해마의 Organotypic 조각의 쌍으로 전체 셀 녹음

글루타메이트 수용체는 중추 신경계의 시냅스에서 흥분성 시냅스 전달의 대부분을 중재. 시냅스 후 막의 척추 헤드에서 번역 이온 성 글루타메이트 수용체의 두 가지 서브 타입은 N-메틸-D-아스파 테이트 (NMDA)과 α-아미노 -3 - 히드 록시-5 proprionic-4-메틸 아이 산 (AMPA) 수용체이다. 막 전위를 휴식에서 AMPA 수용체는 시냅스 전달하는 동안 시냅스 전류의 대부분을 수행한다. 해마에서, NMDA 수용체가 시냅스 막에서 AMPA 수용체의 수의 변화를 유발에 중요한 역할을한다 : "일치 검출기"로 작용함으로써 ^하나는 시냅스 강도 ^하나의 변경을 시작하는, NMDA 수용체는 시냅스 메커니즘에 참여 즉 세포 내 수준에서 학습과 기억을 뒷받침하는 것으로 생각된다. 시냅스 송신기 릴리스에 평행 시냅스 신경 세포의 탈분극에 응답하여, 칼슘 NMDA 통해 입사수용체가 AMPA 수용체의 삽입 또는 제거 ^2를 시작합니다. 이러한 수용체는 시냅스 역학 소성을 이루는 시냅스 강도의 감소가 장기 우울증 ⁴ (LTD) 동안 시냅스 강도의 증가는 장기 증강 ^2,3 (LTP)이다. NMDA 수용체는 그것의 제어를 유도하는 것으로 생각되는 반면 따라서 AMPA 수용체 이동은 시냅스 가소성 발현 책임 생각된다.

시냅스 전송 및 소성의 기초가되는 정확한 메커니즘을 결정하는 것은 이상적으로 시냅스의 작은 인구, 하나의 시냅스를 공부해야합니다. 일부 시냅스는 매우 인해 시냅스 연결의 작은 확산 특성이 매우 어렵습니다 대부분의 시냅스 집단이 수준, 예를 들어, ^다섯 개최의 꽃받침,에서 연구에 적합하는 동안. 두 주요한 기술은 전기 생리학 단일 시냅스 연결을 검사하기 위해 개발되었다 : 제 최소 자극이며, 어디 있나한 시냅스 섬유 추정된다 전자는 세포 외 자극. 두 번째 기술은 시냅스 연결 뉴런에서 두 개의 동시 전체 셀 녹음이 수행 기록을, 짝. 최소한의 자극의 주요 장점은 동시에 시냅스 후 뉴런에서 촬영하면서 축삭 기관으로 세포 외 자극 전극의 배치를 포함하는, 수행하도록 신속하고 비교적 간단하다는 것이다. 이 기술을 이용하여 주요 관심사는 단일 셀의 신뢰성 자극 거의 시험 후 시험을 보장 할 수 있다는 것이다.

지난 15 년 동안 우리는 정기적으로이 시냅스 연결 피라미드 뉴런 ^6-17에서 전체 셀 녹음을 쌍으로 사용하고 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 단지 하나의 시냅스 전 뉴런이 일관되고 신뢰성있게 자극한다는 것이다. 또한 전기 생리 학적 특성뿐만 아니라, 시냅스 전 뉴런 ^{6,18 <약리학} 조작뿐만 아니라 허용/ SUP>. 그러나, 뉴런 사이의 시냅스 연결의 확률은 ¹⁹ 구에 접속 쌍 어렵게 낮다. 의 Organotypic 뇌 슬라이스 배양의 사용은 시냅스 연결 등이 장애물이 시험 관내에서 다시 설정할 수 있고, 더구나 그 결과 연결이 자연 네이티브 뇌 조직 ^(20)과 유사하다 우회. 또한,의 Organotypic 문화에 가소성 메커니즘을 가능하게 LTP, LTD ^{7-10,12-15,21} 페어링 된 펄스 촉진 (PPF)과 우울증 (PPD) ^6,22,23을 포함한 단기 시냅스 가소성을 추가로 표현 뉴런 쌍으로 연구 될 수있다. 여기에서 우리는 성공적으로 시험 관내 시스템에서 한 쌍의 기록을 달성에 관련된 자세한 방법을 설명합니다. 이 정보는 용이 급성 뇌 조각 및 다른 영역을 포함하는 다른 실험 시스템에 적용 할 수있다.

동물 윤리 정책 :

이 논문에서 설명하는 프로토콜은 오클랜드와 스탠포드 대학의 대학에 의해 설립 된 동물 보호 지침을 따르십시오. P7 쥐 새끼는 빠른 잘린 안락사되었다. 해마 해부는 즉시 아래에 설명 된대로 수행됩니다.

1의 Organotypic 해마 슬라이스 문화

1. 준비
   1. (뇌를 해부에만 사용) 해부 매체를 준비합니다. , 5 ㎖의 HEPES 완충 용액, 2 ㎖의 1 M 트리스 주식 솔루션 (산도 7.2) (0.85 % NaCl을 각각 10,000 대) 200 ㎖의 최소 필수 중간, 2 ml의 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션을 결합하고, 필터는 0.22 μm의 필터 소독 . 얼음처럼 차가운 해부 매체에서 해마 절제술을 수행하십시오.
   2. 해부 매체를 쿨. 약 1 시간 전에 액체가 매우 추운 때까지 절개를 시작하기에 냉동실에서 해부 미디어를 넣습니다. 큰 얼음 CR을 허용하지 마십시오ystals을 형성한다. 필요한 때까지 얼음에 보관하십시오.
   3. (해마의 해부를 제외한 모든 사용) 문화 매체를 준비합니다. / L-글루타민, 2 ml의 페니실린 - 스트렙토 마이신 솔루션 와트, 행크의 염 / w 100 ㎖의 최소 필수 중간, (1 배 농도, 액체) 겸용 (0.85 % 액체, 각각 10,000 대, 염화나트륨), 2.5 ml의 HEPES 한 M 버퍼 솔루션, 50 ML 행크의 균형 소금 솔루션, 50 ㎖의 말 세럼 (정의, 열 불 활성화) 및 필터는 0.22 μm의 필터 소독.
   4. 문화 요리를 준비합니다. 35mm 배양 접시 당 배양액 1 ㎖를 배치하고, 각 요리에 막 삽입을 추가합니다. 한 150mm 페트리 접시에 이러한 요리의 일곱까지 착용 할 것 ( '판'이라고 함). 요리 배양 배지는 적절한 온도와 pH가 달성되도록 절개가 시작되기 전에 적어도 한 시간 동안 CO ₂ 배양기에서 접시를 놓습니다.
2. 출생 후 7 일에서 쥐 새끼들까지 잔치에서 해마의 해부 (P7)
   1. 절차 전에 자외선 아래의 모든 해부 도구를 사전 소독.
   2. 급속한 잘린 후 접시에 냉장 한 매체 중에 뇌와 장소를 제거하고 해부 용 가습 필터 종이 조각을 제거. 해마를 노출, 무딘 부드러운 플라스틱으로 코팅 된 미니 주걱을 사용하여 멀리 중뇌에서 피질을 애무 해줘. 원개를 절단 한 다음 조심스럽게 (그림 1A)를 밖으로 플립 해마 아래에 주걱을 작동합니다.
      노트 : 슬라이스 배양 P10까지 동물을 사용하여 제조 될 수있다.
   3. 멀리 뇌의 나머지 부분에서 분리 된 해마를 낸다. 적신 부드러운 붓을 사용하여 냉장 해부 매체를 포함하는 새로운 접시에 해마로 이동 (예를 들어, 흰색 검은 담비 # 4).
   4. 이러한 스폰지, meninge 형상 조직이 어려운 해마를 분리 할 수 있도록 같이, 박리시 맥락총의 해마의 하부 (즉, 평탄한면) 청소나중에 서로 조각.
      참고 : 그들이 부드럽게 떨어져 조롱 할 수없는 경우 대신이 조직을 둡니다.
   5. 해마를 손상시키지 않고 가능한 한 빨리 전체 절개를 수행한다.
      참고 :주의 해부 한 실험 조건이 냉각 될 때, 빠른 일보다 더 중요하다. 동시에 세 쥐의 해마를 썬다. 도금 조각이 인큐베이터에 갈 때 슬라이스 건강이에 한 시작부터 총 시간 등의 영향을받지 않습니다 30 분을 받고있다.
3. 슬라이스
   1. 가로 수동 조직 슬라이서를 사용하여 400 μm의 크로스 섹션으로 해마를 썬다. 슬라이싱이 수행 된 방법은 조직에 과도하게 손상되지 않고 (암몬의 혼이 쉽게 조직에 보존 할 볼 수 있습니다 즉) 쉽게 볼 수 층류 아키텍처와 일치하는 두께의 조각을 생산 너무 오래 같이 중요하지 않습니다.
   2. 조직의 무대에서 해마를 거짓말2 여과지 트리플 두께의 위에 초퍼. 해마는 (오히려이 시점에서 슬라이스 빵 덩어리처럼, 그림 1B 모든 인하되었습니다 때까지 전체 해마가 헬기의 무대에 남아 즉) 개별적으로 모든 조각을 제거하지 않고 완전히 분리된다.
   3. 각 해마 옆에 누워 부드러운 붓 (2 흰색 검은 담비 #)를 사용하여 해부 매체로 해마를 전송합니다. 부드럽게 해마와 기본 필터 종이 사이의 접착력을 깰 측면에 각 해마를 밀어 넣습니다. 무대에서 내려 데리러 각 해마 아래 브러시를 굴립니다. 냉장 해부 매체의 동일한 35mm 페트리 접시에 모든 해마를 놓습니다. 수동으로 시계 방향과 반 시계 방향으로 운동을 교대로 요리를 교반하여 개별 조각으로 해마를 분리합니다.
   4. 해부 현미경 슬라이스를 검사하고 명확하게 보이는 셀을 소유하지 않는 작은 손상, 또는 어떤되는 모든 폐기몸 층.
      참고 : 종종 모든 조각이 성공적으로이 방법으로 자신의 형제 분리되어 있지 경우가 될 것입니다. 이 경우, 그들은 가장자리에 돌려서 미세 핀셋의 선단 그들을 괴롭히는 의해 분리 될 수있다. "좋은"슬라이스가 다음 차단 및 화재 연마 파스퇴르 피펫 (그림 1C-E)를 사용하여 냉장 해부 매체를 포함하는 또 다른 깨끗한 페트리 접시로 전송됩니다.
4. 저장
   1. 멤브레인 필터 인서트에 개별 조각을 놓습니다. 파스퇴르 피펫을 사용하여 차단 및 화재, 더 큰 구멍을 줄 개별적으로 문화 삽입에 조각을 전송하는 연마.
      참고 : 절단 및 화재 연마 피펫이 중요한 때 생성 된 구멍의 크기입니다. 너무 작은 조각은 쉽게 막에 대한 피펫을 떠나지 않을 것입니다. 너무나 큰 과잉 유체는 슬라이스와 함께 공막의 표면 상에 배치된다. 최적 내경은 전형적으로는 약 절반이다 DIAM피펫의 배럴의 eter. 절단 할 때에는,이 직경은 피펫의 테이퍼에 적절한 장소에서 절단함으로써 선택 될 수있다.
   2. 슬라이스 전송
      1. 첫째 매체와 피펫을 입력 한 다음 작은 흡입 힘을 가진 한 조각을 빨아. 이 피펫의 개통 근처에 슬라이스를 유지하고 슬라이스를 배치 할 삽입에 너무 많은 매체 추방을 방지 할 수 있습니다.
      2. 작은 매달려 방울을 형성하는 전구에 약간의 힘을 주어 슬라이스가 물방울에 정착 한 다음 막에 그 방울을 터치 멤브레인에 슬라이스 "가을"을 할 수 있습니다. 일반적으로 3 조각은 각각의 막 삽입에 배치됩니다.
         NOTE : 유체 액적가 너무 큰 경우, 세 조각에서 물방울 막 표면에 병합하는 경향이 있고, 슬라이스 따라서 모든 더 어렵게 이후 전기 생리 녹화 그들을 분리 할 수​​있게, 멤브레인의 중앙에 수집된다.
   3. 유체 Remov알
      1. 슬라이스에 침지 또는 해부 매체의 수영장으로 둘러싸여되지 않도록, 그 판의 모든 조각 (삽입 당 3 조각 = 플레이트 당 21 조각)의 배양 용기 삽입의 상단에서 초과 매체를 대기음.
      2. 이 포경 함께 수행하지만, 화재 연마 파스퇴르 피펫. 슬라이스가 정착 피펫 팅 전에 분 동안 막에 부착 할 수 있습니다. 최대 피펫으로 슬라이스를 흡입하지 않도록주의하십시오. 슬라이스가 정착하기에 충분한 시간을 허용하기 위해, 제 도금 인서트 유체 제거를 수행한다.
   4. 슬라이스 저장
      1. 37 ° C에서 5.0 % CO ₂ 인큐베이터에 보관 슬라이스 문화. 그림 1E의 문화의 최종 배열을 관찰한다. 개별 조각은 밑바닥 공막가 배양 용기 삽입시 휴식,이 인서트는 매체의 소량 충전 페트리 접시 안에 맞는; 이것에 의해, 슬라이스 나에 몰입되지 않습니다dium는 있지만 배양 플레이트 인서트의 하단 멤브레인을 통해 액세스 할 수 있습니다.
      2. 임의로, 배양 접시를 삽입하거나 제거하여 슬라이스를 포함하는 인서트 막의 단면을 잘라내어 수도 연구 중 슬라이스를 제거한다.
5. 유지 보수
   1. 문화를 한 후 일 배양 접시에서 매체를 교환한다. 전송하기 전에 적어도 한 시간 동안 배양기에서 평형화 신선한 배지 1 ㎖를 함유하는 새로운 배양 접시에 배양 플레이트 인서트를 전송합니다.
   2. 문화를 한 후 셋째 날에 동일한 방식으로 다시 매체를 변경합니다. 셋째 날, 34 ° C로 설정 인큐베이터에 문화를 전송합니다. 두 번 각 주 (모든 3-4일을) 매체를 변경합니다.
   3. 건강한 문화를 식별합니다. 한 쌍의 전체 세포 레코딩을위한 건강한 문화를 선택합니다.
      참고 : 건강한 문화가 잘 정의 된 가장자리와 명확하게 정의 된 피라미드 세포 층이있다. 문화 재치시간의 어두운 (가능성이 괴사) 지역 현재 또는 병합 된 테두리가있는 액포 외관은 거부됩니다. 이러한 기준 채택, 슬라이스 문화의 일반적으로 3 분의 2는 충분히 기록 건강.
   4. 시간의 매우 작은 창 내에서 이러한 문화를 활용합니다. 신경 세포가 서서히 시간을 악화 약간 간질 동작을 표시하기 시작 이후 2 주 이상 배양 사용되지 조직을 수행합니다. 신경 세포의 생존의 정확한 상한은 알려져 있지 않습니다하지만 문화 피라미드 세포에게 늦게 16 개 주 기능에서 기록 할 수있다.

2 쌍으로 전체 셀 녹음

1. ACSF 및 세포 내 솔루션
   1. 120 글루 콘산 칼륨, 40 HEPES, 5 _MgCl2를, 2 NaATP, 0.3 NaGTP (; 290 mOsm 삼투압 KOH으로 pH 7.2) (단위 : mm) 혼합하여 시냅스 전극 솔루션을 준비합니다. 같은 전극 용액이 시냅스 후 뉴런, 세슘 글루코 네이트에 사용되는 동안 (120 mM의) 일반적으로 주요 시냅스 전극에 소금 플러스 5 밀리미터 QX314로 사용됩니다.
      참고 :이 시냅스 NMDAR - 중재 전류 ^8-10,13를 기록하는 양의 전위에서 안정 전압 클램핑을 할 수 있습니다. 또한 기가 옴 밀봉이되기 전에 시냅스 기록 전극에서 흐르는 내부 솔루션에 의해 시냅스 전 신경 세포의 칼륨에 의한 hyperexcitability을 방지 할 수 있습니다.
   2. (mm 단위) 구성 시냅스 전극 액 120 세슘 글루코 네이트, 40 HEPES, 5를 MgCl _2, 5 QX314,이 NaATP하고, (; 290 mOsm 삼투압 CsOH를하여 pH 7.2) 0.3 NaGTP를 준비합니다. 5 ~ 10 MΩ 저항에 유리 미세 전극을 당겨 여과 내부 솔루션을 입력합니다.
   3. 인공 뇌척수액 (ACSF) 119 염화나트륨, 2.4의 KCl (mm 단위) 구성을 준비 _황산 1.3, 2.4 _{염화칼슘이,} 하나 나 ₂ HPO _4, 26.2 _탄산 수소 나트륨, 95 % O _2, 5로 포화 된 11 포도당, 산도 7.4, %의 CO _2. 주 : R을 AMPAR 매개하는 경우esponses는 NMDAR EPSCs의 검사를 위해 차단해야하는 ACSF에 10 μM C​​NQX 또는 NBQX을 포함한다.
2. 페어 전체 셀 녹음을 구합니다
   1. 이 개별 뉴런 사이의 시냅스 전달을 조사하기 위해, 시냅스 신경 세포로 하나의 신경 세포를 지정하고 활동 전위를 유도하고 시냅스 전달을 시작하기 위해 현재의 클램프를 누르고 있습니다.
   2. 시냅스 후 뉴런과 같은 뉴런 제를 지정하고, 연구자에 의해 요구되는 정보에 따라 전류 또는 전압 클램프에 고정. 전압 클램프에서 시냅스 후 뉴런을 잡고 MV ^6-16 30에서 조사 -65 MV에서 조사 AMPAR - 매개 EPSCs과 NMDAR - 중재 EPSCs와 글루타메이트 전류의 자세한 검사를 받기
   3. 페어링 기록을 설정합니다. 페어링 녹화를 설정하기 위해, 시냅스 전 세포 기록 반드시 여러 순차 시냅스 후 뉴런있게 제 얻어지는 접속 하는 시냅스 하나까지 획득 될D가 얻어진다. 시냅스 가소성 실험을 수행하는 경우, LTP ^8,19 필요한 세포질 인자의 유실을 방지하기 전 세포 기록을 얻는 10 분 이내에 시작되어야 시냅스 후 뉴런에서 LTP의 유도로 제 시냅스 전 신경 세포를 얻는 것이 특히 중요하다.
   4. 운동에 의한 세포의 손실을 피하십시오. 페어링 전 세포 기록을 행하는 주요 과제는 진동과 제 2 기록을 얻는 반면 제 전 세포 기록 움직임 - 유도 방해를 회피한다.
      1. 제 전 세포 기록을 구하여 설정된 기록이 모니터 (도 2a)에 표시되는 영역의 가장자리에 위치되도록 한 다음 X-축에서 10 내지 200 μm의 현미경 렌즈를 이동.
      2. ACSF 여전히 렌즈와의 접촉을 유지하는 보장 ~ 5-10밀리미터을 현미경의 렌즈를 올립니다. 제 2 전극을 마운트하고 (유체 메 니스 커스 (meniscus)에 그림 2B 안내
      3. 이 렌즈를 통해 빛의 경로 바로 아래에 여전히 크게 기존의 기록 전극 위에까지 xy 평면에 전극을 이동합니다. 전극은 현미경으로 볼 일단 팁이 떨어져 제 1 전극으로부터 멀리 모니터의 가장자리에 확인.
      4. 양 전극이 같은 초점면에 때까지 현미경의 초점을 순서대로 제 2 전극을 아래로 이동합니다. 그것은 제 전 세포 기록을 중단하도록 정압의 레벨이 너무 강해 팁 막힘을 방지하기에 충분히 강하지 만없는 것이 중요하다. 이것은 먼저 슬라이스 들어가면 전극으로부터 2-3에서 운동 신경원을 유도 정압으로 변환.
      5. 첫번째 시냅스 기록 (그림 2C)와 비슷한 초점면에서 시냅스 파트너를 찾습니다. 녹화는 일반적으로 첫 번째 연구의 0-200mm 신경 세포에서 CA3 피라미드 뉴런 초 전 세포 사이의 녹음을 쌍의 취득ecording (그림 2C, D).
         주 : 신경 쌍 사이 시냅스 전달 최대 3-4 시간의 시간 기간에 걸쳐 안정 이러한 표준 전체 셀에 기록하는 기술을 사용하는 경우.
3. 시냅스 일단 성공적 시냅스 연결 피라미드 세포 쌍 취득시 (도 3a를, B), 시냅스 전달과 가소성의 특성을 조사한다.
   1. LTP 유도.
      1. 1 분 0 MV (그림 3C) ^7-9,12-14에 -10 시냅스 탈분극과 시냅스 활동 전위 (1 ~ 200Hz)를 페어링하여 LTP를 유도한다. 브레이크에서 시냅스 후 뉴런의 10 분 이내에 페어링을 시작합니다.
         참고 : LTP는 시냅스 활동 전위로, 1 분 동안 1 Hz에서 시냅스와 시냅스 활동 전위를 페어링하여 현재 클램프에서 열린 두 신경 세포로 유도 할 수는 시냅스 전 신경 세포의 ^팔에 전류를 주입 다음 10 밀리 초를 유도
   2. 또한 5 ~ 10 분 (그림 3C) ⁹ -55 MV에 시냅스 후 뉴런의 약간의 탈분극과 함께 1 Hz에서 저주파 자극 (LFS)에 의해 LTD를 유도한다.

시냅스 연결이 기록 전극을 통해 탈분극 전류 펄스 (20 밀리 초에 대한 일반적으로 20 ~ 50 씩) 전달하여 활동 전위를 발생하는 시냅스 전 신경 세포를 자극하여 분명하다. 시냅스 현재 추적은 시냅스 활동 전위 (그림 3A)의 피크 후 짧은 (<5 밀리 초)과 일치하는 대기 시간에 유발 monosynaptic EPSC의 존재를 검사합니다. 시냅스 연결 쌍 수득되기 전에 대부분의 실험에서 여러 시냅스 후 뉴런 시험된다. 전반적으로, 연접 CA3 세포 ~ 1 / 3의 활성은 시냅스 연결 monosynaptically (도 3a)에 의해 시냅스 CA3 셀에 결합되고, CA3 뉴런의 약 20 %는 모두 유성 6,8 시냅스 연결에 의해 연결된다.

기준선 AMPA 수용체 매개되는 전류의 진폭은 독립적 인 파​​이 사이도 페어링 내에 기록 재판 재판에서 변수이고,빨간색 레코딩 (그림 3B) 6,8. 평균 AMPAR EPSC 진폭은 800 pA의 <10 pA의>에서 원거리, 그리고 가능성이 짝을 녹음 사이의 기능적인 시냅스의 수의 차이에서 발생한다. 실패 속도는 활성 시냅스 6,7로 연결 쌍에 0-95% 실패율에 침묵 시냅스에서 백퍼센트 AMPAR EPSC 실패율에 이르기까지, 쌍 녹음 6,7 사이에 상당히 다를 것으로 관찰되었다. 개별 쌍 녹음 내에서 시냅스 실패는 특히 작은 AMPAR EPSC 진폭과 녹음에 발생했습니다. 다른 시냅스 6에서 발생하는 AMPAR EPSC 진폭의 변화는, 재판에서 인해 재판에 재판에서 배출 계량 적 수의 변동에 (그림 3B)의 가능성이 원시 데이터에서 재판에 분명하다.

듀얼 전 세포 기록도 약리 manipulat 있도록, 사전 및 시냅스 후 뉴런 세포질에 직접 액세스 할기록 전극 (6)을 통해 하나 / 시냅스 및 시냅스 후 세포 모두의 이온. 일반적으로 시냅스 약리 조작은 (10 분 이내) 매우 빠른입니다. 이 같은 형광 표지 덱스 트란은 기록 전극으로부터 떨어져 ≤200 μM 시냅스 단자에 접근 할 수, 작은 분자 (예를 들어, BAPTA)에 한정되지 않는다. 따라서 오징어 거 시냅스 25에서 수행 된 것과 유사한 분석은 해마 슬라이스 시냅스 소포 방출 기계의 연구로 확장 될 수있다. 페어링 녹음 측정 특정 시냅스의 위치는 기록 과정에서 식별되지 않는다. 따라서 시냅스의 말단 사이트에 비해 근위부는 세포 외 자극 전극 또는 초점 글루타메이트 응용 프로그램과 지역의 자극뿐만 쉽게 평가 할 수 없습니다. 그러나, 쌍을 촬영하는 동안 각 신경 세포의 염료 충전은 축삭 아버 잠재적 인 시냅스 사이트의 형태 학적 재구성을 활성화 할 수 있습니다

LTP와 LTD는 신뢰성이 배양 시스템 (그림 3C)에서 CA3-CA3 시냅스에 유도하고, (시간이 이상) 전체 셀 녹음 기간 동안 소성의 두 형태의 마지막있다. 이용 LTP와 LTD 유도 패러다임 급성 슬라이스와 LTP와 LTD 전시 NM​​DAR 의존성, 연관성 및 경로의 독립, 문화 시스템의 따라서이 조합의 특성을 수행 것과 동일하다 페어링 된 기록은 시냅스를 검사 할 수있는 가치있는 모델 시스템을 제공 소성 7.

Polysynaptic 억제 이벤트가 자주 CA3 피라미드 세포 쌍 (그림 3D) 사이의 쌍 녹화에서 관찰된다. 이것은 매우 파괴적인 과잉 생산으로 우리는 약리학이 GABA 성 억제를 차단하지 않습니다. 그러나, 이들 polysynaptic 억제 이벤트 긴 지연으로 인해, 이들은 일반적으로 monosynaptic excitato의 측정을 방해하지 않는다스피 전류. polysynaptic 억제 이벤트 monosynaptic 전류의 피크를 가리는, monosynaptic 전류를 방해하는 것으로 관찰 된 경우,이 쌍은 분석에서 제외 될 필요가있다. Polysynaptic 흥분성 연결이 때때로 관찰하지만, 훨씬 적은 일반적이고 또한 분석에서 제외된다. 드물게 monosynaptic 억제 시냅스 전류는 시냅스 전 뉴런에 억제 interneuron 것으로 인해 얻을 수 없습니다. 이것은 쉽게 이상 (1 초) 전류 주입에 응답하여 활동 전위 발사의 숙박 시설의 부족에 의해 식별됩니다. 이것은 내부 용액 세슘 글루코 기반하는 시냅스 후 뉴런에서 가능하지 않다. 신경이 기록에 시각적으로 이전 식별 그러나, 우리의 경험에서이 <시간의 1 %를 발생합니다. 의 Organotypic 해마 조각 내에서의 interneurons 쉽게 특히 지층 radiatum 및 oriens에, 자신의 비 피라미드 세포 기관에 의해 시각적으로 식별됩니다. 따라서이 홍보eparation는 interneuron의 흥분성과 억제 전류의 녹음을 할 수 있습니다. 그러나, 매우 조금의 Organotypic 슬라이스의 억제에 대해 알려진 네트워크이며, 그들은 뇌 유사한 연결을 유지할 것인지 명확하지 않다.

해마의 Organotypic 슬라이스 문화의 그림 1 준비. (A)의 점선으로 윤곽 시츄 해마. 해마를 제거하려면 원개에 연결이 단절되고 해마 부드럽게 뇌 밖으로 굴렀다. (B) 해마가 여과지 위에 슬라이서의 무대에 위치한다. (C) 해마 조각은 넓은를 통해 전송됩니다 손상을 방지하기 위해 파스퇴르 피펫의 구멍. '좋은'대 '나쁜'조각 (D) 예.(E) 만화 막에 조각 설치의. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2는 해마 CA3 뉴런에서 전체 셀 녹음을 짝을 얻었다. 최적의 전극과의 연결 위치를 보여주는 한 쌍의 기록을 달성 순차 이미지를. (A) 현미경을 기록하는 최초의 전 세포를 얻은 후 x 축에 10-2백mm를 이동 축이되도록 설정된 기록 (화살표)가 모니터에 표시되는 영역의 가장자리에 위치한다. 스케일 바 :. 25 μm의 (B) 제 2 전극을위한 공간을 사용하려면, 현미경의 렌즈는 ACSF 여전히 접촉을 유지 보장, ~ 5~10mm를 발생렌즈. 이 렌즈를 통해 광 경로 바로 아래이지만 여전히 크게 설정된 기록 전극 위에까지 다른 기록 전극 범프하지 않는 제 2 전극을 보장하기 위해, 제 2 전극은 X 축으로 이동한다. (C) 설립 페어링 기록 보여주는 같은 초점면에서 양 전극 (화살표). 스케일 바 :. 우에서 EGFP-긍정적 인 뉴런을 나타내는 형질 전환 동물에 인접한 CA3 뉴런에서 25 μm의 (D) 한 쌍이 기록. 스케일 바 :. 20 μm의 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

CA3-CA3 피라미드 세포 들간의 그림 3 시냅스 전송 및 소성. (A) 페이지의 예이 CA3 피라미드 신경 세포간에 설정된 녹화에서 재 및 시냅스 흔적. 20 초 전류 펄스에 대한 응답으로 시냅스 활동 전위 발사를 유도하기 위해, 시냅스 AMPAR - 중재 전류 (-65 MV에 기록) 활동 전위에 직접 응답으로 발생 (B) 왼쪽 :. AMPAR - 매개 EPSCs의 진폭 변화 뿐만 아니라 쌍 간의 기록뿐만 아니라, 재판에 재판 페어링 기록 내에서. 각 시험은 0.1 Hz에서 측정 EPSC의 진폭을 나타냅니다. 이 예에서 AMPAR EPSC 진폭은> 60 pA의 5 pA의에서 변동. 오른쪽 : NMDAR EPSC 진폭은 10 μM C​​NQX의 존재에 40 MV에서 측정. NMDAR EPSC 진폭은 일반적으로 AMPAR EPSCs하지만 여전히 상당한 변동성을 보여 것을 진폭이 상당히 작다. CA3 피라미드 세포 사이의 쌍 녹화에서 10 ~ 20 pA의 사이에 일반적으로 평균 NMDAR EPSC 진폭, 오류가 쉽게 식별하고 (C) 왼쪽 :. CA3 피라미드 세포 쌍 한 쌍의 기록 기간 동안 지속 LTP를 표현한다. LTP는 AMPAR EPSCs의 진폭의 증가에 의해 용이하게 명백하다. AMPAR EPSC 진폭 중요한 재판에 재판 변화는 LTP의 유도 후 남아있다. 오른쪽 : CA3 피라미드 신경 세포 사이의 장기적인 우울증 (주)의 발현. AMPAR EPSC의 평균 진폭 및 시험 진폭 변동 재판에 동반 감소의 감소를 유의하십시오. monosynaptic AMPAR EPSC에 비해 더 긴 대기 시간에 발생하는 시냅스 polysynaptic 억제 전류의 (D) 예. 시냅스 후 뉴런 -65 MV에 클램프 전압이되면, 전류는 polysynaptic 시냅스 활동 전위의 피크 이후> 5 밀리의 지연 시간에 2 피크로서 볼 수있다. -30 MV에서 시냅스 후 뉴런을 잡고 polysynaptic 현재 인해 현재 방향의 반전에 억제하는 것을 확인합니다.es.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

표 짝을 기록하고 Organotypic 슬라이스 문화의 준비에 발생하는 1 잠재적 인 문제. 이 Organotypic 슬라이스 문화의 짝을 전체 셀 녹음으로 발생하는 일반적인 잠재적 인 문제를 나열합니다. 또한, 우리는 또한 대부분의 문제는 쉽게 시각화 및 수리 할 수​​있는 운동 중단과 관련된으로 상당한 시간이 쌍으로 녹음을위한 전기 생리학 설정을 '운전'소비 될 필요가 있다고 조언한다.

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