. Mit dem 20x-Objektiv und dem 50X Ziel, weitere Rekord 5-6 Kapillare Felder und "apoptotischen"Felder pro Fläche der Klappe sind. Alle Bilder mit dem 10X und 20X Ziele aufgenommen wurden das blaue Licht (Fluoreszenz Dextran) und grünes Licht (Rhodamin) Filter, während Bilder mit der 5X und 50X objektiven Verwendung blauem Licht (Fluoreszenz Dextran) und Weißlicht (Bisbenzimid) Filter aufgezeichnet, jeweils .

3. Analyse der aufgezeichneten Daten

HINWEIS: Bei der Verwendung eines computerunterstützten Bildanalysesystems Quantifizierung aller aufgezeichneten Parameter off-line wie folgt 29.

  1. Messung der Fläche der nicht-perfundierte bzw. nekrotischen Gewebes (mm 2).
    1. Verwenden Sie den vollständigen gescannt Raumfenster Bild mit dem 5X Ziel (von 2.6.1) aufgezeichnet und das fluoreszierende Dextran zu nicht-durchbluteten jeweils nekrotischen Gewebes zu messen. Verwenden Sie "AreaBo" Funktion, um die nicht-durchbluteten dunklen Bereich zu messen: border die nicht-durchbluteten Bereich und berechnen Sie die Fläche in mm 2 unter Verwendung der Software Gebiet Messalgorithmen.
  2. Messung der mikrovaskulären Durchmesser in Arteriolen, Kapillaren und Venolen (um).
    1. Last Video oder Bilder aus den aufgezeichneten AV-Bündel oder die kapillaren Felder in die Software. Für beste Ergebnisse verwenden Sie die Standbilder oder Videos mit der höchsten Vergrößerung, wo bestimmte Grenzen des Schiffes sind deutlich sichtbar.
    2. Mit der Funktion "DiamPe" der Software, um sicherzustellen, werden die Messungen senkrecht zur Wand des Schiffes durchgeführt. Um dies zu tun markieren zwei Punkten auf der Gefässwand und mit dem dritten Klick Marke der senkrechten Durchmesser des Gefäßes. Die Software wird die Messung in & mgr; m auszuführen.
    3. Wiederholen Sie die Messungen an den gleichen Gefäßen für alle Aufnahmen an der gleichen Stelle. Messung mehrerer Kapillaren mittleren Durchmesser ansammeln.
  3. Analyse von roten Blutzellen (RBC) Geschwindigkeit in Arteriolen, Kapillaren and Venolen (mm / sec).
    1. Für arteriolären roten Blutkörperchen (RBC) Geschwindigkeit (mm / s) Messungen mit der "VeloLSD" Funktion der Software, und wählen Sie die gleichen Schiffe in der fluoreszierenden Dextran Fenster, für das die Durchmesser gemessen worden.
    2. Analysieren mit dem computerunterstützten Bildanalysesystems unter Verwendung der Zeilenverschiebungsverfahren, die auf der Grundlage der Messung der Verschiebung (mm) einer einzelnen intravaskulären Graustufenmuster über der Zeit (sec) ist.
  4. Messung der volumetrischen Blutströmung in Gefßen (pl / sec).
    1. Volumetrischen Blutströmung (pl / sec) in den Arteriolen, Kapillaren und Venolen von RBC Geschwindigkeit und Gefäßquerschnittsfläche zu berechnen (π * r 2) entsprechend der Gleichung von Gross und Aroesty, dh Q = V * π * r 2 unter Annahme einer zylindrischen Behälterform 30.
  5. Messung der funktionellen Kapillardichte der RBC-perfundierten Kapillaren (nutritive Perfusion: cm / cm 2).
    1. Legen Sie eine bespielte Fluoreszenz Kapillare Feld mit 20X Objektivvergrößerung in die Software. Mit der Funktion "DensLA" funktionelle Kapillardichte der RBC-perfundierten Mikrogefäße zu messen.
    2. Verfolgen Sie die perfundierten Kapillaren mit dem Cursor und markieren die durchblutete Gefäße. Markieren Sie nicht nicht-durchbluteten Kapillaren, Arteriolen oder Venolen. Die Software wird funktionelle Kapillardichte der perfundierten Kapillaren in cm / cm 2 zu messen. Wiederholen Sie die Schritte für die anderen aufgenommenen Kapillare Felder.
  6. Messung der Verwindung der Mikrogefäße (mikrovaskuläre Remodeling), frühe Anzeichen von Angiogenese wie Knospe und Sprossbildung und neu gebildeten Mikrogefäßen.
    1. Last aufgenommenen Videos oder Rahmen aus fluoreszierenden Kapillare Felder in die Software. Identifizieren gyrose Gefäße und die Funktion "TorqIx" der Software. Verfolgen Sie die definitive Gefäßfluss mit dem Verlauf und enden mit einem Rechtsklick. Die Software wirdeine gerade Linie für den direkten Weg und wird es im Zusammenhang mit der zurückverfolgt Weg zu bringen.
      HINWEIS: Achten Sie auf Anzeichen von Angiogenese wie Knospen, Sprossen und neu gebildete Kapillaren, die in der Regel senkrecht von den bereits bestehenden Kapillaren ausgehen. Messung der Dichte der neu gebildeten Gefäße, wie in Schritt 3.5 beschrieben.
  7. Identifizierung der Merkmale für den apoptotischen Zelltod, wie beispielsweise Kernkondensation, Fragmentierung und / oder margination (Zellen / mm 2).
    1. Legen Bisbenzimid aufgenommene Videos (50X Objektiv) in die Software. Mit der Funktion "DenseNA". Markieren apoptotischen Zellen nach den genannten Eigenschaften wie Kernkondensation, Fragmentierung und Margination mit einem Linksklick.
    2. Nach Markieren aller charakteristischen Zellen im ganzen Video, klicken Sie auf "N / A" in der Software, die automatisch zu zählen alle markierten Zellen und teilen sie in der gesamten Region. Das Ergebnis wird sein, apoptotischeZellen / mm 2.
  8. Analyse der Leukozytenadhäsion an das vaskuläre Endothel, welche Entzündungen. Intermittent Adhärenz von Leukozyten (Roll Leukozyten; Einhaltung <30 sec: Anzahl der Rollen / mm 2 Endotheloberfläche) und feste Anhaftung von Leukozyten (kleben Leukozyten; Einhaltung> 30 sec: Anzahl der Aufkleber / mm 2 Endotheloberfläche).
    1. Analysieren die entzündliche Reaktion durch Zählen der Anzahl von Rhodamin markierten Leukozyten, die die endotheliale Auskleidung der post-kapillaren Venolen für eine Zeitspanne von ≥30 sec ("Sticker") entsprechen und die intermittierenden anhaftenden Leukozyten (<30 sec, "Walzen") . Venulären Leukozytenadhärenz als Zellen pro mm 2 endotheliale Oberfläche angegeben.
  9. Messung der intravaskulären und Zwischengraustufen als Parameter für die mikrovaskulären Leckage (makromolekulare Extravasation E = E1 / E2).
    1. Beurteilen makromolekularen leakage als Parameter der mikrovaskulären Durchlässigkeit nach einer iv Injektion eines fluoreszierenden Dextran. Densitometrisch ermitteln mehreren Graustufen in das Gewebe unmittelbar benachbart zur Kapillare Gefäßwand (E1) sowie in der Randzellfreien Plasmas der Behälter (E2). Dann berechnen makromolekulare Extravasation (E) als das Verhältnis E1 / E2 31.

4. Postoperative Pflege

  1. Bringen Sie das Tier in einem separaten Käfig, um das Unternehmen von anderen Tieren zu vermeiden, bis vollständig erholt. Sie ein Tier nicht unbeaufsichtigt lassen, bis es ausreichend das Bewusstsein wiedererlangt, um Brustlage zu halten. Überwachung Tiere täglich für Blutungen, lokale und systemische Infektionszeichen und die Lage der Kammer.
  2. Werten Sie den allgemeinen Zustand des Tieres durch die Beobachtung der motorischen Aktivität, Körpergewicht, Anzeichen von Schmerzen, Toleranz gegenüber dem Verband und auto-Verstümmelung.
  3. Halten Sie den Mäusen eine pro Käfig Mutu vermeidenal Manipulation der Kammer. Bei Anzeichen von Schmerzen, gelten Buprenorphin in einer Dosis von 0,05 bis 0,1 mg / kg KG, subkutan in 8 Stunden Intervallen.

5. Euthanasie und Explantation des Hautkammer

  1. Am Tag 10, opfern Tiere mit einer Überdosis eines Narkose Droge (150 mg / kg Pentobarbital).
  2. Entfernen Sie die Kammer und probieren Sie die Klappe Gewebe zur immunhistochemischen und molekular Protein-Assays. Gewebeproben für die konventionelle Histologie (Formalin) und quantifizierbare Proteinassays (flüssiger Stickstoff oder Trockeneis).

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Ergebnisse

Nekrose

Der Hauptendpunkt dieses Modells - Gewebsnekrose folgenden Lappen (dh Induktion der akuten persistent Ischämie) - wiederholt gemessen und makroskopisch wie in Abbildung 3 über einen Zeitraum von 10 Tagen gezeigt dargestellt. Endgültige Festlegung Lappennekrose tritt in der Regel zwischen 5 und 7 Tage nach der Operation und wird durch einen roten Fransen, dh Zone Vasodilatation und mikrovaskuläre Remodeling gekennzeichnet, die sich z...

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Diskussion

Um ischämischen Komplikationen zu verringern und dadurch die Verbesserung der klinischen Ergebnisse wird genauere Kenntnis der pathophysiologischen Prozesse bei kritisch durchbluteten Gewebeklappe erforderlich. Die Entwicklung neuer Tiermodelle, die akute persistent Ischämie imitieren ist daher zwingend. Dementsprechend konnten wir eine leicht reproduzierbare und zuverlässige Modell erlaubt für sich wiederholende morphologischen, dynamische und funktionale Echtzeit-Auswertung der verschiedenen Parameter des Muskel- und ...

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Danksagungen

Wir danken Katharina Haberland für die Bildbearbeitung. Finanzierung: Der leitende Autor erhielt eine KKF Zuschuss der Technischen Universität München die Einrichtung eines neuen Forschungslabor.

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Materialien

Liste der in diesem Artikel verwendeten Materialien
NameUnternehmenKatalognummerKommentare
C57Bl/6 Mäuse, 6-8 W, 20-22 gCharles River
EnthaarungscremeBaleaBeliebige Enthaarungscreme
TitankammerIrola160001Halteblech M
Maßgeschneiderter MontagerahmenRahmen zur Sicherung der Kammer, um eine Bewegung der Kammer durch die Atmung des Tieres zu vermeiden.
Zylinderkopfschrauben mit Schlitzund mehr842210DIN84 M2x10
Sechskantschrauben mit Vollmutterund mehr93422DIN934 M2
SprengringSchaefer-Peters472212DIN472 J12x1,0
DeckglasVolabDeckglas nach Maß, 11,8 mm Durchmesser.
Befestigungsschaumtesamoll05559-100tesamoll Standard I-Profil
KetaminhydrochloridParke DavisKetavet®
DihydroxylidinothiazinhydrochloridBayerRompun®
BuprenorphinEssex PharmaTemgesic®
Kochsalzlösung 0,9%
Desinfektionsalkohol
Vicryl 5-0EthiconV 490 H
Ethilon 5-0EthiconEH 7823 H
1 ml Spritzen
Chirurgischer Hautmarker mit flexiblemLineal Lila chirurgischerPS3151Jeder chirurgische Hautmarker und flexibles Lineal
Spitze Schere
Mikro-Schere
Normale Schere
2 Klemmen
Feine anatomische Pinzette
Mikro-Pinzette
Sechskant-Nutendrehermit1018
Schraubendreherwiha685
SicherungsringzangeKnipex4411J112-25 mm
DrahtschneiderKnipex70 02 160Drahtschneider dient zum Kurzschneiden von Schrauben; 160 mm
DurchleuchtungsleuchteIKEA501.632.02LED-Leuchte Jansjö; beliebiges Licht 
Lupenbrille
Intravital MikroskopZeiss490035-0001-000Scope.A1.Axiotech
LED-SystemZeiss423052-9501-000Colibri.2
LED-Modul 365nmZeiss423052-9011-000
LED-Modul 470nmZeiss423052-9052-000
LED-Modul 540-580nmZeiss423052-9121-000
Filterset 62 62 HE BFP + GFP + HcRedZeiss489062-9901-000Bereich 1: 350-390 nm Anregungswellenlänge, geteilt 395 nm / 402-448 nm; Bereich 2: 460-488 nm, geteilt 495 nm / 500-557 nm; Bereich 3: 567-602 nm, geteilt 610 nm / 615 nm bis unendlich.
Filterset 20 RhodaminZeiss485020-0000-000540-552 nm, Split 560 nm, Emission 575-640 nm
2,5X Objektiv NA=0,06Zeiss421020-9900-000A-Plan 2,5X/0,06
5X Objektiv NA=0,16Zeiss420330-9901-000EC Plan-Neofluar 5X/0,16 M27
10X Objektiv NA=0,30Zeiss420340-9901-000EC Plan-Neofluar 10X/0,30 M27
20X Objektiv NA=0,50Zeiss420350-9900-000EC Plan-Neofluar 20X/0,50 M27
50X Objektiv NA=0,55Zeiss422472-9960-000LD Epiplan-Neofluar 50X/0,55 DIC 27
ZEN BildgebungssoftwareZeissZenPro 2012
CapImageDr. Zeintl
Fluorescein isothiocyanat-dextranSigma-Aldrich45946
BisBenzimid H 33342 TrihydrochloridSigma-AldrichB2261Gesundheitsschädlich beim Verschlucken; verursacht schwere Hautverbrennungen und Augenschäden, kann Atemwegsreizungen verursachen.
Rhodamin 6G ChloridInvitrogenR634Gesundheitsschädlich beim Verschlucken; kann genetische Defekte verursachen; kann Krebs verursachen; kann die Fruchtbarkeit oder das ungeborene Kind schädigen.
PentobarbitalMerialNarcoren®
aus Plexiglas Schrauben

Referenzen

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  3. Petry, J. J., Wortham, K. A. The anatomy of the epigastric flap in the experimental rat. Plast Reconstr Surg. 74, 410-413 (1984).
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