Method Article

단백질 분석을위한 지속적인 인식 패턴을 생성하는 전자 혀

DOI:

10.3791/51901

⸱

September 16th, 2014

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Structure et Propriétés d'Architectures Moléculaires, Institut Nanosciences et Cryogénie, CEA-Grenoble, 2Institut de Chimie Moléculaire et des Matériaux d'Orsay, Université Paris-Sud, 3Institut de Biologie Structurale

In This Article

Summary

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감지 재료의 설계 및 생산을 크게 단순화하고 eT가 액체 샘플에 대한 연속적인 진화 프로필과 풍경을 생성할 수 있도록 하는 eT(electronic tongue)의 구성에 대한 새로운 접근 방식이 설명되어 있습니다. 얻어진 eT는 변별과 같은 일반적인 단백질 분석에 효율적입니다.

Abstract

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현재 프로토콜에서는 단백질 분석을 위한 eT(Electronic tongue) 구성을 위한 감지 재료의 설계 및 생산을 단순화하기 위해 조합 접근 방식이 개발되었습니다. 빌딩 블록(BB)으로 사용되는 다양한 물리화학적 특성을 가진 소수의 단순하고 쉽게 접근할 수 있는 분자를 다양하고 제어된 비율로 혼합하고 혼합물이 프리즘의 금 표면에서 자체 조립되도록 함으로써 단백질 감지에 적합한 특성을 특징으로 하는 조합 표면의 배열이 만들어졌습니다. 이러한 방식으로, 많은 수의 교차 반응 수용체를 빠르고 효율적으로 얻을 수 있습니다. 이러한 CoCRR(Combinatorial Cross-Reactive Receptor) 어레이를 SPRi(Surface Plasmon Resonance Imaging)와 같은 광학 검출 시스템과 결합함으로써 얻어진 eT는 결합 이벤트를 실시간으로 모니터링하고 액체 내 샘플에 대한 2D CEP(continuous evolution profile) 및 3D CEL(continuous evolution landscape)을 포함한 연속 인식 패턴을 생성할 수 있습니다. 이러한 eT 시스템은 일반적인 정제 단백질을 구별하는 데 효율적입니다.

Introduction

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정확하고 빠른 단백질 감지 방법은 의료 진단 및 단백질 체학 (proteomics)에서 매우 중요합니다. 이러한 바이오칩 클래식 단백질 검출 배열은 "자물쇠 및 열쇠"인식의 원리에 기초하고 앱 타머, 항체 또는 모방 체 등의 특정 수용체​​를 필요로한다.

최근 몇 년 동안, 인간의 후각 및 맛보기에 의해 영감을 차동 감지 대안 1로 떠오르고있다. 이 전자 코 / 혀 (EN / ET) 접근법은 표적 분자에 매우 특정 또는 선택적으로 필요하지 않은 교차​​ 반응성 수용체 (CRRs)의 배열 분석 물질의 결합 미분에 기초하므로 번잡을 극복하도록 매우 선택적 수용체의 개발 방법. 그것은 그것의 식별을 가능하게 지문처럼 각각의 샘플에 대한 고유 한 패턴을 만들어 모든 수용체의 결합 반응이다.

ELEC의 개발이 핵심 과제효과적인 단백질 검출 용 트로닉 코 / 혀는 구조적으로 유사한 분석 및 바인딩 이벤트에 적합한 전달 시스템을 구별 할 수있는 능력을 가지고 촬상 소자의 제조이다. 지금까지 연구는 어레이 개발이에 다양한 접근 방법이 신고되었습니다. 한 연구에서, 예를 들어 단백질의 스토리지 기반 식별은 다양한 아미노산 또는 단백질에 대한 별개의 청구 둘레 대한 ....

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Protocol

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다양한 솔루션 및 단백질 샘플의 1 준비

  1. 50 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 50 mM의 염화나트륨을 함유하는 인산염 완충액 (PBS-G) 100 ㎖, pH를 6.8에서 10 % 글리세롤을 준비한다.
  2. pH가 7.4에서 10 mM의 HEPES, 150 mM의 염화나트륨, 0.005 % 트윈 20을 함유하는 HEPES 완충 용액 250 ㎖를 준비한다.
  3. PBS-G에서 0.2 밀리미터에 유당 (그림 1) 황산 빌딩 블록 1 (BB1) 유당 및 빌딩 블록이 (BB2)의 주식 솔루션을 준비합니다.
  4. 1 μM에서 꽃대의 hypogaea 렉틴 (AHL) 500 nm의, 미오글로빈에서, 및 500 nm에서 라이소자임 : HEPES 단백질 용액 1 ㎖를 준비합니다.
  5. 초순수에 1 % SDS 20 ㎖를 준비한다.

CoCRR 배열의 2 준비

  1. 75 % 산소 25 %, 아르곤, 0.6 밀리바, 전력 40 W. : 이러한 조건에서 3 분 동안 플라즈마 클리너와 함께 사용하기 전에 프리즘 48 시간의 금 표면을 청소
  2. 열한 순수하고 혼합 soluti....

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Results

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일반적인 단백질 분석 용 전자 혀의 능력을 검사하기 위해, 세 가지 단백질을 사용 하였다 : AHL, 미오글로빈 및 리소자임을. 도 6에 도시 된 바와 같이 각각의 단백질의 경우, 별개의 연속적인 진화 2D 프로파일, CEP는 ET에 의해 생성되었다.

또한, 각각의 단백질에 대해, 시간에 따라 연속 인식 패턴을 실시간으로 흡착 및 탈착 반응 속도를 모니터링 할 수 SPRI, 덕분에, 3D 연속 진화 풍경 (CEL)가, 생성 된 호출. 그림 7에서,이 세 가지 단백질의 특성 CELS이 표시됩니다.

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Discussion

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이 등의 건설을위한 가장 중요한 단계는 시스템의 재현성을 보장하기 위해 최선을 다하고 있습니다. 예를 들어, BB1과 BB2의 열한 순수 및 혼합 용액에 글리세롤의 10 %를 첨가, 사용 전에 표준화 된 절차와 프리즘의 금 표면을 세정하는 BB들은 프리즘의 금 표면에 자기 조립 중에 용매를 증발 제거하고, 각 [BB1] 여러 복제물 / ([BB1] + [BB2]) 비율 등을 증착하는 단계를 포함한다. SPRI 의한 단백질 검출 용으로, 작동 각도의 선택은 중요하다. 일반적으로, 그것은 반사율 곡선의 최대 기울기에 고정된다. 또한, 등등 작동 온도, 유량, 각 단백질 검출 용 표준화 된 실험 조건을 사용하는 것이 매우 중요하다. 각 단백질을 주입 한 후, CoCRR 어레이는 수용체의 손상없이 시스템을 완전히 재생을 허용하는 적절한 솔루션을 재사용을 위해 다시 생성해야합니다.

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Disclosures

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저자는 선언할 이해 상충이 없습니다.

Acknowledgements

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저자는 Laurie-Amandine Garçon을 지원한 그르노블의 LANEF에서 박사 학위를 받은 것에 대해 감사의 뜻을 표합니다. 이 연구는 프랑스 국립연구청(ANR-grant 06-NANO-045)의 재정 지원을 받았습니다.

....

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
SPRi 장치 Horiba Scientific-GenOpticsSPRi 장치는 25°C의 온도 조절 인큐베이터에 배치됩니다.
인큐베이터Memmert
주사기 펌프 Cavro 과학 기기Cavro XLP 6000
Micro Elite Degasser AlltechAT590507
6포트 중압 주입 밸브Upchurch Scientific사용된 주입 루프의 부피는 500μm입니다.
펨토 플라즈마 클리너 (버전 7)Diener ElectronicOn-line degassing system with 2 channel.
SpotterSiliflow비접촉 압전 감시기입니다.
SPRi-BiochipHoriba Scientific-GenOptics36000067프리즘은 얇은 금 필름(45nm)으로 코팅된 고굴절률 유리 프리즘으로 만들어졌으며 이미징 목적으로 특별히 개발되었습니다.
에리스리나 크리스타갈리 렉틴 시그마-알드리치L5390
거미약하혈 렉틴 시그마-알드리치L0881
미오글로빈, 시그마-알드리치M1882
리소자임, 시그마-알드리치L6876
CXCL12&알파;제공: Dr. Hugues Lortat-Jacob; 준비에 대한 자세한 내용은 참고 문헌 9
CXCL12&gamma의 지원 정보를 참조하십시오.  Hugues Lortat-Jacob 박사 제공; 준비에 대한 자세한 내용은 참고 문헌 9
LactoseProvided by David Bonnaffé의 지원 정보를 참조하십시오. 준비에 대한 자세한 내용은 참고 문헌 9
Sulfated lactoseProvided by David Bonnaffé의 지원 정보를 참조하십시오. 준비에 대한 자세한 내용은 참고 문헌 9
시그마-알드리치G5150
SDS,시그마-알드리치L4509
트윈 20시그마-알드리치274348
헤페스, 시그마-알드리치H3375
인산나트륨 일염기성 시그마-알드리치S0751
염화나트륨시그마-알드리치S3014
, , , Glycerol의 지원 정보를 참조하십시오., , , , ,

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Margulies, D., Hamilton, A. D. Combinatorial protein recognition as an alternative approach to antibody-mimetics. Current Opinion in Chemical Biology. 14, 705-712 (2010).
  2. Umali, A. P., Anslyn, E. V. A general app....

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Electronic TongueProtein AnalysisCombinatorial ApproachSurface Plasmon Resonance ImagingContinuous Evolution ProfileContinuous Evolution LandscapeCross Reactive ReceptorsSelf Assembly MonolayersBuilding Block MixturesKinetic Binding Curves

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