막 단백질의 실시간 측정 : 수용체 상호 작용은 표면 플라즈몬 공명 (SPR)

요약

표면 플라스 몬 공명 (SPR)은 실시간으로 생체 분자 상호 작용을 검출하기위한 라벨없는 방법이다. 여기서, 막 단백질을위한 프로토콜 : 기술의 장단점을 논의하는 동안 수용체 상호 작용 실험은 설명한다.

초록

단백질-단백질 상호 작용은 전부는 아니더라도 대부분의 생리학적 과정에 중추적인 역할을 하며, 이러한 상호 작용의 본질을 이해하는 것은 생물학 연구의 핵심 단계입니다. SPR(Surface Plasmon Resonance)은 생체 분자 상호 작용에 대한 표지 없는 실시간 연구를 위한 민감한 검출 기술입니다. 일반적인 SPR 실험에서 한 구성 요소(일반적으로 '리간드'라고 하는 단백질)는 센서 칩 표면에 고정되는 반면, 다른 구성 요소('분석물')는 용액에서 자유롭고 표면 위에 주입됩니다. 리간드에서 분석물의 연관성 및 해리는 센소그램(sensogram)이라는 그래프에 실시간으로 측정되고 표시되며, 여기에서 사전 평형 및 평형 데이터가 도출됩니다. 표지가 없고, 적은 양의 물질을 소비하며, 평형 전 역학 데이터를 제공하기 때문에 SPR은 단백질 상호 작용의 역학을 연구할 때 선택하는 방법인 경우가 많습니다. 그러나 이 방법의 민감도가 높기 때문에 얻은 데이터를 신중하게 분석하고 다른 생화학적 방법으로 뒷받침해야 한다는 점을 명심해야 합니다.

SPR은 소량의 정제 물질을 소비하고 지질 및 세제와 호환되기 때문에 막 단백질 연구에 특히 적합합니다. 이 프로토콜은 막 단백질(ABC 수송체)과 용해성 단백질(수송체의 동족 기질 결합 단백질) 간 상호 작용의 운동 특성을 특성화하는 SPR 실험을 설명합니다.

서론

단백질 - 단백질 상호 작용 (PPI); 형성과 단백질 복합체의 해리는 많은 생물학적 과정 (예를 들어, 복제, 전사, 번역, 신호 전달, 세포 - 세포 통신)의 주요 이벤트입니다. PPI의 반 정량적 연구는 종종 풀다운 또는 면역 침전 실험을 사용하여 수행됩니다. 그러나 이러한 (유사한) 기술로 인해 이러한 기술에 내재 된 세척 단계로 측정 할 수있다 친화의 범위 (낮은 마이크로 몰과 높은 친 화성을) 제한됩니다. 이러한 "엔드 포인트"기술은 종종 큰 생물학적 결과의 일시적인 또는 선호도가 낮은 상호 작용을 식별 할 수 없습니다. 또한, 이러한 접근 방식의 시간 해상도는 극도의 반응 속도보다 느리다 보통 수주 제한된다. SPR은 인해 높아진 감도와 뛰어난 시간 해상도 ^{1, 2에} 이러한 단점을 극복한다. SPR과 같은, 라벨없는 방법(질량 변화를 검출 할 수있는 것이면), 분자 상호 작용은 측정 할 수있다. PPI 이외에, 그것은 광범위 단백질 - 리간드, 단백질 약물 (또는 작은 분자), 단백질 DNA, RNA 및 단백질 상호 작용 ^3-5을 특성화하는데 사용되어왔다. 결과 기록 및 실험 조건과 유연한 실험 설계의 신속한 수정을 가능하게 실시간에 그려집니다.

SPR 기반 악기 뒤에 물....

프로토콜

1. 단백질 샘플 및 버퍼 준비

1. 샘플 준비 : 관심의 단백질을 정화하고 젤 여과 컬럼으로 또는 초 원심 분리에 의해 이전에 실험에 단백질을 주입하여, 모든 집계가 제거되어 있는지 확인 (100,000 XG 충분 보통 10 분에서).
   주 : 바람직한 고순도의 단백질 제제는 필수는 아니지만. SPR 성공적으로보다 적게보다는 완벽한 정제를 함께 심지어 총 추출 ^8,9로 사용되어왔다.
2. 버퍼 준비 :
   1. ( "버퍼를 실행 중"이라고, 또는 RB) 실험의 버퍼를 준비합니다. 프로토콜은 여기에 설명을 위해, 50 mM의 pH 7.5 인 Tris-HCl, 150 mM의 염화나트륨 및 0.05 % (w / v)의 DDM (N- 도데 실 β-D​​-말토 사이드)를 사용한다. 버퍼 조성물의 선택은 쉽게 공부 시스템에 따라 변경 될 수 있음을 유의하십시오.
   2. 0.22 μm의 필터를 사용하여 모든 버퍼 및 단백질 시료를 필터링합니다. 필터가 단백질 - 있는지 사전에 확인호환. 일반적으로, 최근에 판매 SPR 플랫폼은 인라인 드 GASSER를 포함; 이 경우, 탈 가스되지 않은 경우 종래에 사용하는 버퍼.
   3. 밤새 투석 완충액 또는 불일치를 피하기 위해 RB에 대해 샘플을 희석한다. 고점도의 화학 물질을....

결과

본원에 기재된 시스템에서는, NiNTA 칩 그의 태깅 막 수송 ^{-6,7- 고정화하기} 위해 사용된다. 호모 다이머이기 때문에, 각각의 수송은 이중 그것 NiNTA 칩에 결합 개선, 태그됩니다. 니켈로드, 리간드 (관심 수송)을 따라하는 것은 RU 3,500 ~까지 된 Fc = 2에 고정화 (프로토콜주기 2, 그림 2A 블랙 라벨). 다음에, 동일한 흐름 및 분사 기간, 리간드 B (제어 리간드)를 사용하는 것은 초기까지만 ~ 3000 RU에 도달 된 Fc = 1 상으로 분사된다. 유사한 단백질 양의 두 흐름 세포에 고정되어 있는지 확인하십시오; 리간드는 또한 신중 B 3500에 로딩 된 RU를 모니터링하면서, 짧은 주입하여,로드된다. '계단'형태는 각각의 주입 (그림 2A 회색 라벨)에 따라 된 Fc = 1에 대량의 점진적 증가를 나타냅니다. FC를 온라인 모니터링 = 2-1은 동일한 리간드 로딩을 제어하는 데 도움이됩니다. 그림 2B.......

토론

SPR은 분자 상호 작용을 연구하는 고감도 방법이며, 과도 (아직 중요) 상호 작용의 실시간 모니터링을 제공하는 유일한 방법은 많다. 예는 다른 방법 (풀 - 다운 분석법 리포좀 침강 분석법 ^6)에 의해 검출 될 수없는 본 명세서 과도 상호 작용한다. 다른 방법 (정량적 또는 정 성적 관계없이) 측정을 평형 제한되어 있지만 또한, SPR은 미리 평형 동역학을 측정 만 기술 중 하나이다.

그 고조 감도는 또한주의해야 할 점이다. 거짓 양성 sensograms 용이하게 기록되어있다. 이 때문에 SPR 측정을 시도하기 전에 다른 방법을 사용하여 상호 작용의 존재를 설정하는 것을 권장한다. (과도 상호 작용에 대 안정 K _D의 거친 평가) 시스템의 특성에 대한 사전 지식은 SPR의 experime을 설정에 많은 도움이 될 것입니다NTS 얻어진 측정의 기능적 적합성을 평가. SPR 측정을 시작하면 단백질 시료의 품질이되기 전에 중.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Biacore T200	GE 헬스케어	28-9750-01
센서 칩 NTA	GE 헬스케어	14100532
BIA평가	GE 헬스케어
바이아코어 T200 소프트웨어	GE 헬스케어
니켈 클로라이드	시그마	N6136
소듐 텅스텐스테이트 디하이드레이트	시그마	T2629
소듐 클로라이드	주식회사 바이오 랩
Trizma base	Sigma	T1503
Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma	E5134
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM)	Affymetrix	D310
Sodium dodecyl sulfate solution	Sigma	05030
Kimwipes KIMTECH	Kimberly-Clark	34120
염산	GADOT	7647-01-0
나일론(NY) 멤브레인 필터	Sartorius	25007--47------N
ModBC ABC 트랜스포터	Lewinson lab
RbsBC ABC 트랜스포터	Lewinson 랩
ModA 기질 결합 단백질	Lewinson 연구실

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