인간 전혈에서 실시간 세포 독성 분석 실험

요약

전혈 세포 독성 분석 (WCA)는 형광 현미경 및 자동화 된 화상 처리와 높은 처리량 셀 위치 결정 기술을 통합하여 개발 된 세포 독성 분석이다. 여기서, 우리는 항 CD20 항체로 처리 림프종 세포가 세포 독성 정량적 분석을 제공하는 인간 전혈에서 실시간 분석 할 수있는 방법을 설명한다.

초록

전반적인 세​​포 독성의 시간 정보에 대한 액세스를 허용 생균 기반 전혈 세포 독성 분석 (WCA)는 높은 처리량 셀 측위 기술 개발된다. 표적 종양 세포 인구 먼저 배열 형식으로 고정화에 미리 프로그램 및 녹색 형광 세포질 염료로 표시되어 있습니다. 셀 어레이의 형성에 이어, 항체 약물은 인간 전혈과 조합하여 첨가한다. 요오드화 프로피 듐 (PI)는 다음 세포 사멸을 평가하기 위해 첨가된다. 셀 어레이는, 자동 촬상 시스템으로 분석된다. 세포질 염료를 대상으로 종양 세포 인구 레이블하지만, PI는 죽은 종양 세포 인구 레이블. 따라서, 표적 암 세포의 사멸 율은 죽은 표적 세포의 수에 표적 세포 생존 수를 계산함으로써 정량화 할 수있다. 이 방법으로, 연구자들은 시간 의존적 농도 의존적​​ 세포 독성 정보에 액세스 할 수있다. 놀랍게도, 유해 라디오 없다화학 물질이 사용된다. 여기에 제시된 WCA는 림프종, 백혈병 및 고형암 세포주에서 테스트되었습니다. 따라서, WCA는 연구자가 관련성이 높은 생체 조건에서 약물의 효능을 평가할 수 있습니다.

서론

제약 산업에서의 최근의 진보는 종양 세포 항체 및 개인화 된 암 치료의 특정 식별을 실현하는데 관심이 높아진있다; 그러나, 여러 가지 장애물 공정에서 발생된다. 전임상 개발에 항암 활성을 에이전트의 단 5 %의 단계 II-III 시험 ^{1, 2에} 충분한 효능을 표시 한 후 라이센스가 부여됩니다. 많은 예제 인해 서로 다른 혈액 성분 ^3-5 그 항 종양 약물은 인간에 주로 실험 동물에 다르게 동작 보여 주었다으로 임상 전략 (생체 외 및 생체 내) 최적입니다.

항암 약물 스크리닝 플랫폼의 필요성을 해결하기 위해 비싼 동물 실험 및 임상 시험 전에 체크 포인트를 제공하기 위해, 인간 전혈 세포 독성 분석 (WCA)는 더욱 중요한 생물학적 환경에서 항 종양 약물의 효능을 평가하기 위해 제안된다.전혈 세포 독성 분석은 항체 및 인간 전혈의 다른 약물 후보 개별 세포의 반응을 평가할 수있다.

WCA는 높은 처리량과 높은 함량 촬상 ⁶ 높은 처리량 셀 위치 결정 기술을 통합하여 개발된다. 자동화 된 이미징 시스템을 이용하여 모두 거실과 사균의 수는 고정밀 도로 측정 할 수있다. 인해 표적 세포가 동일한 초점 평면 상에 고정된다....

프로토콜

1. 대상 셀 준비

1. 37 ^O C에서 (10 % 열 - 불 활성화 소 태아 혈청 (FBS), 4 ㎚ L 글루타민, 500 IU / ml의 페니실린 / 스트렙토 마이신, RPMI 1640 배지) 성장 배지에서 표적 세포 (예. 라지 림프종 세포)를 유지 5 % CO ₂ 인큐베이터.
2. 15ml의 튜브에 표적 세포 펠릿 시료를 원심 분리기. 원심 분리 시간은 다른 세포 유형에 따라 달라집니다; 라지 세포에 대한 468 XG에 3 분 동안 원심 분리.
3. 먼저 상층 액의 표면에 형성하는 거품을 대기음, 전체 상층 액을 제거합니다.
4. 튜브에 PBS의 10 ML을 추가합니다. 세포 덩어리를 분리시킨 솔루션을 피펫 팅에 의해 여러 번 아래로 세포를 다시 일시 중지합니다.
5. 원심 분리기 468 X g에서 3 분의 샘플.
6. 상등액의 표면에 형성하는 기포를 대기음, 전체 상층 액을 제거한다.

세포 마이크로 어레이 2. 준비

1. Obtain 세포 부착 96 웰 플레이트 키트 또는 단일 셀 어레이 8 웰 챔버 슬라이드 (재료 / 시약의 표 참조).
2. 키트에서 DNA 시....

결과

항 CD20 항체 및 림프종 세포 (라지 세포 및 MC / CAR)은 전혈 세포 독성 분석 (WCA) ^7,8 입증하는 모델 시스템으로 선택되었다. MC / CAR 세포들은 멤브레인 CD20 낮은 카피 수 있었는 라지 세포는 세포 표면 상 CD20의 높은 카피 수 있었다. 표적 세포는 먼저 녹색 형광 세포질 염료 녹색 염색 96 웰 플레이트에 배열했다. 10000 - 50000 림프종 표적 세포를 각 웰에 고정화 하였다. 갓 그린 인간 전혈 180 ㎕를 각 웰에 첨가 하였다. 항 CD20 항체는 농도 구배 96 웰 플레이트의 각 웰에 첨가 하였다. 37 ° C에서 16 시간 배양 한 후, 세포 수는 녹색 형광 세포 및 적색 형광 세포의 수를 분석하여 자동 화상 카메라를 통해 정량적으로 평가 하였다. 림프종 표적 세포가 모두 동일한 초점 평면 상에 배열 되었기 때문에, 각 셀의 형광도 레모 않고 직접 검출되었다웰에 혈구 ving.

도 1에

토론

WCA는 이상적으로 이러한 CDC와 ADCC 분석 ^9-11, 같은 및 전임상 동물 시험 전에 기존 대상 검사 한 후 사용 단일 셀 해상도 ^12-16,와 체외 안티 - 암 검진 도구에서 중요하다. 현재, 이러한 CDC 또는 ADCC 분석 1 차 대상 심사 분석은 모든 단순화 된 미디어 또는 버퍼 시스템에서 수행됩니다. 그러나 이러한 단순화 된 완충 시스템에서 효능을 보여 약물 후보는 항상 더 복잡한 전혈 시스템에서 효과적이지 않다. 따라서, WCA는 전통적인 타겟 상영 비싼 동물 연구 간의 격차 가양 줄이고, 따라서 동물 실험 또는 인간 임상 시험에서 예방 고장을 방지 할 수있다. WCA는 인간 전혈의 함량 약물 효능을 테스트하기 위해 전임상 연구에서 작업 연구자 유익 할 것이다. 유동 세포 계측법을 사용하여 죽은 자와 살아있는 세포를 계산하는 것은 적혈구 CE의 완전한 용해가 필요합니다순서 LLS가 표적 세포를 검출한다. 유동 세포 계측법 위에 WCA 기술.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
셀 부착 96웰 플레이트 키트	Adheren	AP9601
현탁액 단일 세포 어레이 8웰 챔버 슬라이드	Adheren	SS0801
Adherent 단일 세포 어레이 8웰 챔버 슬라이드	Adheren	SS0802
림프종 세포주 CD20+		ATCC CCL-86	라지 세포
림프종 세포주 CD20-ATCC		CRL-8083	MC/CAR
RPMI 1640(L-글루타민 포함	Life Technologies	11875-119
Fetal 소 혈청	Thermo	SH30070.01HI
Peni/Strep	Life Technologies	15070063
Cytosolic dye	Life Technologies	C7025	세포 추적기 Green
Rituxan (바이오시밀러)	Eureka Therapeutics
인간 전혈	Allcells	WB001
프로피듐 요오드화물	시그마	P4170-10MG
자동 이미징 시스템	분자 장치	Cell Reporter	에 문의
세포 계수 프로그램	분자 장치	Cell Reporter	에 문의

) 공급업체 공급업체