추적 아나스타시스, 세포 사멸을 취소 세포 생존 현상에 대한 전략

요약

아나스타시스라는 용어는 죽어가는 세포가 말기에 세포 자살 과정을 역전시키고 스스로 회복하여 궁극적으로 살아남는 현상을 말합니다. 여기에서는 아나스타시스를 겪는 세포를 검출하고 추적하기 위한 프로토콜을 보여줍니다.

초록

아나스타시스 ( "생활에 상승"에 대한 그리스어) 죽어가는 세포의 회복을 의미한다. 이들 세포의 회복 전에, 미토콘드리아 단편화, 세포질 내로 미토콘드리아 사이토 크롬 C의 방출, 카스파 제 활성화, 크로 마틴 응축, DNA 손상, 핵 분열, 세포막에 blebbing, 세포 수축, 세포 표면 노출을 포함한 세포 사멸 중요한 체크 포인트를 통과 한 포스파티딜 세린, 및 세포 사멸 기관의 형성. 세포 사멸 자극함으로써 죽어가는 세포가 사멸하고 잠재적으로 다른 죽음의 메커니즘을 취소 할 수 있도록, 죽음 이전에 제거 될 때 아나스타시스가 발생할 수 있습니다. 따라서, 아나스타시스는 부적절하게 손상된 세포를 유지할 수있는 생리적 치유 과정을 포함 나타납니다. 기능 및 메커니즘 아나스타시스 명백하게 건강한 세포의 복구 후에 과거 사건을 검출하기위한 제한된 도구에 의해 부분적으로 방해, 여전히 불분명하다. 전략 anasta를 검출SIS는 아나스타시스를 변조 생리 메커니즘 연구, 질병 병리 언데드 세포의 유해성과 잠재적 인 치료제를 가능하게 할 것이다. 여기서 우리는 살아있는 세포 현미경 및 포유 동물 세포에 아나스타시스를 식별하고 추적하기위한 포유 동물 카스파 바이오 센서를 사용하여 효과적인 전략을 설명합니다.

서론

세포 사멸 ( "죽음에 떨어지는"에 대한 그리스어)는 일반적으로 세포 자살 ^1-7로 끝나는 단방향 프로세스로 간주됩니다. 이미 세포 사멸 경로의 ^8,9을 시작했다 세포를 포함, 그렇지 않으면 전체 동물에 죽을 것 여분의 세포의 생존에 프로 죽음 유전자 결과의 유전 중단. 마찬가지로, 유전자 조작 인위적으로 표시 신호를 "날 먹고"또는 자신의 세포 외 기질 접착 성을 잃게 건강한 포유 동물 세포는 모든 세포의 식균 작용 또는 entosis 각각 ^{10, 11에} 의해 죽음을 탈출 할 수 있습니다. 그러나, 우리와 다른 사람들은 또한 세포 사멸 ^12-15의 초기 단계에서 복구 할 수 있습니다 유전자 조작 정상적인 건강한 포유 동물 세포 및 세포 선없이 것을 보여 주었다. 세포는 전형적인 중요 체크 포인트를 통과 한 후 각각의 세포를 추적 할 수있는 도구를 사용하여, 우리는 또한, 세포 사멸 ^{(12, 13)의} 후반 단계에서 복구를 증명하고있다해동 ^2-6 "니나"를 표시합니다. 최종 단계의 세포 사멸이 체크 포인트는 미토콘드리아 시토크롬 C의 릴리스, 카스파의 활성화, 핵 분열 및 세포 사멸 기관의 형성을 포함한다. 우리는 세포 사멸 ^2-6의 위기에....

프로토콜

라이브 세포 이미징을위한 세포의 1. 준비

1. 형태 학적 변화의 검출을 용이하게하기 위해, 예컨대 HeLa 세포 (인간 자궁 경부암)보다 세포막 및 세포 내 소기관의 변형을 시각화하는 기판 상에 편평 세포와 같은 부착 세포를 선택한다.
   참고 : 세포 사멸의 반전은 기본 마우스 간 세포, 기본 마우스 대 식세포, 차 쥐의 심근 세포 등 다양한 포유 동물 세포 ^{12, 13,} 관찰하고, 또한 인간 배아 신장 HEK-293T 세포, 아프리카 녹색 원숭이 신장 상피 COS와 같은 라인 셀되었습니다 -7 세포, 마우스 심근 HL-1 세포는 마우스 NIH 3T3 섬유 아세포, 색출 뇌 CRL1656 세포, 인간의 피부 암 A375 세포, 인간 고환암 CRL1973 세포, 인간 소세포 암종 H446 세포, 인간 간암 (Mustela는 푸로을 putoris) 인 HepG2 세포, 인간 유방암 MCF7 세포, 인간 전립선 암 PC3 세포, 및 인간 신경 아세포종 SH-SY5Y 세포.
2. 청소 및 살균 무수 에탄올과 유리 바닥 세포 배양 접시의 사전 세척 커버 글라스.
   주 1 : 유리 바닥 요리를 사용하는 높은 품질의 차동 간섭 대비 (DIC) 현미경, 높은 배율 공 촛점 또는 에피 형광 현미경 (토론 참조)을 권장합니....

결과

세포 사멸의 반전을 연구하기 위해, 조직 배양 세포를 처음으로 세포 사멸을 유발하는 죽음의 자극에 노출되어있다. 세포가 세포 사멸의 특징을 표시 할 때, 신선한 배양액 후 자극을 씻어 후 복구 (그림 1A)를 허용하도록 죽어가는 세포를 배양 적용됩니다. 여기서 다루고있는 핵심 문제는 개별 죽어 배양 된 세포가 세포 사멸을 향해 진행 여전히 아나스타시스을받을 수있는 방법까지입니다. 이 질문은 명확하게 설명 된 방법을 이용하여 세포의 운명을 추적 할 수있는 바이오 마커 연속 모니터링함으로써 응답 할 수있다.

우리는 먼저 동안 추적에 필요한 시간 경과 생균 현미경을 사용 전에 개별 세포의 반응을 기록함으로써, 조직 배양 세포에서 아폽토시스의 역전을 검출하도록 우리의 전략을 설명하고 아폽토시스 자극 ^{(12, 13)에} 노출 된 후. 여기에 장착 된 기판에 확산 건강 부착 세포 (그림 1Bi) ^{12, 13,} 그리고 사.......

토론

아나스타시스는 세포 사멸 경로를 활성화 한 세포가 계속해서 죽어가는 과정을 역 생존 현상을 의미한다. 여기서는 생균 촬상 사실 동일인 셀 늦은 단계에서 아폽토시스 세포 사멸의 과정을 역으로 한 후 생존 및 재생을 계속할 수 있음을 확인하기 위해 사용될 수 있다는 것을 증명하고있다. 우리 프로토콜은 아폽토시스를 유도 및 확인을위한 여러 가지 바이오 마커와 세포 사멸의 모니터링 반전 겪는 세포의 큰 비율을 허용하도록 최적화 여러 세포 유형 특정 처리 조건을 설명한다. 기술적 인 문제에 관해서는, 유리 바닥 요리 때문에 높은 배율에서 높은 품질의 촛점 또는 에피 형광 현미경을위한 긴 작동 거리를 수있는 세포와 현미경 목적의 투명성이 높은 얇은 유리,의, 영상 ^{(12, 13)에} 대한 배양 세포를 사용 하였다, 미토콘드리아의 분열을 포함하여 고전적인 세포 사멸의 관찰을 용이하게사이토 크롬 c 및 핵 응축과 분열의 릴리스. 유리는 또한 아폽토시스 동안 막에 blebbing, 세포의 세포 수축 및 세포 .......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
LSM780 컨포칼 현미경 Carl	Zeiss
유리 바닥 배양 접시	MatTek Corporation	P35G-0-14-C
투명 CultFoi	Carl Zeiss	000000-1116-084
CO2 독립 매체	Life Technologies	18045-088
CellTracker	Life Technologies	C34552
Mitotracker Red CMXRos	Life Technologies	M-7512
Hoechst 33342	Life Technologies	H1399
형광 표지 아넥신 V	Biovision	K201