막 단백질의 실시간 측정 : 수용체 상호 작용은 표면 플라즈몬 공명 (SPR)

요약

표면 플라스 몬 공명 (SPR)은 실시간으로 생체 분자 상호 작용을 검출하기위한 라벨없는 방법이다. 여기서, 막 단백질을위한 프로토콜 : 기술의 장단점을 논의하는 동안 수용체 상호 작용 실험은 설명한다.

초록

단백질-단백질 상호 작용은 전부는 아니더라도 대부분의 생리학적 과정에 중추적인 역할을 하며, 이러한 상호 작용의 본질을 이해하는 것은 생물학 연구의 핵심 단계입니다. SPR(Surface Plasmon Resonance)은 생체 분자 상호 작용에 대한 표지 없는 실시간 연구를 위한 민감한 검출 기술입니다. 일반적인 SPR 실험에서 한 구성 요소(일반적으로 '리간드'라고 하는 단백질)는 센서 칩 표면에 고정되는 반면, 다른 구성 요소('분석물')는 용액에서 자유롭고 표면 위에 주입됩니다. 리간드에서 분석물의 연관성 및 해리는 센소그램(sensogram)이라는 그래프에 실시간으로 측정되고 표시되며, 여기에서 사전 평형 및 평형 데이터가 도출됩니다. 표지가 없고, 적은 양의 물질을 소비하며, 평형 전 역학 데이터를 제공하기 때문에 SPR은 단백질 상호 작용의 역학을 연구할 때 선택하는 방법인 경우가 많습니다. 그러나 이 방법의 민감도가 높기 때문에 얻은 데이터를 신중하게 분석하고 다른 생화학적 방법으로 뒷받침해야 한다는 점을 명심해야 합니다.

SPR은 소량의 정제 물질을 소비하고 지질 및 세제와 호환되기 때문에 막 단백질 연구에 특히 적합합니다. 이 프로토콜은 막 단백질(ABC 수송체)과 용해성 단백질(수송체의 동족 기질 결합 단백질) 간 상호 작용의 운동 특성을 특성화하는 SPR 실험을 설명합니다.

서론

단백질 - 단백질 상호 작용 (PPI); 형성과 단백질 복합체의 해리는 많은 생물학적 과정 (예를 들어, 복제, 전사, 번역, 신호 전달, 세포 - 세포 통신)의 주요 이벤트입니다. PPI의 반 정량적 연구는 종종 풀다운 또는 면역 침전 실험을 사용하여 수행됩니다. 그러나 이러한 (유사한) 기술로 인해 이러한 기술에 내재 된 세척 단계로 측정 할 수있다 친화의 범위 (낮은 마이크로 몰과 높은 친 화성을) 제한됩니다. 이러한 "엔드 포인트"기술은 종종 큰 생물학적 결과의 일시적인 또는 선호도가 낮은 상호 작용을 식별 할 수 없습니다. 또한, 이러한 접근 방식의 시간 해상도는 극도의 반응 속도보다 느리다 보통 수주 제한된다. SPR은 인해 높아진 감도와 뛰어난 시간 해상도 ^{1, 2에} 이러한 단점을 극복한다. SPR과 같은, 라벨없는 방법(질량 변화를 검출 할 수있는 것이면), 분자 상호 작용은 측정 할 수있다. PPI 이외에, 그것은 광범위 단백질 - 리간드, 단백질 약물 (또는 작은 분자), 단백질 DNA, RNA 및 단백질 상호 작용 ^3-5을 특성화하는데 사용되어왔다. 결과 기록 및 실험 조건과 유연한 실험 설계의 신속한 수정을 가능하게 실시간에 그려집니다.

SPR 기반 악기 뒤에 물리적 원리는 ^{질량이 변화에} 따라 센서면에서의 굴절률의 변화를 측정하는 광학 시스템의 이용이다. 상호 작용 파트너 (이하 리간드) 중 하나는 폴리머 매트릭스 칩과 상기 제 분자 (이하, 피검) 표면 상에 고정화 흐르게된다. 분석 물에 결합하는 리간드 칩 표면에 질량을 변화. 이러한 질량의 변화는 직접적으로 비례 표면의 굴절률의 변화에​​ 관한 것이다. 그 결과를 실시간으로 플롯 및시간의 함수로서 반응 단위 (RU)로 표시. 이러한 플롯은 sensogram이라고한다 (예를 들어, 그림 1). SPR은 상호 작용의 전체 시간 코스를 따르기 때문에, 미리 평형 운동 속도 상수는 평형 친화도에 부가하여, 유도된다. 아래에 설명 된 바와 같이, 주어진 시스템의 사전 평형 동작은 많은 정보를 보유하고, 혼자 평형보다 매우 다른 관점을 제공한다. 시스템이 교정되면, 실험은 매우 빠르며 (나노 그램 양하는 마이크로 그램) 단백질 물질의 소량을 필요로한다. 주어진 시스템의 전체 운동 정보를 수집하는 일 달성 될 수있다. SPR의 높은 민감도는 다른 기술 ^6을 사용 불가능 측정을 제공한다. 그러나이 감도는 위양성 데이터의 주요 원인이 될 수 있기 때문에 '양날의 칼'이다. 반사 지수에 영향을 미치는 요인은 기록 sensogram에 그려집니다. 같은 AP로방법은 적절한 제어는 가양를 제거하는 데 사용되어야하며, 상호 보완적인 접근 방식의 지원은 매우 좋습니다.

도 1은 NTA 코팅 센서 칩을 이용하여 SPR 실험의 진행을 도시한다. 패널에 sensogram는 NTA 매트릭스 위에 니켈 이온 (unsubtracted 데이터)의 주입을 도시하고, 패널은 BD 음성 대조군 세포로부터 유도 된 신호를 감산 한 후 데이터를 표시. 빨간색과 파란색 화살표는 각각 주입 시작과 끝을 보여준다. 분사가 종료 될 때까지의 칩 상에 리간드를 고정화 서서히 질량을 변경한다. 리간드의 분사 종료 후 관찰 안정 고원 표면 (그림 1B, 사이클 2)에 대한 리간드의 안정적인 관계를 반영한다. 안정한 기준선이 달성되면 버퍼 리간드 마도 주입 '빈 제어 "로서 기능 레퍼런스 셀 (사이클 3도 1b)을 통해 주입되고,되고분석에서 차감. 주입하면, 작은 변화는 칩을 통해 대량의 흐름을 반영, 기록됩니다. 그러면 별도의주기 (도 1b, 4 사이클)에서, 분석 물을 주입하고; RU의 점진적 증가는 리간드 분석의 관계를 나타냅니다. 평형에 도달 할 때까지 결합 부위가 점차 점유해진다. 즉시 분사가 종료로, RU에의 감소는 복잡한의 분리를 반영합니다. 미리 평형 평형 속도 상수가 도출 될 수 sensograms부터. (후에 참조) (1) 분석 물과 리간드 사이의 일시적인 상호 작용을 도시도. 상호 작용이 더 안정되면, RU 수준의 감소는 더 낮은 K _{D를 반영} 느리다.

여기서 우리는, 동종의 기판 ^-6,7- 단백질 ^결합 막 수송 체 (세제가 용해) 및 그 기능 파트너 간의 상호 작용을 특성화 목표 SPR 실험을 설명한다. 선택 모드엘 시스템은 ATP 바인딩 카세트 (ABC) 수송, Archeaglobus 오글로 부스 풀기 두스의 ModBC-A이다. 이 시스템은 요금 '온 / 오프', 그 재현성이 높은 결과 잡음비 높은 신호를 선택하고, 고전 하였다. 또한, 동체 ABC 트랜스 포터는 중요한 부정적인 컨트롤을 제공 할 수 있습니다. 수송 체는, ModBC (리간드)을 세제, 정제 상에 고정화 칩을 이용하여 막으로부터 추출 하였다. 그 용해 작용 파트너 모다는 피 분석이다. 음성 대조군 리간드, 다른 ABC 트랜스 포터는 RbsBC ( "리간드 B")를 사용한다.

프로토콜

1. 단백질 샘플 및 버퍼 준비

1. 샘플 준비 : 관심의 단백질을 정화하고 젤 여과 컬럼으로 또는 초 원심 분리에 의해 이전에 실험에 단백질을 주입하여, 모든 집계가 제거되어 있는지 확인 (100,000 XG 충분 보통 10 분에서).
   주 : 바람직한 고순도의 단백질 제제는 필수는 아니지만. SPR 성공적으로보다 적게보다는 완벽한 정제를 함께 심지어 총 추출 ^8,9로 사용되어왔다.
2. 버퍼 준비 :
   1. ( "버퍼를 실행 중"이라고, 또는 RB) 실험의 버퍼를 준비합니다. 프로토콜은 여기에 설명을 위해, 50 mM의 pH 7.5 인 Tris-HCl, 150 mM의 염화나트륨 및 0.05 % (w / v)의 DDM (N- 도데 실 β-D​​-말토 사이드)를 사용한다. 버퍼 조성물의 선택은 쉽게 공부 시스템에 따라 변경 될 수 있음을 유의하십시오.
   2. 0.22 μm의 필터를 사용하여 모든 버퍼 및 단백질 시료를 필터링합니다. 필터가 단백질 - 있는지 사전에 확인호환. 일반적으로, 최근에 판매 SPR 플랫폼은 인라인 드 GASSER를 포함; 이 경우, 탈 가스되지 않은 경우 종래에 사용하는 버퍼.
   3. 밤새 투석 완충액 또는 불일치를 피하기 위해 RB에 대해 샘플을 희석한다. 고점도의 화학 물질을 사용하는 경우 투석 (또는 버퍼 교환 된 임의의 다른 방법)이 특히 바람직하다 (예를 들어, 수 크로스, 글리세롤, DMSO). 펌프 흡입구에 RB 병을 연결하기 전에 별도의 튜브에 따로 RB 10 ㎖를 유지합니다.
3. 20 ㎍ / ml의 ~ 최종 농도로 농축 RB 리간드 스톡을 희석. 높은 농도, 높은 흐름과 짧은 주사 반대로 엄지 손가락의 규칙으로, 안정적인 리간드 고정화, 저 유량에서 더 이상 주사 낮은 리간드 농도를 사용합니다.
4. 원하는 농도 RB에 분석을 희석. 전형적으로, 10 배 희석액을 10 nm의 10 μM에서 알 친화 시스템의 농도 범위를 테스트한다. 항상 시작먼저 낮은 농도.

2. 센서 칩

1. 칩 선택 : 니트릴 산 (NTA) 올리고 히스티딘 태그로 단백질을 캡처하기에 적합한 결합 된 칩을 사용합니다.
2. 칩 사용 :
   1. 새로운 칩을 사용하는 경우, 칼집에서 칩을 꺼내 증류수 (DDW)으로 가볍게 씻어 섬세한 와이퍼를 사용하여 조심스럽게 남아있는 액체를 건조하고, 금 층 표면에 닿지 않도록해야합니다. (칩이 제대로 배치 할 때 삽입이 원활) 올바른 방향으로 다시 칼집에 칩을 놓습니다.
   2. 칩을 재사용하는 경우, 버퍼에서 저장된 칩을 꺼내 전술 한 바와 같이 부드럽게 DDW 건조 깨끗이 씻어 원래 칼집에 배치합니다.
      주 : 칩 비특이적 정크 물질의 축적은 그 생존력을 '에 영향을 미칠 수있다. 이는 리간드 고정화 및 포스트 스트립 핑 된 RU를 비교함으로써 모니터링 될 수있다. 많은 측정 할 수 있지만같은 NiNTA 칩을 사용하여 수행, 장수의 문제는 '명확한'하지 않고 다른 칩 사이에 크게 다릅니다.
3. 칩 도킹 : 센서 칩 문을 열고 칼집에 칩을 놓습니다. 새로운 칩을 사용하는 경우, 입력은 칩의 일련 번호는 사용 기록을 유지한다. 문를 눌러 '독 칩'을 닫습니다.

3. 온도 설정

1. 25 ° C (또는 선호하는 실험 온도)에 칩 셀 온도를 설정합니다.
2. 선택 사항 : 실험을하는 동안 안정적으로 단백질을 유지하기 위해 7 ° C에 샘플 구획​​을 설정합니다.

로드 및 스트리핑 4. 솔루션

H ₂ O에 RB (RB 같이 최종 농도로 EDTA 용액에 세제를 추가)에 RB 0.5 mM의 NiCl _2, 350 mM의 EDTA, 0.25 % SDS, 및 H 100mm의 염산 :로드 및 제거에 대한 다음과 같은 솔루션을 준비 ₂ O. 마이크로 원심 분리기 욕조를 사용하는 경우ES하지 지정된 튜브 SPR, 튜브의 캡을 차단하는 것을 잊지 마세요.

5. 프라임 SPR 악기 RB와

6. 새로운 실행을 시작합니다

1. 실험 기간 동안 사용되는 유량을 설정한다. 여기에 설명 된 결과를 얻으려면 50 μL / 분에 흐름을 설정합니다.
   참고 :이 매개 변수는 실험 기간 동안 수정 될 수 있습니다.
2. 유로 및 참조 빼기를 정의합니다. 여기에 설명 된 경로 된 Fc = 1 된 Fc = 2, 뺄셈 된 Fc = 2-1 결과 집합을 구하십시오.
   참고 :이 프로그램은 실시간으로 측정 된 두 세포의 뺄셈을 표시합니다. 이 매개 변수는 실험 기간 동안 변경 될 수 있음을 유의하십시오.
3. 적합한 샘플을 선택 랙 (이는 샘플 량 소비에 영향을 미칠 수있다).
4. 결과 파일을 저장합니다.

7. 실험 사이클

각 실험 사이클로 구성되어, EA에서 수행 주사의 명확한 기록을 유지CH주기 및 리간드 "로딩 버퍼의 빈 주입하고, 다른 사이클에 주입 분석 물을 분리.

1. 사이클 1 : 칩 준비와 니켈로드
   1. 6.1 및 6.2 단계에있어서의 흐름과 경로가 설정되어 있는지 확인합니다.
   2. 1 분 먹다 남은 음식을 씻어 350 mM의 EDTA를 주입한다.
   3. 10 μL / 분으로 설정 흐름.
   4. 2 분 동안 0.5 mM의 NiCl _2를 주입한다.
      주 : 이제 칩 수지 니켈 이온으로 코팅된다.
2. 사이클 2 : 고정을 리간드
   1. 15 μL / 분, 유로 된 Fc = 2로 설정 흐름.
   2. 분자량 10 ~ 20 배이다 RU 값에 도달 할 때까지 리간드를 주입​​한다. 예를 들어, RU는 500 ~ 1,000 50 kDa의의 리간드를로드합니다. 달성 RU 값의 기록을 보관합니다.
   3. 15 μL / 분, 유로 된 Fc = 1로 설정 흐름.
   4. A. 리간드의 그 제어에 도움을 줄 감산 sensogram FC (= 2-1) 모니터와 같은 RU 값까지 리간드 B (대조군)을 주입주입 길이.
   5. 50 μL / 분, 유로 된 Fc 된 Fc = 1 = 2로 설정 유량이, 기준선까지 5-20 분 동안 세척 시스템 (FC = 2-1)를 안정화시킨다.
3. 사이클 3 : 빈 주입. 따라서, 주입 분석 물 자체를 제외하고, 피 분석 물 주입되는 모든 컴포넌트들을 포함 빈 빼기 위해 봉사한다.
   주 : 사출 길이는 평형 (신호 고원)에 도달하는데 걸리는 시간에 따라 변할 수있다.
   1. 15 μL / 분, 유로 된 Fc = 1 된 Fc = 2, 된 Fc = 2-1 빼기로 설정 흐름.
   2. 30 초 동안 ( '대기'로 이하 함) '대기'명령을 삽입 (안정 기준을 가지고).
   3. 15 초 RB를 주입한다.
      참고 분사의 기간들은 미리 평형 반응 속도 상수 (K 대부분의 _a)에 따라, 상이한 시스템마다 다를 것이다.
   4. 해리 상을 기록 120-600 초를 기다립니다.
      참고 :이 단계의 길이에 따라 달라집니다 K _D : 해리는 더 이상이 단계는 할 필요가 느리다. 매우 느린 해리 단지 (K _d를 ^<10-4 초 ^-1)의 경우, 10 ~ 15 분을 기다린 후 (나중에 참조) 재생 표면 진행합니다.
4. 사이클 4 : 분석 주입
   1. 복사 / 기준 주입 (사이클 3) 그래서이 두 주사 나중에 뺄 수에 사용되는 정확한 조건을 붙여 넣습니다. 검체 용액을 보유 하나 대조 용액을 잡고 하나의 랙의 슬롯의 위치를​​ 변경. 예상 K의 _D보다 약간 농도를 선택합니다. 사전 지식을 사용할 수없는 경우, 좋은 출발점으로 1 μM을 선택한다.
5. 사이클 5 : 버퍼 주입
   1. 반복주기 3.
6. 사이클 6 : 분석 주입
   1. 반복주기 4.
7. 사이클 7 : 칩이 벗겨
   1. 50 μL / 분으로 설정 흐름.
   2. 1 분 동안 350 mM의 EDTA를 주입한다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다. 이 칩에 손상을 줄 수 있으므로 3 분의 단일 주사를 사용하지 마십시오.
   3. 1 분 동안 0.25 % SDS를 주입한다. 이 단계를 두 번 더 반복합니다. 이 칩에 손상을 줄 수 있으므로 3 분의 단일 주사를 사용하지 마십시오.
   4. 기준 레벨에 도달하지 않은 경우, 추가 제거 단계로서 1 분 동안 100 mM의 염산을 주입.
   5. 대기 모드로 전환 '최종 실행'명령을 삽입합니다.
8. 칩 저장
   1. 센서 칩의 도킹을 해제하고 장비를 꺼내.
   2. , 칼집에서 센서를 꺼내 표면에 손이 닿지 않도록, DDW 씻어하고, RB를 포함하는 50 ML 튜브에 장소. 4 ℃에서 보관하십시오.

8. 데이터 분석은 평가 소프트웨어 지정 사용

1. 동역학 파라미터 유도 전에 SPR에 의해 얻어진 원 데이터를 처리하는 다음 단계를 수행한다.
   1. 평가 소프트웨어를 사용하여, 오픈결과 파일은 선택주기는 3-6 된 Fc = 2-1 (참조 데이터를 차감).
   2. 축 이동 :
      1. 디스플레이 사이클 3-6.
      2. 제로 네 곡선의 기준선 (각 사이클에서 초기 30 초 대기 시간)의 Y 축값.
   3. 네 개의 곡선의 X- 축에 맞 춥니 다. 발음 기능을 선택합니다 (예를 들어, 분사 개시 또는 마무리 스파이크) 완벽 X 축을 따라 네 개의 곡선을 정렬합니다. 제로 분석 (또는 제어 버퍼)의 시작 시간을 설정합니다.
2. 참조 뺄셈
   1. 사용 Y 축에서 찾을 수 커브 감산 동작 메뉴를 순환 시프트 (6)의 곡선으로부터 사이클 4 및 5 사이클 곡선의 곡선으로부터 사이클 (3)의 곡선을 뺀 배경 응답을 뺀다.
      참고 : 그것은 표면의 굴절률에 영향을했을 수 있습니다 (분석과 관련이없는) 어떤 비특이적 구성 요소를 말살로이 단계를 수행하는 것이 중요합니다.
      1. t의 감산 곡선을 저장그는 다른 이름으로 프로젝트의 시트.
   2. "이중 감산 곡선"이들 곡선 참조 : 1 감산 모두 주사 수행 2-1 감산하며, 두 번째는 다른 하나의 곡선을 감산한다.
      참고 : 이러한 두 참조는 SPR 실험에서 골드 표준입니다.
   3. 앞서 설명한 바와 같이 축 이동을 수행하여 감산 곡선을 오버레이.
3. 반응 속도 상수 및 모델 피팅의 결정
   1. 운동 실험을 실시
      1. 운동 상수 판정 용 데이터의 신뢰성을 갖도록 6-7 분석 물 농도의 일련의 주입한다. 에서 분석 농도를 선택 2-3 배 희석에, 추정 K _D 아래의 10 배에 위의 10 배. 이상 (위 참조)을 두 번 참조 빼기에 사용되는 "제로"의 농도를 포함합니다. 3 회 반복하고 임의의 순서로 주사를 실시한다.
      2. 맞 춥니 다및 모델 피팅 시도하기 전에 Y 축 및 X 축에 대하여 모든 커브 빼기.
   2. 모델 피팅
      1. 적절한 분석 프로그램을 선택합니다.
         주 : 대부분의 사용 가능한 피팅 프로그램은 피팅과​​ 운동 상수의 결정에 적용 할 수있는 몇 가지 모델을 제공합니다.
      2. 분석과 피팅에 대한 리간드 사이의 상호 작용 (1) : 가역적 인 1 가정 간단한 모델 (랭 뮤어)를 적용합니다. 데이터를 설득하는 것이 더 복잡한 상호 작용의 존재에 대한 다른 실험 방법에서 사용할 수 있습니다하지 않는 한, 항상 간단한 랭 뮤어 모델을 사용하고 있습니다.

결과

본원에 기재된 시스템에서는, NiNTA 칩 그의 태깅 막 수송 ^{-6,7- 고정화하기} 위해 사용된다. 호모 다이머이기 때문에, 각각의 수송은 이중 그것 NiNTA 칩에 결합 개선, 태그됩니다. 니켈로드, 리간드 (관심 수송)을 따라하는 것은 RU 3,500 ~까지 된 Fc = 2에 고정화 (프로토콜주기 2, 그림 2A 블랙 라벨). 다음에, 동일한 흐름 및 분사 기간, 리간드 B (제어 리간드)를 사용하는 것은 초기까지만 ~ 3000 RU에 도달 된 Fc = 1 상으로 분사된다. 유사한 단백질 양의 두 흐름 세포에 고정되어 있는지 확인하십시오; 리간드는 또한 신중 B 3500에 로딩 된 RU를 모니터링하면서, 짧은 주입하여,로드된다. '계단'형태는 각각의 주입 (그림 2A 회색 라벨)에 따라 된 Fc = 1에 대량의 점진적 증가를 나타냅니다. FC를 온라인 모니터링 = 2-1은 동일한 리간드 로딩을 제어하는 데 도움이됩니다. 그림 2B...

토론

SPR은 분자 상호 작용을 연구하는 고감도 방법이며, 과도 (아직 중요) 상호 작용의 실시간 모니터링을 제공하는 유일한 방법은 많다. 예는 다른 방법 (풀 - 다운 분석법 리포좀 침강 분석법 ^6)에 의해 검출 될 수없는 본 명세서 과도 상호 작용한다. 다른 방법 (정량적 또는 정 성적 관계없이) 측정을 평형 제한되어 있지만 또한, SPR은 미리 평형 동역학을 측정 만 기술 중 하나이다.

그 고조 감도는 또한주의해야 할 점이다. 거짓 양성 sensograms 용이하게 기록되어있다. 이 때문에 SPR 측정을 시도하기 전에 다른 방법을 사용하여 상호 작용의 존재를 설정하는 것을 권장한다. (과도 상호 작용에 대 안정 K _D의 거친 평가) 시스템의 특성에 대한 사전 지식은 SPR의 experime을 설정에 많은 도움이 될 것입니다NTS 얻어진 측정의 기능적 적합성을 평가. SPR 측정을 시작하면 단백질 시료의 품질이되기 전에 중...

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
Biacore T200	GE 헬스케어	28-9750-01
센서 칩 NTA	GE 헬스케어	14100532
BIA평가	GE 헬스케어
바이아코어 T200 소프트웨어	GE 헬스케어
니켈 클로라이드	시그마	N6136
소듐 텅스텐스테이트 디하이드레이트	시그마	T2629
소듐 클로라이드	주식회사 바이오 랩
Trizma base	Sigma	T1503
Ethyldiamine-tetraacetic acid disodium salt dihydrate (EDTA)	Sigma	E5134
n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM)	Affymetrix	D310
Sodium dodecyl sulfate solution	Sigma	05030
Kimwipes KIMTECH	Kimberly-Clark	34120
염산	GADOT	7647-01-0
나일론(NY) 멤브레인 필터	Sartorius	25007--47------N
ModBC ABC 트랜스포터	Lewinson lab
RbsBC ABC 트랜스포터	Lewinson 랩
ModA 기질 결합 단백질	Lewinson 연구실