이 비디오는 in ovo electroporation으로 transfection 후 절개된 병아리 배아 척수 샘플에 대해 전체 전사체 분석을 수행하기 위한 기본 단계를 보여줍니다.
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이 논문에서
요약
초록
병아리 신경관의 난자 전기천공법은 신경 발달 중 유전자 기능을 식별하는 빠르고 저렴한 방법입니다. 이러한 실험적 조작 후 차등적으로 발현된 전사체의 게놈 전체 분석은 형질주입된 구조체로 인한 다운스트림 효과에 대한 거의 완전한 그림을 밝힐 수 있는 잠재력을 가지고 있습니다. 이 연구는 전기천공법과 차등적으로 발현된 전사체 식별 사이의 모든 단계를 포함하는 형질주입된 배아 척수 샘플의 전사체를 비교하는 간단한 방법을 설명합니다. 첫 번째 단계는 전기천공법(electroporation)에 대한 지침과 리보뉴클레아제가 없는 환경에서 HH23 배아에서 형질주입된 척수 반쪽을 해부하기 위한 지침과 전사체 염기서열분석에 적합한 고품질 RNA 샘플 추출에 대한 지침으로 구성됩니다. 다음 단계는 Galaxy 공용 서버에서 RNA-Seq 데이터 세트를 필터링하고 비교하기 위한 일반적인 지침이 있는 생물정보학 분석으로, 중소 규모 실험을 위한 로컬 계산 구조의 필요성을 제거합니다. 대표적인 결과는 해부 방법이 고품질 RNA 샘플을 생성하고 두 대조 샘플에서 얻은 전사체가 본질적으로 동일하다는 것을 보여주며, 이는 실험 샘플에서 차등 발현 유전자를 검출하기 위한 중요한 요구 사항입니다. 또한, 대조군 샘플과 비교한 후 DNA 구조체의 실험적 과발현을 시각적으로 확인할 수 있는 한 가지 예가 제공됩니다. 이 방법의 적용은 척수 조기 발달에 관여하는 신경 요인의 기능에 대한 새로운 발견을 촉진하는 강력한 도구가 될 수 있습니다.
서론
OVO 전기에 DNA 1-5을 구성하여 부분적으로 생체 내에서 배아 구조에 감염 될 수있는 빠르고 저렴한 방법을 나타 내기 때문에 살아있는 유기체에 유전 연구는 자주 모델로 닭 배아를 사용합니다. 이러한 pCIG 6 pMES 7과 같은 목적 유전자와 함께 형광 리포터를 함유 한 증명서를 인코딩 시스 트론 발현 벡터, 하류 분석 배아를 처리하기 전에 실체 현미경을 이용하여 원하는 영역에 형질 전환 품질의 빠른 확인을 허용한다.
DNA 시퀀싱 최근 발전으로, 그것은 RNA-SEQ 8,9을 사용하여 RNA 샘플들로부터 디지털 전 사체 발현 프로파일을 획득하는 것이 가능하다. 따라서, 대신 그러한 계내 혼성화, 면역 조직 화학 및 qPCR에,의 cDNA 라이브러리의 제조에서와 같이 병렬로 몇 유전자 산물의 분석을 가능하게 시간이 걸리는 방법높은 처리량 시퀀싱 전 사체의 정보를 제공 할 수있다. 모든 단일 유전자의 발현 수준에 대한 효과 실험 관찰 차례로 사용 구조체에 의해 변경 경로에 강력한 통찰력을 제공 할 수있다. 이 사용 유기체의 게놈 어셈블리를 사용할 수있는 경우 특히 쉽고, 따라서 병아리 배아는 ....
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프로토콜
1. Electroporate HH12-13 닭 배아의 신경 튜브 OVO의 관심의 구조물
형질 전환의 만족 수준이 개인의 빠른 식별을 가능하게하기 위해, 바람직하게는 시스 트론 성적 증명서, 형광 기자를 사용하거나 인터 바이러스 2A 펩타이드 (11)와 함께 관심의 단백질에 융합. 참고 :이 단계에 대한 일반적인 배양 시간은 37.8 ° C에서 약 48 시간이다.
- 18 G X 1 1/2 바늘에 연결된 주사기와 알부민의 3 ㎖를 제거한 후 계란에있는 작은 창을 엽니 다. 배아 시각화를 향상시키기 위해, 배아 1-4 아래 멸균 링거액에서 1:50 희석 인도 소량의 잉크를 분사.
- 멸균 링거액과 배아를 커버 한 후, 2.5 μg의이 신경관의 후방 말까지 DNA가 채우기 / 때까지 μL를 포함하는 10 mM 트리스 - 염산, pH를 8.2 및 0.1 % 식품 염료 (F, D & C) 솔루션을 주입후뇌 지역까지. 상기 측면 영역을 따라 4mm (1)에 의해 분리 된 위치 백금 전극 (직경 0.5 mm)를 electroporate하고 (4) 사이의 100 밀리 초 간격으로 5 내지 50 밀리 초 펄스 및 20 V를 제공한....
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결과
설명 된 방법을 검증하기 위해, 두 개의 제어 샘플은 빈 벡터 pMES 7 삽입 닭 SCRT2 (18)의 아연 손가락 도메인을 인코딩 SCRT2-ZNF를, 구성이 포함 된 동일한 벡터로 형질 전환 된 배아에서 하나의 샘플에 electroporation하여 배아에서 발생했다. 각 11-22 μg의 총 RNA를 산출 샘플은 8 ~ 12 배아의 풀에서 얻었다. 모든 3 개의 시료 고품질 RNA이 프로토콜로 얻을 수있는 것을 보여주는 Bioanalyzer 기기 (도 1)로 수행 품질 검사로 (10)의 최적 RIN 값을 얻었.
서열 분석 후, 기재 필터링 프로세스가 판독의 83~91% 배향 률을 증가 (데이터 미도시). 예상 한 바와 같이, 전 세계적으로 산포도에 비해 두 제어 샘플에서 transcriptomes의 비교 (그림 2) 명확한 차이를 보이지 않았다 및 피어슨 상관 계수는 0.......
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토론
여기에서 우리는 닭 척수의 전기 후 효과 분석을위한 지침을 제공합니다. DNA 벡터의 전기가 더 자주 관심의 유전자를 과발현하는 데 사용되지만, 하나는 또한 유전자 기능 녹다운 조건 19-21를 생성하는 siRNA를 위해 우성 네거티브 quimeric 또는 전구체 단백질을 코딩하는 구조를 이용할 수있다. 실제로, 이득 - 및 기능 상실 분석 모두에 기인 사체 프로파일의 비교는 차별적 따라서 전위가 더 구체적인 효과를 발견하는 데, 각 조건에 반대 방식으로 유전자 발현을 지적 할 수있다.
임의의 방법은 RNA 추출 하류인가 같이, RNA-SEQ 라이브러리의 합성 출발 물질의 최소 초기 량을 필요로한다. 이 프로토콜로, 8 배아는 약 10 μg의 총 RNA의 항복하기에 충분해야한다. 적절한 작업 농도를 손상시키지 않고 개인의 낮은 숫자로 시작하는 것은 아마도작은 부피의 최종 희석 있도록 RNA 추출 시스템의 사용으로 가능.
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공개 사항
저자는 공개할 것이 없습니다.
감사의 글
CYIY는 FAPESP (2012/14421-5)에 의해 지원되며 FMV는 FAPESP (2009/53695-0)의 펠로우십에 의해 지원됩니다. 이 작업에 사용된 RNA-Seq 라이브러리의 준비 및 염기서열분석을 해준 University of California, Davis의 DNA Technologies Core, 고처리량 염기서열분석 데이터 분석 도구를 위한 우수한 무료 인터페이스를 제공한 Galaxy 팀, 실험실 공간에서 촬영할 수 있도록 해준 Marianne Bronner 박사에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 인도 잉크 | 모든 공급 업체 | ||
| 18G x 1 1/2 바늘 | BD | 305196 | |
| 3 ml 주사기 | BD | 309657 | |
| 트리스 | MP Biomedicals | 819620 | |
| F D & C Blue 1 | Spectra Colors Corporation | 5.FC.0010P0 | DNA 주입을 시각화하는 데 사용되는 식품 염료 |
| Ringer's solution (1 L) | |||
| - 7.2g NaCl | 시그마-알드리치 | S-9888 | |
| - 0.37g KCl | 시그마-알드리치 | P-4504 | |
| - 0.225g CaCl2• 2H2O | 피셔 사이언티픽 | 10043-52-4 | |
| - 0.217 g Na2HPO4.7H2O | 시그마-알드리치 | S-9390 | |
| - 0.02g KH<서브>2PO<서브>4 | 시그마-알드리치 | P-5379 | |
| - ddH2O를 800ml로 조정하고 pH를 7.4 | |||
| . - ddH2O에서 1 L | |||
| - 필터 및 오토클레이브 | |||
| PBS(인산염 완충 용액)(1L) | |||
| - NaCl 시 | 그마-알드리치 | S-9888 | |
| ; - 0.2g KCl | 시그마-알드리치 | P-4504 | |
| - 1.15g Na2HPO4• 7H2O | 시그마-알드리치 | S-9390 | |
| - 0.2g KH2PO4 | Sigma-Aldrich | P-5379 | |
| - ddH2O를 800ml로 조정하고 pH를 7.2 | |||
| 로 조정합니다. - ddH2O에서 1L 및 필터 | |||
| - 1ml DEPC(디에틸피로카보네이트) | 시그마-알드리치 | D-5758 | |
| - 세게 흔들고 실온 | |||
| - 오토클레이브 | |||
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참고문헌
- Itasaki, N., Bel-Vialar, S., Krumlauf, R. Shocking' developments in chick embryology: electroporation and in ovo gene expression. Nat. Cell Biol. 1 (8), 207-20 (1999).
- Krull, C. E. A primer on using in ovo electroporation to analyze gene function. Dev. Dyn....
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재인쇄 및 허가
