시냅스 전 방출 안면막에서 Ca2+ 전류를 기록하는 것은 Ca2+ 진입 및 신경전달물질 방출을 정확하게 이해하는 데 중요합니다. 우리는 기능적으로 고립된 망상척수 축삭돌기를 생성하는 lamprey 척수의 급성 해리를 제시하여 개별 시냅스전 말단의 방출면 막에서 직접 기록할 수 있습니다.
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방법 논문
장어 Reticulospinal 축삭의 급성 해리는 개별 기능 시냅스 터미널의 릴리스 얼굴 막에서 녹음을 활성화하는
이 논문에서
요약
초록
시냅스 전달은 매우 빠른 과정이다. 활동 전위가 릴리스 얼굴 막에있는 전압 게이트 칼슘 채널 (VGCCs)을 통해 시냅스 터미널에 칼슘의 유입을 주도, 소포 융합과 신경 전달 물질의 방출을위한 트리거이다. 시냅스 전달의 신속성에 중요 활동 전위, VGCCs의 도착과 신경 전달 물질 방출 기계 사이의 공간적 시간적 동시성이다. 직접 칼슘 개별적인 시냅스 단자 분리면에서 막 2 + 전류를 기록 할 수있는 능력은 시냅스 전 칼슘과 신경 전달 물질의 방출 사이의 관계를 정확하게 이해하는데 필수적이다. 전기 생리 학적 기록에 대한 시냅스 릴리스 얼굴 막에 대한 액세스는 대부분의 준비 및 연접 칼슘에서 사용할 수 없습니다 2 + 항목은 이미징 기술과 거시적 현재의 방식 측정을 사용하는 것을 특징으로하고있다국세청 - 칼슘 항목을 시각화 할 수있는 충분한 시간 분해능이없는 기술. 직접 하나의 시냅스 터미널에서 VGCCs의 특성은 중앙 시냅스에서 가능하지 않았다 및 지금까지 성공적으로 만 병아리 섬모 신경절의 꽃받침 형 시냅스와 쥐 꽃받침에 달성되었다. 우리는 성공적으로 시냅스 구조의 결여 기능 시냅스 단자를 절연 reticulospinal 축색 돌기를 산출 척수의 급성 해리 준비를 개발하여 칠성 장어의 척수의 거대한 reticulospinal 시냅스에서이 문제를 해결했다. 우리는 찬란 레이블 및 개별 시냅스 터미널을 확인하고 녹화를 타겟팅 할 수 있습니다. 이 혼합물을 사용하여, 우리는 면역 조직 화학 및 전기 생리학 접근 방식을 사용하여 개별 시냅스 터미널의 릴리스 얼굴을 직접 VGCCs을 특징으로하고 있습니다. 칼슘 전류는 릴리스 얼굴 막 O를 직접 기록 된F 시냅스 개별 단말들은, 최초의 기록은 중앙 시냅스에서 행할 수있다.
서론
시냅스 전달은 매우 신속하고 정확한 과정이다. 시냅스 터미널의 활동 전위 침공 릴리스 얼굴 막, 연접 칼슘의 결과 증가 2 + 소포 융합과 신경 전달 물질의 방출 하나의 트리거 역할에있는 VGCCs의 개방에 연결됩니다. 이러한 모든 단계는 마이크로이 수백 내에서 발생하고, 따라서 소포 융합 기계 3 VGCCs의 꽉 공간 커플 링을 필요로한다. 시냅스 칼슘 이온 플럭스는 주로 칼슘에 민감한 염료 사를 사용하여 접근 방법 영상을 특징으로하고있다. 시냅스 전 뉴런에서 칼슘을 혼입 변조 칼슘 버퍼 간접적 시냅스 신경 전달 칼슘과 3 사이의 관계를 특성화하는 데 사용되어왔다. 또한, 칼슘 5 uncaging 또는 macroscopi을 기록하여 시냅스 무료 칼슘 농도를 조절칼슘 2 + c를 전류 소포 융합 및 / 또는 방출의 측정과 관련하여 사용되었다; 이러한 정전 용량을 측정으로 6 시냅스 응답은 같은 질문을 해결하기 위해 2. 시냅스 소포의 융합과 신경 전달 물질의 방출을 유발 2 + 전....
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프로토콜
폴리-D-라이신 브롬화 수소 산염의 1 준비
- 0.1 M 붕산 완충액 (pH 8.5)에 1 ㎎ / ㎖ 폴리-D-라이신 하이드로 브로마이드를 준비합니다.
- -20 ° C에서 나누어지는 및 저장.
Coverslips는의 2 폴리 라이신 코팅
주 : 층류 챔버 내의 모든 세척 및 코팅 단계를 수행.
- 2 시간 동안 1 N 염산 (HCL)을 포함하는 페트리 접시에 배치 된 커버.
- 기음 모든 염산 및 70 % 에탄올 (EtOH로) 2 ~ 3 배 씻어.
- 1 시간 동안 70 %의 EtOH에 둡니다.
- 기음은 모두 70 % EtOH로는 100 % EtOH를 2 ~ 3 배 씻어.
- 2 시간 동안 100 %의 EtOH에 둡니다. 모두의 EtOH를 대기음.
- 몇 초 동안 필터 종이와 건조한 공기로 건조시킨다.
- 장소 O / N 일에 mg / ㎖ 폴리 라이신 솔루션입니다.
- 린스는 밀리 포아 물 4-5x와 다음날 된 커버.
- 공기 건조 폴리 라이신 깨끗한 페트리 접시에 유리 롤러에 커버 슬립 코팅.
- ....
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결과
이 해리 프로토콜 수익률 건강하고 기능적인 절연 reticulospinal 시냅스 돌기도 2 층의 결여 된 축삭, 그럼에도 불구하고 유발 시냅스 소포 엑소와 엔도 시토 시스의 그림 4C 및도 4D 할 수있는 기능 시냅스 터미널을 유지합니다. reticulospinal 축삭의 고립 된 지역의 섹션은 명확하게 reticulospinal 축삭 막 그림 2 층에 대한 무제한 액세스를 허용하는 다른 신경 프로세스 명확하게 광학 현미경에서 식별 할 수 있습니다. 축삭은 분리 후 구조적 무결성을 유지합니다. 고립 된 축삭은 전체 셀 구성에 패치와 알렉사 플 루어 488 하이 드라 자이드와 가득 차 있었다. 축삭없이 염료 누출 내에 균일하게 분산 염료는 축삭 그림 4a에서 관찰되었다.
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토론
우리의 해리 프로토콜은 시냅스 돌기도 2 층의없는 격리 된 reticulospinal 축색 돌기를 산출하여 중요하지만, 그럼에도 불구하고 기능적인 시냅스 단자도 4C 및도 4d를 유지한다. 시냅스 말단 대향 시냅스 프로세스의 부재는 이전, 중앙 시냅스 가능한 성공적 두 calyceal 연접 형 터미널에서 달성되지 단일 시냅스 말단에 연접 박리 얼굴 막에 직접 기록 액세스를 허용한다; 병아리 섬모 신경절 7-10 쥐 꽃받침 11, 12의 꽃받침 형 시냅스. 전자 현미경 사진 수준의 간단한 단일 활성 지역 (21)을 제공하는 것으로 나타났다 개별 시냅스 단말은 FM 1-43로 라벨링 재활용 소포 클러스터에 의해 식별되고, 기록도 4C 및도 4D의 대상이 될 수있다. 칼슘 까지 개별 시냅스 터미널 그림 4 층의 릴리스 얼굴 막에 기록.......
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공개 사항
저자는 공개할 경쟁적인 재정적 이해관계나 기타 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
이 작업은 NINDS, RO1NS52699 및 MH84874 to SA의 지원을 받았습니다.
면역조직화학 연구에 사용되는 봉합사 접착제를 제공해 주신 Dave Featherstone 박사(시카고 일리노이 대학교 생물학과)에게 감사드립니다. 마이클 알퍼트(Michael Alpert)의 논평과 원고 교정에 감사드립니다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 0.2 & 마이크로; m 주사기 필터 | EMD Millipore | SLGV004SL | |
| 22 x 60 mm Coverslips | Fisherbrand | 12545J | |
| Advasep-7 | Cydex Pharmaceuticals | ADV7 | |
| Alexa Fluor 488 Phalloidin | Invitrogen/Life Technologies | A12379 | |
| Alexa-633 conjugated goat anti-rabbit secondary antibody | Invitrogen/Life Technologies | A21070 | |
| 부동액 | Prestone | ||
| 붕산 | Sigma-Aldrich | B7660 | |
| 소 혈청 알부민 | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 명시야 광원 | Dolan-Jenner | Fiberlite 180 | |
| 염화칼슘 | Sigma Aldrich | C4901 | |
| Cloristridium Histolyticum의 콜라겐 분해 효소 IA 형 | Sigma-Aldrich | C9891 | |
| 커버 슬립 | Fisher-Scientific | 12-545-J | |
| 포도당 | Sigma-Aldrich | D9559 | |
| 디지털 CCD 카메라 | Hamamatsu | C8484-03G01 | |
| 해부 미세 | 집게 미세 과학 도구 | 91150-20 | |
| 해부 집게 | 미세 과학 도구 | 11251-20 | |
| 해부 현미경 | Leica Biosystems | Leica MZ 12 | |
| 해부 가위 | 미세 과학 도구 | 15025-10 | |
| 해부 가위 미세 | 미세 과학 도구 | 91500-09 | |
| 해부 가위 초미세 | 미세 과학 도구 | 15000-08 | |
| FM 1-43 | Invitrogen/Life Technologies | T3163 | |
| 글리신 | 시그마 - 알드리치 | G7126 | |
| HEPES | 시그마 - 알드리치 | H7523 | |
| 고 진공 그리스 | 다우 코닝 | ||
| 염산 | Fisherbrand | SA-56-500 | |
| 침수 오일 | Fisher-Scientific | M2000 | |
| 산업용 질소 가스 탱크 | Praxair | UN1066 | |
| 곤충 핀 | Fine Science Tools | 26002-10 | |
| 액체 봉합사 접착제 | Braun Veterinary Cair Division | 8V0305 | 우리가 실험에 사용한 봉합사 접착제는 다른 실험실에서 제공되었습니다. 더 이상 제조되지 않습니다. 우리는 Aesculap (Ts1050071FP) |
| 염화마그네슘 | Sigma-Aldrich | M2670 | |
| 메탄올 | Sigma-Aldrich | 154903 | |
| 무지방 분유 | 세포 신호 기술 | 9999S | |
| P-87 마이크로 피펫 풀러 | Sutter Instruments | ||
| 파라 포름 알데히드 | Sigma-Aldrich에서 향후 사용을 위해 Histoacryl 봉합사 접착제를 공급했습니다. | P6148 | |
| 관류 펌프 | Cole-Palmer | Masterflex C/L | |
| 페트리 접시 100 x 15mm | Fisher-Scientific | 875712 | |
| 페트리 접시 35 x 10mm | Fisher-Scientific | 875712 | |
| Poly-D-lysine hydrobromide | Sigma-Aldrich | P1024 | MW > 300,000 |
| Potassium chloride | Sigma-Aldrich | P9333 | |
| 칼륨 인산 단일염기 | 성 Sigma-Aldrich | P5379 | |
| 기본 항체 R-타입 칼슘 채널 | Alomone Labs | ACC-006 | |
| 프로테아제 타입 XIV from Streptomyces Griseus | Sigma-Aldrich | P5147 | |
| 메스 블레이드 | 세계 정밀 기기 | 500240 | |
| Schot Duran 압력 병 | Fisher-Scientific | 09-841-006 | |
| 접착제 도포용 실리콘 튜빙 | Cole-Palmer | 07625-26 | |
| 슬라이싱 베이스 플레이트 | Leica Biosystems | 14046327404 | |
| 슬라이싱 챔버 | Leica Biosystems | 14046230132 | |
| 염화나트륨 | Sigma-Aldrich | S7653 | |
| 수산화 | S8045 | ||
| 인산나트륨 이염기성 | 시그마-알드리치 | S9763 | |
| 소듐 테트라보레이트 | 시그마-알드리치 | B3545 | |
| 실가드 160 실리콘 엘라스토머 키트 | 다우코닝 | SYLGARD® 160 | 준비하려면 엘라스토머 A와 엘라스토머 B를 혼합하십시오 10:1 무게로 |
| Sylgard 184 실리콘 엘라스토머 키트 | Dow Corning | SYLGARD® 184 | 준비하려면 엘라스토머와 경화제를 중량 기준으로 10:1로 혼합 |
| 테플론 코팅된 펜치 | 파인 사이언스 툴 | 11626-11 | |
| 트리카인 메탄설포네이 | 트 시그마-알드리치 | A5040 | |
| 진동 블레이드 | 세계 정밀 기기 | BLADES | |
| 크세논 램프 | 니콘 |
참고문헌
- Katz, B., Miledi, R. The timing of calcium action during neuromuscular transmission. Journal of Physiology. 189 (3), 535-544 (1967).
- Sabatini, B. L., Regehr, W. G. Timing of neurotransmission at fast synapses in the mammalian brain. Nature. 384 (6605), 17....
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재인쇄 및 허가
