개발 배아 마우스 심장 밸브 지역에서 단백질 분리

요약

어린 배아 마우스 판막의 단백질 발현 분석은 이용 가능한 조직의 한계로 인해 방해를 받았습니다. 이 원고는 웨스턴 블롯 분석을 위해 발달 중인 배아 마우스 판막 영역에서 단백질을 준비하기 위한 프로토콜을 제공합니다.

초록

웨스턴 블롯 분석은 단백질 수준을 감지하고 정량화하는 데 일반적으로 사용되는 기술입니다. 그러나 작은 조직 샘플의 경우 이 분석 방법은 관심 단백질을 검출하기에 충분히 민감하지 않을 수 있습니다. 이러한 어려움을 극복하기 위해 우리는 성인 인간 심장 판막에서 단백질을 얻기 위한 프로토콜을 조사하고 발달 중인 초기 배아 쥐 대응물에 대해 이러한 프로토콜을 수정했습니다. 간단히 말해서, 대동맥 판막과 주변 대동맥 벽을 포함한 마우스 배아 대동맥 판막 영역은 프로테아제 억제제가 포함된 Tris 기반 용해 완충액의 가능한 최소 부피로 수집됩니다. 육종 전략에 따라 필요한 경우, 균질화를 위해 4개의 배아 대동맥 판막 부위를 통합하기 전에 배아를 유전자형화합니다. 균질화 후, SDS 기반 샘플 버퍼를 사용하여 SDS-PAGE 겔에서 실행하고 후속 웨스턴 블롯 분석을 위해 샘플을 변성시킵니다. 단백질 농도가 너무 낮아 분광광도계 단백질 정량화 분석을 사용하여 정량화할 수 없고 후속 분석을 위해 샘플이 남아 있지만, 이 기술은 각각 약 1μg의 단백질을 생성하는 4개의 배아 데이 13.5 마우스 대동맥 판막 영역의 풀링된 샘플에서 웨스턴 블롯을 통해 인산화 단백질을 성공적으로 검출하고 반정량화하는 데 사용할 수 있습니다. 이 기술은 초기 배아 마우스 판막 발달 동안 세포 신호 전달 경로 활성화 및 단백질 발현 수준을 연구하는 데 도움이 될 것입니다.

서론

단백질 발현 수준을 확인하고 정량 할 수있는 것은 동물성 및 세포 기반 실험을위한 표준 기술이다. 그러나,에도 불구하고 오랜 현재 병아리와 마우스 ^{1, 2} 모두에서 면역 조직 화학 염색으로 제한됩니다 개발 과정이 특정 조직에서 단백질 발현을 평가, 초기 배아 심장 밸브 개발에 관심을. 대부분의 모델 유기체 (예, 마우스 및 병아리)의 현상 밸브에서 단백질 발현을 정량화하는 어려움의 일부를 얻을 수있다 단백질의 양을 제한하는 밸브의 작은 크기이다. 따라서, 정량 분석을 위해, 연구원은 일반적으로 다음 정량 PCR이나 마이크로 어레이 분석 ^2-5 RNA 추출 및 증폭에 의존하고 있습니다. 그러나, RNA 및 단백질 발현 수준은 ⁶ 전적으로 상관 아니므 RNA 발현에 집중하면 특정 신호 발생 수많은 변화 엄격한 계정을 제공 할 수 없다개발하는 동안 여러 번 통로입니다. 현재 가능한 방법이 한계에 기초하여,이 절차의 목적은 안정적으로 중요한 다양한 신호 경로에서 발생하는 변화의 정량적 분석을 위해 개발 배아 마우스 심장 밸브 영역에서 단백질의 충분한 양을 획득하기위한 프로토콜을 개발하는 것이었다 이 조직의 성숙.

배아 밸브 이미 일반적으로 RNA 분리 및 후속 유전자 발현 분석을위한 ^2-5 생쥐 해부된다. 그러나, 이들 연구는 하류 시그널링에 영향을 미칠 수있는 번역 후 단백질 변형을 검출의 검출을 허용하지 않는 경로를 활성화, 신호의 판독으로 유전자 발현을 사용하여 한정 하였다. 출발점으로 RNA 분리 기법을 사용하여, 관심 영역을 해부 시작되었다. 우리의 관심은 인산화 된 단백질을 검출 되었기 때문에 신호 확실 나타내는라고대동맥 판막 개발 (E13.5-14.5)의 특정 기간 동안 hway 활동, 우리는 포스페이트없는 트리스 완충액에서 모두 박리를 수행 프로테아제 및 포스파타제 억제제 트리스 계 용해 완충액에 밸브를 모았다. 우리의 특정 경우에만 대동맥판 영역은 회수하고 있지만, 폐동맥 판막 영역 용이 동시에 얻을 수 있었다. 밸브 영역은 균질화 현재 성인 심장 밸브 ^(7)의 단백질 발현을 연구하는 데 사용되는 샘플 완충액과 혼합 하였다. 작은 샘플 볼륨 (예를 들어, 2 μL)를 사용하고 동일한 유전자형 배아에서 밸브 영역 풀링함으로써 배아 일 13.5 ^8에서 인산화 및 비 인산화 된 단백질을 검출 할 수 있었다. 밸브 영역 동결 및 용해 버퍼에 저장 될 수 있기 때문에 풀링하기 전에, 필요한 경우, 배아는 유전자형을 할 수있다.

이 기술은 셀 signalin 평가에 사용할 수있는 툴 세트를 넓게g 개발 중에 경로와 특별히 개발 심장 밸브에 대한 면역 조직 화학 염색에 대한 정량적 칭찬을 제공합니다. 이 기술은 발달 심장병 전문의로뿐만 아니라 제한적인 조직을 포함하는 지역에 관심이있는 초기 단계의 배아에서 작동하는 모든 발달 생물 학자뿐만 아니라 도움이 될 것이다.

프로토콜

참고 : 모든 실험 채플 힐 노스 캐롤라이나 대학의 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1 소비세 대동맥판

1. 관심 배아 스테이지 안락사 승인 기술을 사용하여, 개발의 목적 배아 일 (E)에서의 새끼와 임신 마우스를 안락사.
2. 임신 여성의 복부를 소독하기 위해 70 % 에탄올을 사용합니다. 멀리 내부 장기에서 낮은 복부 위쪽의 피부와 근육을 들어 올리고 자궁 뿔에 액세스 할 수 있도록 열려있는 여성의 낮은 복강을 절개.
3. 자궁 경적을 검색하려면 집게에 집게로 자궁 경부 조심스럽게 잘라 꼬리를 개최합니다. 장소에 혼을 유지하는 결합 조직을 절단, 자궁 경적을 들어 올리고 난관과 자궁 뿔의 접합을 절단하여 제거를 완료합니다.
4. 페트리 접시 포함 COL에 해부 자궁 경적을 배치D 0.1 M 트리스 완충액 (pH 7.6) 및 필요에 따라 린스. 그런 다음, 오픈 길이 현명한 배아 주머니를 노출하는 자궁 뿔을 잘라.
5. 배아를 표시하려면, 태반 및 태아의 교차점에서 배아 주머니를 열고 잘라 배아를 무료로 제대 혈관을 잘라. 차가운 0.1 M 트리스 버퍼를 가지는 초 페트리 접시에서 해부 배아를 놓습니다. 다음 배아에 대한 준비가 될 때까지 얼음에 나머지 undissected 배아와 첫번째 페트리 접시를 돌려줍니다.
6. 배아 내의 흉벽 접근을 개선하기 위해 배아를 참살. 유전자형이 필요한 경우 제거하고 얼음에 배치 된 에펜 도르프 튜브에 여분의 조직 일부를 저장한다.
7. 그 뒷면에있는 배아를 놓고 앞다리 근처, 흉곽의 측면을 따라 수직으로 가슴 벽을 잘라 수평 격막 위의 마음을 시각화 할 수 있습니다. 그런 마음을 노출하는 가슴 벽을 엽니 다.
8. 대 혈관을 따라 높은 잡아 집게를 사용하여 집게를 사용하여 마음을 들어 올려 아래의 혈관을 잘라.N, 마음을 무료로 집게 위에 잘라. 폐 혈관 포경 남아 있으면, 폐 심장으로 제거 될 수 있고 계속하기 전에 제거되어야한다.
9. 잘라 내기 및 밸브의 수준의 위 폐동맥을 제거; 여기에 기술 된 배아 단계에서, 폐동맥 밸브 지역에서의 차별에 도움되는 약간 불투명하다. 그냥 폐동맥 판막 아래 잘라 trabeculated 심실의 심근을 방지하고이 지역이 관심 또한 경우 단계 1.10에 설명 된대로 수집합니다. 여기서 및 다음 단계에서, 종래의 용해 완충액에 수집 어웨이 관심 영역으로부터 과량의 트리스 완충액을 그리 모세관을 사용한다.
10. 조심스럽게 그냥 밸브의 수준 이상으로, 대동맥 판막을 대동맥 원위부를 제거; 폐동맥과 같은 대동맥의 제거에 도움을줌으로써 이러한 배아 단계에서 약간 불투명 남아있다. 다시 trabeculated 심실 심근을 피하고, 단지 대동맥판 이하 잘라 및 전송얼음에 단백질 분해 효소와 포스 파타 아제 억제제를 포함하는 (재료 표에 설명) 2 μL 용해 버퍼 에펜 도르프 튜브에 집게를 사용하여 밸브.
11. 밸브는 별도의 에펜 도르프 튜브에 각 밸브를 수집, 모든 배아에서 적출 될 때까지 반복 1.6-1.10 단계를 반복합니다. 모든 배아는 동일한 유전자형을 가지고 있다면, 모든 밸브는 단일 에펜 도르프 튜브에 수집 될 수있다.
12. 유전자형이 함께 풀에 밸브를 결정하기 위해 수행해야하는 경우, 즉시 더 사용할 때까지 -80 ° C에서 용해 버퍼에 샘플을 배치. 시료 (단계 2.1.1) 유전형 후 풀링 될 수있다.

2 단백질 추출

1. 1 분은 튜브의 바닥에 용해 완충액에서 조직을 수집하기위한 13100 XG에서 얼음과 원심 분리기에 수집 된 조직을 해동.
   1. 배아 유전자형 된 경우, 부드럽게 수집하고 풀 용해 버퍼 유사한 유전자형을 가진 배아에서 밸브 영역을 포함하는 피펫을 사용합니다. 강한 B를 확보하려면샘플이 좋습니다 당과, E13.5 배아에서 3-4 밸브 영역을 풀링.
   2. 모든 배아는 동일한 유전자형의이었고 모든 밸브 영역은 1.10 단계에서 함께 회수하고 있으면 단계 2.2에 기재된 바와 같이, 전체 샘플을 용해.
2. 풀링 얻어진 시료의 부피를 점검하고 40 ㎕의 총 부피에 용해 완충액을 추가; 그때, 중단하고 에펜 도르프 튜브에 5mm 스테인리스 비즈를 사용하여 샘​​플을 균질화. 제조업체의 지침에 따라, 50 Hz에서 2-4 분 동안 lyser을 사용하십시오. 간단히 스핀 튜브, 불용성 이물질 남기고 새로운 튜브로 (13100 ~ 1 분간 XG) 및 전송 샘플.
3. 준비 및 Eslami 외 ^9와 같은 프로토콜 다음 SDS-PAGE 이후 서양 얼룩 분석을 위해 전송을위한 별도의 샘플. 로드 제어 단백질 블로 팅하는 단백질 정량에 필수적이다.

결과

이러한 준비의 기술을 사용하여, 우리는 E13.5 배아에서 하나의 대동맥 판막 지역에서 인산화 TGF 계통 ^1,5,8 (pSmad)을 감지 할 수 있었다. 도 1a에 도시 된 바와 같이, 심지어 단일 밸브 영역으로부터 분리 된 단백질은 희미한 pSmad 밴드를 검출하기에 충분하다. 신호 강도는 풀링 밸브 영역의 개수에 비례하여 증가한다. 중요한 것은, pSmad / β-액틴 비율은 서로 다른 샘플 크기 (그림 1C)에 걸쳐 거의 일정하게 유지된다. 인해 가능한 단백질의 낮은 수준으로, 동일한 오점이 박탈 될 수없고 전체 TGF 계통 위해 reprobed. 그러나, 별도의 총 TGF 계통으로 한 보여주는 오와 β-액틴 같은 표현 패턴 (그림 1B)를 보여줍니다.

이 밸브 영역은 심실 심근 오염의 거의없는 상태이다. 우심실의 샘플과 함께이 준비 기술을 사용하여, 우리는 ...

토론

심장 밸브 영역을 조기에 마우스 배아 단백질 수준을 정량화하고 병아리 능력 밸브 개발에 중요한 세포 신호 전달 사건을 이해하기위한 추가 툴을 제공한다. 여기에 설명 된 우리의 프로토콜은 표준 단백질 분리 과정에서 크게 차이가 없습니다. 그러나, 몇 가지 주요 단계를 수정하여, 우리는 성공적으로 매우 작은 샘플 크기에서 인산화 단백질을 얻을 수있다. 이 결과를 달성하기 위해, 다음 단계가 특히 중요하다. 즉 양질의 단백질이 얻어진다 유지하려면 얼음 여부 필요한 경우, 인산 분해 효소 억제제의 존재하에, 빙냉 버퍼를 사용하여, 시료를 냉장 보관하는 것이 중요하다. 또한, 작은 샘플 볼륨을 처리하도록 설계된 장치는 충분히 균질화 세포막을 방해 필수적이다. 심지어이주의 사항으로, 단백질의 얻어진 수율은 분광 광도계와 브래드 포드 분석을 통해 검출 너무 낮을 수 있습니다또는 정지 단백질 정량 키트 및 후속 분석에 사용할 샘플을 가지고있다. 우리는 각 대동맥 판막 지역은 7 대동맥 판막 영역을 풀링 및 정량 전체 샘플을 사용하여 약 1 ...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
임산부 마우스			관심 배아 단계에서 해부
체 현미경	Nikon	SMZ645
0.1 M Tris, pH 7.6
Microscissors	Fine Science Tools	15003-08
Fine Forceps, # 5	Fine Science Tools	11251-30
해부 바늘 보유자	: Ted Pella Inc.	13560
해부 바늘	Ted Pella Inc.	13561-10
마이크로 피펫, 20 μ 엘, 팁
용해 완충액			50 mM Tris-HCl, pH 7.5, 150 mM NaCl, 5 mM EDTA, 1 % Triton
PhosSTOP	Roche	4906845001	10 ml 용해 완충액에 1 정제 추가
TissueLyser LT	Qiagen	85600
스테인레스 스틸 비드	Qiagen	69989
마이크로 원심 분리기