방법 논문

차 세포 배양 연구 병아리 망막에 효율적인 유전자 전송 : 전 비켜 Electroporation에 접근

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DOI:

10.3791/52002

⸱

2015년 11월 2일

 ,  , 
1Wilmer Eye Institute, The Johns Hopkins University School of Medicine

이 논문에서

요약

배아 병아리 망막 세포 배양은 광 수용체 생물학의 연구에 유용한 도구를 구성한다. 우리는 이전에 배양 망막의 플라스미드 일렉트로 오보 EX에 기초한 효율적인 유전자 전달 기술을 개발했다. 이 기술은 상당히이 시스템에 대한 가능한 유전자 조작을하고, 현재 사용 가능한 프로토콜을 통해 형질 전환 효율을 증가시킨다.

초록

배아 병아리 망막에서 파생 된 콘 광 수용체가 풍부한 문화 망막 신경 세포, 특히 광 수용체의 생물학을 공부하는 전세계 연구자를위한 필수적인 도구가되었다. 그들은 쉽게 약물 개발을위한 높은 처리량의 기술에 적용 할 수 있으므로이 시스템의 응용 프로그램은 기초​​ 연구를 넘어. 그러나 이러한 문화 망막 광 수용체의 유전자 조작은 시스템의 유용성에 중요한 제한 포즈, 매우 어려운 것으로 입증되었습니다. 우리는 최근에 개발 및 기타 현재 사용 가능한 프로토콜 (1)에 비해 5 배 이러한 문화 망막 세포의 형질 전환의 속도를 증가 플라스미드 전기 기술 비켜 전을 검증했다. 이 방법에서 병아리 배아 눈 RPE를 제거하고, 스테이지 (27)에서 적출하고, 망막 컵 플라스미드 - 함유 용액에 배치되어 쉽게 구성된 고객이나 전기 천공을 사용하여만든 전극. 망막은 해리 배양 표준 절차를 사용하고 있습니다. 이 기술은 일반적으로 감광체 인구의 25 %의 유전자 발현을 달성 플라스미드 기반의 RNAi 기술의 사용을 통해, 예를 들면, 과발현 연구뿐만 아니라 유전자 발현의 하향 조절에 적용될 수있다. 본 공보의 비디오 포맷은 망막 일차 배양에서의 유전자 기능 연구를 가능 분야의 연구자에이 기술이 용이하게 접근 할 수 있도록한다. 우리는 또한 성공적인 결과 및 재현성이 절차의 중요한 단계에 대한 자세한 설명을 포함하고있다.

서론

배아 병아리 망막에서 해리 된 세포 배양 널리 생존 2-9, 차별화 10-12, 신경 돌기의 파생물 (13) 등을 포함한 광 수용체 세포 생물학의 다양한 측면을 연구하는 데 사용되었다. 루벤 애들러와 공동 작업자에 의해 1980 년대에 개발하고 자신과 다른 그룹 (14-20)에 의해 완성이 시스템의 장점은, 동물 모델 (21)와 여자의 고유 특성에 있습니다. 심지어 배아 단계에서 병아리 눈의 큰 크기는, 문화에 대한 자료의 많은 양을 제공한다. 배아는 배양 일 (ED) 5 이용하여 수행 될 때 더욱이, - 6 망막, 55 -이 동물 감광체의 약 86 %이기 때문에 그들의 선조 세포의 80 %가 감광체 14,15,18,22,23으로 구별하고, 콘 (24)은,이 배양 물이 세포 유형에 집중 연구에 특히 적합하다.

우리는 최근 develo의이PED는 ​​따라서 유전 missexpression 연구 1 촉진함으로써이 시스템의 유용성을 넓히고,이 배양 물에서 세포의 고효율 플라스미드 형질 감염을 허용하는 간단한 기술을 특징으로한다. 이 기술의 개발은 세포 자율 방식으로 유전자 기능 연구를 허용하도록 형질의 허용 가능한 수준을 제공 할 방법 과학 문헌에서 보이드로부터 비롯. 일차 배양 신경 세포를 형질 25,26 악명 하드 때문 부분이다. 이 목적을 위해 이전에 사용 가능한 가장 일반적으로 사용되는 기술 중 일부는 3-5 % 정도의 효율을 야기하고 상당한 독성을 발휘 27-32 예컨대 리포 펙션, 칼슘 포스페이트 - 매개 된 형질 전환과 같은 화학적 형질 전환 방법을 포함. 효소 리포터 플라스미드 시스템의 사용은 신호를 증폭하여 불량한 형질 감염 효율의 문제를 피할 수있다하더라도, 그들은하지셀 고유의 효과를 판별하고, 그 결과 전체를 대표하지 않을 작은 세포군에 기초한다. 병아리에서 널리 사용되는 또 다른 방법은, RCA 단자 바이러스 감염은 세포 증식에만 적용이 망막 일차 배양 시스템 (33), 따라서 적합하지 않다.

현재 프로토콜에서 배아 병아리 눈 단계 27 (ED 5), 망막 색소 상피 (RPE)를 제거하고, 망막 컵이 플라스미드를 함유 용액으로 가득 전기 챔버에 배치에서 적출 및 사용하여 전기 천공되는 주문 제작 표준 기술 (21)을 이용하여 망막 해리와 문화를 이어 전극. 이 절차를 최적화 한 결과의 생존과 분화 특성을 손상시키지 않고 지속적으로 배양 세포 단독 감광체 인구 내의 25 %의 총 수의 22 % 정도의 형질 전환 효율을 달성 할 수 있었다문화 1. 여기에서 우리는이 기술의 성공과 재현성을 보장하기 위해이 절차의 모든 중요한 단계를 요약 한 상세한 프로토콜을 제공합니다.

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프로토콜

이 작품에 설명 된 모든 절차는 존스 홉킨스 대학에서 동물 관리 및 사용위원회에서 권장하는 지침에 따라 수행 하였다.

미리 1 :기구, 시약 및 요리의 준비

  1. 계란의 준비 : 계란 배양기에서 5 일간 37.5 ℃, 상대 습도 60 %에서 수정 된 백색 레그혼 닭 알을 품어.
    참고 : 표준화 및 배아 발달을 동기화 도움이 될 수있는 능력을 흔들하지만, 락과 보육이 프로토콜의 결과에 대해 엄격하게 할 필요가 없습니다.
  2. 플라스미드 준비 :
    1. 필요에 따라 설계 플라스미드 (1,34의 RNAi 기술을 사용하여 예를 들어) 유전자 과발현 또는 하향 조절을 위해 구축. 가능한 한 구조에서 리포터 유전자 (예 : EGFP, RFP 또는 LacZ를 등)를 포함한다.
      참고 : 같은 거대 세포 바이러스와 같은 일부 일반적으로 사용되는 프로모터는, 시간이 지나면 침묵이 될 수 있습니다. CAG의 PROMOT어 (닭 베타 - 액틴 CMV 인핸서와 프로모터) 관심 35-37의 유전자를 효율적으로 장기 식을 제공하는 아주 좋은 대안이다.
    2. 멸균 PBS 1.5 μg의 / μL의 농도에서 플라스미드 솔루션을 준비합니다. 옵션 : 시간 ​​앞서 플라스미드 솔루션을 준비하고 냉동 사용할 준비가 될 때까지 저장할 수 있습니다.
      주 : 높은 플라스미드 농도를 사용하는 반면 낮은 농도는 플라스미드 트랜 스펙 션 효율을 낮추는 1, 효율의 현저한 증가를 초래하지 않는다.
  3. 전극 :
    1. 양극 사용을 위해 두꺼운 금 (특정 재료 / 장비의 표 참조) 전극을 냈습니다. 70 % 에탄올로 닦아.
      주 : 금 절연 노출 약 0.5 mm를두고 전극 스쳐, 전류의 누출을 최소화하는 것이 바람직하다. 절연 재료에 대한 정보는 특정 재료의 표에서 찾아 볼 수있다.
    2. 2.5 mm의 정사각형 B에서 음극을 확인(일반적으로 마이크로 피펫 끌어 당기는에서 사용) 4.5 mm 폭 황소 필라멘트. 집게의 도움으로, 사각형 상자를 취소하고 긴 스트립에 필라멘트를 펴. 그 후, 해부 현미경 및 가이드로자를 사용 하에서, 기지 3mm 긴 사각형 'U'자형으로 필라멘트를 구부리고 반대편 필라멘트의 나머지 길이 (도 1, 일측 2mm 높은 , C - D). 집게를 사용하여 96 %의 에탄올과 불꽃의 전극 소독 찍어. 그런 다음 전극의 긴 팔에 작은 악어 클립으로 전기 리드를 연결합니다.
  4. 전기 상공 회의소 설정 :
    1. 100mm 페트리 접시 사용하여 테이프 (그림 1E)에, 아래로, 평평한면을 멸균 1.5 ML의 microcentrifuge 관의 뚜껑을 절단 부착하여 전기 챔버를 준비합니다.
      참고 : 일하는 것이 비슷한 크기의 잘의 형태로 다른 컨테이너; 그러나 microcentrifuge 관 덮개는 쉽게 접근하고 멸균한다. 잘플라스미드 솔루션의 낭비가 발생하는 등의 병아리의 눈과 음극 전극을 수용 할 정도로 큰,하지만 너무 큰되지해야합니다.

2. 예 비켜 Electroporation에 절차

  1. 악기의 제조 :
    1. 마이크로 해부 도구를 소독을 찍기로 (달걀 껍질을 열고 배아, 망막 색소 상피를 제거 뒤몽 핀셋을 꽂아 미세 팁 2 쌍을 떠서위한 큰 곡선 몰 로니 집게 2 쌍을 본 한 쌍은 제거 렌즈와 유리체 위해 집게를 톱니) 96 % 에탄올과 불타는에 팁. 70 % 에탄올에 담근 잎사귀를 사용하여 청소 해부 범위. 37 ° C의 물을 욕조에 멸균 칼슘 마그네슘 무료 행크의 균형 소금 솔루션 (CMF-HBSS)의 병을 따뜻하게. 따뜻한 CMF-HBSS 전체 3/4에 100mm 멸균 배양 접시를 채우십시오.
    2. 다른 깨끗한 해부 현미경으로 전기 챔버를 놓고 플라스미드 솔루션의 120 μL로 입력합니다. , 전기 장치에 전극을 연결하고반드시 맞춤형 전극을 음극에 연결하고 금은 양극에 전극을 밀고있다.
  2. 배아 컬렉션 :
    1. 70 % 에탄올에 젖은 잎사귀와 껍질을 닦아 계란을 청소합니다. 문화에 오염을 운반 방지하기 위해 프로토콜의 나머지 부분에 걸쳐 멸균 절차를 유지한다. 큰 곡선 몰 로니의 집게를 사용하여 조심스럽게 부드럽게 (공기 실 이상) 달걀의 둥근 끝을 두드리고 다음 그립과 쉘 부분을 잡아 당겨 달걀 껍질에 구멍을 엽니 다.
    2. 집게의 또 다른 한 쌍은 세포막을 제거하고 달걀에서 그것을 떠서하여 배아를 수집로 (조심 배아를 손상하지 말 것). CMF-HBSS와 함께 접시에 넣습니다.
      주 : 2.4.4에 규정 된 전기에 대한 망막 컵의 수를 얻기 위해 필요한만큼 모아서 배아
    3. 중요한 단계 : 햄버거와 해밀턴 (38)에 따라 배아를 스테이지.
      참고 : 최적의 효율 배아를 얻으려면단계 27 (그림 2A)에 있어야합니다.
    4. 몰 로니의 집게를 사용 잘린 배아를 안락사.
  3. 망막 컵을 가져 오기 :
    1. 미세 뒤몽 핀셋을 사용하여 조심스럽게 눈을 명백히하다 새로운 CMF-HBSS 접시에 전송할 수 있습니다.
    2. 시신경 유두에 가까운 각각의 눈의 후방 부분에서 시작, 2 개의 미세 뒤몽 핀셋을 사용하여, 신경에 손상을주지에 RPE는 신중 해부 신경 망막과 망막 색소 상피 조심스럽게 사이에 핀셋의 각 쌍 중 하나 팁을 소개합니다 망막 (그림 2B).
      참고 : RPE 도움이 될 것 용액에서 칼슘과 마그네슘 2+의 부족은 더 쉽게 신경 망막에서 분리합니다.
  4. 전기 :
    1. 15 볼트, 50 밀리 초 지속 시간 950 밀리 초 간격의 5 제곱 펄스를 제공하기 위해 electroporator의 매개 변수를 설정합니다. 장소 'U'는 전기 챔버 (마이크로 원심 뚜껑 채우기 내부에 음극 모양플라스미드 함유 용액 120 μL)와 ED.
    2. 사용 만곡 듀 핀셋 (아닌 떠서 누름) 일렉트로 포 레이션 챔버 한 망막 컵을 전송하고, 상기 전극의 아래쪽 및 위쪽으로 향하게 렌즈쪽으로 망막의 후방 부와, 'U'형상의 전극 내부에서 배치 ( 그림 2D).
    3. 그 다음 렌즈로, 눈의 앞쪽 부분을 터치하고 electroporator의 발 페달이 전기 펄스를 제공하는 사용하도록 양극을 놓습니다.
    4. CMF-HBSS로 새로운 배양 접시에 전기 천공 망막 컵을 전송하고 나머지 망막 컵의 각각 전기의 절차를 반복합니다.
      주 : 6 망막 컵까지는 형질 전환 효율이 크게 감소하지 않고 동일한 플라스미드 용액으로 전기 천공 할 수있다.
    5. 본의 톱니 포셉으로 그들을 그립 부드럽게 T를 통해 당겨 각 일렉트로 망막 컵의 렌즈와 유리체를 제거곡선 뒤몽 핀셋의 다시 제자리에 눈을 유지하면서 그는 개방 학생.
    6. 표준 절차에 따라 일렉트릭 망막 세포의 분리 및 배양을 진행합니다.
      참고 : 병아리 망막 세포의 분리 및 문화에 대한 자세한 프로토콜의 벌 가라과 칸토 - 솔러, 2012 년 추가 파일 4 (21)을 참조하십시오이 프로토콜에서 세포가 폴리 오르니 틴 코팅 6 웰 플레이트 또는 35 낮은 밀도에서 씨앗을 품고있다. -mm 요리 (6 × 10 5 세포 / 35mm 직경의 우물 또는 접시). 사용 된 배지는 페니실린 / 글루타민, 10 % 소 태아 혈청 (FCS), 100 μg의 / ㎖에서 리놀산-BSA (199)와 매체이다. 문화는 5 % CO 2와 가습 37 ° C 배양기에서 유지된다. 이 과정을 사용하여 - 5 6 × 106 세포는 일반적으로 각 단계마다 27 일렉트로 눈을 얻을 수있다.
      참고 : 이상적으로, 더 이상 3 시간이 배아 수집 및 세포 도금 사이를 통과한다, 좋은 세포 생존을 보장하기 위해스트레스를 최소화 할 수 있습니다. 관찰과 추가 분석을 위해 일반적인 타이밍이 시점에서 세포가 좋은 형태 학적 및 분자 차별화를 달성 생존이 여전히 높기 때문에, 문화 4 일 후에입니다.

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결과

여기에서 우리는 다음 해리 세포 배양을위한 탈핵 병아리 망막 컵에 플라스미드 형질에 대한 간단한 프로토콜을 제시한다. 형질 사용자 정의 전극 (- 2 그림 1)을 쉽게 만들 수 사용 전기에 의해 달성된다. 이 프로토콜에 기재된 파라미터는 20 % 내지 27 (도 3d) (22 %의 평균) 레인지에 형질 전환 효율을 얻기 위해 최적화되었다. 위에서 언급 한 이유로, 이러한 결과는 문화 4 일 후에 정량화, 알 수 있습니다. 이러한 맥락에서, 형질 전환 효율은 전체 세포 집단 내에서 유전자를 발현하는 세포의 백분율을 말한다. 만 감광체 인구가 고려되는 경우, 형질 전환 효율은 25 %의 평균 (도 3d)으로 증가한다. 이러한 유형의 배양 물은 주로 감광체를 연구하는 데 사용되기 때문에, 이것은 중요한 특징이다.

electroporat 된 세포 배양 이 기술을 사용 에드 DIC 조명, 세포 ...

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토론

이 프로토콜의 성공을위한 가장 중요한 단계는 배아의 적절한 단계를 선택하는 것입니다. 이전의 출판물에서, 배아 단계의 범위는 일반적으로 배양 또는 배아 일의 일 (ED)에 의해 정의 된, 이러한 문화에 대한 주어진다; 따라서 보통 ED 6 배아 ED 5를 사용하여 동등한 결과를 얻을 수 있다고 가정한다. 그러나 우리는 전술 한 바와 같이 단계 (27) (ED 5)에 형질 전환 효율, 전체 세포 인구의 약 22 %가 될 것입니다 것으로 나타났습니다; 아직 효율이 단계를 단계 29에서 28 배아 (ED 5.5) 및 12 % (ED 6)을 사용하는 경우 16 %로 감소 1.합니다 다른 중요한 단계는 공정 전반에 걸쳐 무균 조건을 유지 포함한다; 필요한 손재주를 획득하는 해부 및 전기 중 망막의 손상을 방지하기 위해; 세포 도금 시간 배아 컬렉션으로부터 긴 시간 간격을 피.

또 다른 중요한 고려 사항은 좋은 형질 efficien을 보장하기 위해CIES는 플라스미드...

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공개 사항

저자는 경쟁하는 재정적 이해관계나 기타 이해 상충이 없음을 선언합니다.

감사의 글

데이터 분석에 도움을 준 David O'Brien과 비판적인 토론을 해준 Canto-Soler 연구실의 모든 구성원에게 감사드립니다. 이 작업은 MVCS(NIH 보조금 EY004859 및 EY022631), Core Grant EY1765 및 Research to Prevent Blindness, Inc.의 무제한 부서 보조금의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
ECM 830 Electro Square PoratorBTX/ Harvard Apparatus45-0052
Genetrode, L-shaped, 5mm Gold TipBTX/ Harvard Apparatus45-0115 모델 512양극으로 사용되는 Gold tipped electrode
Polyimide TubingVention Medical맞춤형내경: 0.5mm/벽 두께: 0.15 - 0.2mm. 금 팁 전극
을 절연하는 데 사용됩니다.2.5mm 정사각형 상자 필라멘트, 4.5mm 너비Sutter Instrument CompanyFB245B음극 전극
HBSS, 칼슘 없음, 마그네슘 없음, 페놀 레드Gibco 없음 - Life Technologies14175-095
Moloney 집게RobozRS-8254톱니; 약간의 곡선; 4.5" 길이
Dumont 핀셋 5/45RobozRS-5058패턴 #5, 45도 각도; .10 x .06mm 팁 크기; 109mm 길이
Bonn 마이크로 펜셉, 1x2 이빨RobozRS-5172타이잉 플랫폼; 1x2 이빨, 0.12 mm 이빨; 3.75" 길이; 0.3 mm 팁 너비

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