방법 논문

단일 사용 공압 생물 반응기 시스템을 사용하여 포유 동물 세포의 배양

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DOI:

10.3791/52008

⸱

2014년 10월 10일

 ,  ,  ,  , 
1Center for Biotechnology Education, Johns Hopkins University, 2PBS Biotech, Inc.

이 논문에서

요약

공압 바이오리액터를 사용하여 포유류 세포의 성장을 위한 이 일회용 바이오리액터 시스템의 조립, 작동 및 성능을 시연합니다.

초록

최근 포유류, 곤충 및 줄기세포 배양 및 규모 확장의 발전은 새로운 치료법과 맞춤형 의학 혁신을 위한 엄청난 기회를 창출했습니다. 그러나 이러한 발전을 치료 응용 분야로 전환하려면 견고하고 유연하며 비용 효율적인 생물 반응기 시스템을 허용하는 체외 시스템이 필요합니다. 현재 연구 및 상업 환경에서 활용되는 여러 생물 반응기 시스템이 있습니다. 그러나 이러한 시스템 중 다수는 다양한 세포 유형의 성장을 설정, 확장 및 모니터링하는 데 최적이 아닙니다. 이러한 시스템에서 제어하기 가장 어려운 배양 파라미터에는 유체역학적 전단 최소화, 영양염 구배 형성 방지, 균일한 배양 배지 폭기 설정, 미생물 오염 방지, 실시간 배양 조건 모니터링 및 조정이 포함됩니다. 공압식 일회용 바이오리액터 시스템을 사용하여 마이크로 캐리어에서 성장한 포유류 세포를 위한 이 새로운 바이오리액터의 조립 및 작동을 시연합니다. 이 바이오리액터 시스템은 유체역학적 전단 및 영양염 구배 형성을 최소화하고 균일한 배양 배지 폭기를 허용함으로써 현재 사용 가능한 시스템과 관련된 많은 문제를 제거합니다. 또한 바이오리액터의 소프트웨어를 사용하면 바이오리액터 실행 매개변수를 원격으로 실시간으로 모니터링하고 조정할 수 있습니다. 이 바이오리액터 시스템은 또한 다양한 치료용 단백질, 단클론 항체, 줄기 세포, 바이오시밀러 및 백신의 생산을 위해 부착 및 현탁 포유류 세포를 확장할 수 있는 엄청난 잠재력을 가지고 있습니다.

서론

현탁액에서 성장 세포 응집체로서 세포 성장 및 세포 기질에 고정 성장 : 포유류 세포 선은 그들의 성장 특성에 따라 세 개의 카테고리 중 하나로 분류 될 수있다. 이 비디오에서 보여준 공기 륜 생물 반응기는 세포의 세 가지 유형을 성장할 수 있지만,이 비디오는 마이크로 캐리어에 고정 장치 의존 세포를 성장하는 생물 반응기의 사용을 설명합니다. 세포 자체 산물 - 앵커리지 종속 포유류 세포보다 세포를 생산하기위한 목적으로 성장시킬 수있다. 예를 들어, 인간의 골수 유래 중간 엽 줄기 세포는 현재 세포를 수확하고 병든 조직으로 이들을 주입 목적으로 재배되고있다. 이 동영상에서 입증 공압 생물 반응기가이 애플리케이션에 대한 이러한 중간 엽 줄기 세포의 제조에 적합한 입증되었다 (세라 외., 개인 통신, 2013).

앵커리지 출발endent 포유 동물 세포는 일반적으로 그들이 특별하게 취급 성장 표면에 부착 한 세포 배양 접시, 세포 배양 플라스크, 또는 롤러 병으로 2D 배양 용기에서 작은 규모의 성장하고 있습니다. 이상의 셀이 요구되는 경우, 플레이트 또는 플라스크 개 이상의 용기를 사용하여 확장 될 수있다. 그러나,보다 비용 효율적인 앵커리지 의존적 세포의 대량 배양, 세포 부착을위한 표면적을 증가시키기 위해 마이크로 - 고체 담체라는 작은 비드를 사용하여 수행 할 수있다. 세포의 부착 특성에 따라, 마이크로 캐리어의 여러 다른 유형의 코팅 된 덱스 트란과 같은, 펩타이드, 콜라겐과 같은 시판 중이다. 마이크로 캐리어는 세포 성장을위한 큰 표면적을 제공 부피비 큰 표면적을 갖고; 및 마이크로 캐리어 세포 바이오 리액터 시스템이 높은 밀도로 배양 할 수 교반과 현탁액에서 유지 될 수있다. biorea의 현재 형식부착 세포는 마이크로 캐리어에 성장 ctors 셀 코팅 마이크로 캐리어들의 현탁액을 유지하기 위해 축 방향 임펠러를 사용하여 스피너 플라스크 및 교반되는 탱크 시스템을 포함한다.

여러 가지 요인 산소 장력, 전단 응력, 표면 행렬, 영양소 및 대사 산물 농도를 포함한 세포의 배양에 성공에 중요하다. 생물 반응기의 사용은 실시간 성장 조건의 모니터링 및 상당히 낮은 생산 비용 1 전위 허용한다. 를 포함하여 체외 세포 배양, 교반 서스펜션, 회전 벽 용기, 중공 섬유, 로커 플랫폼에서 가방 생물 반응기, 유동층 시스템 3에 대한 몇 가지 일반적인 생물 반응기 설계가 있습니다. 이들 시스템의 대부분은 높은 비용, 영양소 농도 기울기, 유체 역학적 전단력, 세포 응집 어려움 샘플링에서, 모니터링 및 제어 CEL 같이, 세포 배양을 위해 고유의 문제를 제시하고 - 최대 스케일리터 규모입니다.

다양한 점착성 세포주 바이러스 백신의 제조 또는 유전자 치료 응용을위한 바이러스 벡터의 제조 중, 바이러스의 생산에 사용된다. 이 비디오에서는, 단일 사용 공기 (에어 휠) 생물 반응기 시스템을 사용하여, 우리는 인간의 폐암 세포 (A549) 콜리 틱 아데노 바이러스의 생산을위한 마이크로 캐리어에 세포의 문화를 보여줍니다. 공압 생물 반응기 설계는 생물 반응기의 바닥으로 살포 기체의 부력에 의해 구동되는 수직 교반 휠을 사용한다. 이 부드러운 교반 방법은 유체 ​​역학적 전단력을 제한하지만 여전히 최적 배지 및 세포가 4를 혼합 보장한다. 교반 탱크 반응기에 비해, 공기 반응기 심지어 대용량 에어 휠 바이오 리액터 시스템 (도 1)와 낮은 벽 전단 응력을 갖는다. 교반 탱크 생물 반응기는 대조적으로,이 단일 사용 반응기의 수직 임펠러는 기포의 스트림 내에서 켜져부드럽고 균일 한 매체의 혼합 (그림 2)을 허용 용기.

프로토콜

1 로그인

  1. 생물 반응기를 전원을 켭니다. 로그인 페이지를 열려면 아무 곳이나 클릭합니다. 사용자 이름을 선택하고 암호를 입력하고 "로그인"을 클릭합니다.

2 교정

  1. pH 센서 (이전 고압 증기 멸균에 2 점)를 보정합니다.
  2. pH 센서를 점검하고 센서 팁 전해질 용액으로 가득합니다 확인합니다. pH 보정 솔루션 (전해질)의 pH 4, pH가 7 두 개의 비커를 준비하고 증류수로 사용할 수있는 세척​​ 병이있다.
  3. pH 센서하여 pH 케이블을 연결합니다. 안녕하세요 인터페이스에서 "작업"탭으로 이동하여 "교정"을 클릭합니다. 교정 솔루션 온도 필드에 버퍼 온도를 입력합니다.
  4. 버퍼 1 (산도 4)에서 pH 센서를 삽입하고 "제로"필드에 값을 입력합니다. 안정 그래프 기다린 "교정 1"버튼을 클릭합니다. 증류수 pH 센서를 헹군다.
  5. 버퍼에 넣어 센서 2 (산도 7). 버퍼를 입력"범위"필드에이 값입니다. 안정이 버튼을 보정 클릭 그래프 기다립니다.
  6. "저장"다음 "닫기"를 클릭합니다.
  7. 용존 산소 (DO) 센서를 보정합니다.
  8. DO 센서를 확인하는 몇 시간 동안 시스템에 연결 됨으로써 편광되었다. 안녕하세요 인터페이스에서 "작업"탭으로 이동하고 교정을 클릭합니다. "금지"버튼을 클릭합니다.
  9. DO 센서를 분리하고 "제로"필드에 0을 입력합니다. 안정 "교정 1"버튼을 클릭하여 그래프를 기다립니다.
  10. DO 센서를 다시 연결하고 "스팬"필드에 100을 입력합니다. 안정 "보정이"버튼을 클릭하여 그래프를 기다립니다.
  11. "저장"다음 "닫기"를 클릭합니다.

3 압력솥​​ 및 설치 센서 및 시약 용기

  1. autoc에서 보정, 위치 센서 및 열 아니라 후노예 파우치와 121 ° C, 15 PSI에서 30 분 동안 오토 클레이브.
  2. 70 % 이소 프로필 알코올 (IPA) 및 생물 안전 캐비닛에 전송 파우치 (BSC)와 오토 클레이브 파우치를 소독합니다. 용기의 외부 포장을 제거합니다.
  3. 70 % IPA와 내부 포장을 소독 및 생물 안전 캐비닛 (BSC)에 선박을 전송합니다. 내부 포장을 제거하고 운송 중에 입은 피해에 대한 용기와 튜브를 검사합니다.
  4. pH를 설치하고 두 개의 전면 포트에 센서를 않습니다. 다시 왼쪽 포트에 열을 잘 설치합니다. 센서 캡을 엽니 다.
  5. 센서 포트를 통해 상기 센서 가이드. 포트에 단단히 센서를 끼 웁니다.
  6. BSC에서 선박을 전송합니다.
  7. 선박 슬리브 외부 DO 및 pH 센서 케이블을 끊고 아무것도 슬리브 없음을 확인합니다. 첫째, 소매에 발을 선박을 밀어 넣습니다.
  8. 조심스럽게 용기 열 잘에 온도 센서를 장착한다. 용기의 바닥은 히터에 맞춰져 있는지 확인합니다.
  9. 제거튜브는 자신의 가방에서 설정합니다. 생물 반응기 제어 장치의 해당 커넥터와 펌프로 튜브에 일치 색상 코드.
  10. 그 가스 배출구에 커넥터를 눌러 메인 가스 라인을 설치한다. 가스 배출구에 커넥터를 시계 방향으로 꼬아 서, 마이크로 가스 라인을 설치한다. 배기 필터 튜브를 설치합니다 :
  11. 필터 오븐을 엽니 다. 그 튜브 필터와 오븐이 고리를 통과하도록 U-채널의 배기 필터를 고정합니다.
  12. 튜브 홀더에 콘덴서 가방에 의해 튜브를 설치합니다. 문을 닫습니다.
  13. 다음 생물 반응기 제어부 행 부가 선 및 B 모두의 미디어 라인, 및 DO 센서 뒤에 벤치 위에 수확 라인.
  14. DO 및 pH를 센서에 케이블을 연결합니다.

(4) 추가 중간 및 마이크로 캐리어

  1. "작업"탭으로 이동을 클릭 컴퓨터 인터페이스의 "제어 펌프".
  2. 스 테리 양식미사용 매체 첨가 라인 (오렌지 1 대역) 및 튜브 용접 또는 루어 피팅을 사용하여 배지 병 / 가방 소스와 르 연결.
  3. 의 미디어 펌프를 켜 슬라이더를 클릭합니다. 미디어 매체의 또한 원하는 금액으로 꺼 펌프 설정하는 슬라이더를 클릭합니다.
  4. 실온에서 3 시간 동안, 칼슘 Mg를 2 + 무료 PBS를 마이크로 캐리어 비즈를 놓습니다.
  5. 워시는 칼슘, 마그네슘 2 + 무료 PBS로 여러 번 구슬.
  6. 115 ° C, 15 PSI에서 15 분간 고압 증기 멸균한다.
    참고 :이 실험에 3g의 /의 L (건조 중량)를 추가합니다.
  7. 수화 및 세정 매체가 단계 4.1에 첨가 동일한 방식으로 반응기로 멸균 된 마이크로 캐리어에 펌프.

5 평형 및 원 포인트는 교정 DO

  1. 자동으로 컨트롤러를 설정하고 원하는 설정 값을 입력합니다. 여기에서, 교반 설정 값 (SP) = 15 RPM, 온도 SP를 = 사용 37.0 ° C, pH가 7.2 = 100 % 마십시오. 페이지 기다립니다arameters는 평형합니다.
  2. 센서를 확인하는 것은 완전히 편광이다. DO 현재 가치를 확인하는 안정.
  3. "작업"탭으로 이동하여 "교정"을 클릭합니다. "원 포인트"를 클릭 "DO"를 클릭합니다.
  4. "스팬"필드에 '백'을 입력합니다. 을 클릭 "저장"과 "주변"을 클릭 "교정 1"버튼을 클릭합니다 :

(6)는 실행을 시작

  1. 작업 탭으로 이동합니다. "일괄 처리"를 클릭하십시오. 배치 이름 16 자 이하를 입력하려면 화면 키보드 나 외장 키보드를 사용합니다.
  2. 온 스크린 키보드의 '숨기기'버튼을 클릭합니다. "배치 시작"오버레이의 "시작"을 클릭하여 확인을 클릭합니다.

7 세포에 접종

  1. 용접에 의해 사용되지 않는 중간 부가 라인 (1 오렌지 밴드) 사이의 연결 및 멸균 셀 병 / 가방 소스를 형성루어 피팅을 사용하여 튜브 또는.
  2. 펌프와 용기 사이의 튜브를 향해 화살표가 그래서 미디어 펌프 튜브의 실리콘 부분을 설치합니다.
  3. 튜브 클램프를 확인하는 것은 개방과 분기 튜브 클램프가 닫힙니다. 의 미디어 펌프를 켜고 셀을 추가 한 후 "Off"로 클릭 슬라이더를 클릭합니다.
  4. "작업"탭으로 이동하여 "제어 펌프"를 클릭합니다.

8 샘플링

  1. 자주 배양을 모니터링하고 필요에 따라 접종 후, 다음과 같은 방식으로 배양 물로부터 시료를 그린다
  2. "작업"탭으로 이동하여 "샘플을 채취"를 클릭합니다. 샘플링 펌프 샘플링 튜브를 삽입하고 화면의 지시에 따라 샘플링 꼭지를 조작 할 수 있습니다.
  3. 이러한 샘플에 적어도 매일 현미경 관찰 및 세포 수를 수행합니다.
  4. 셀이 C에서 원하는 농도에 도달했으면1.2 × 106 세포 / ml ASE, 바이러스 접종 물을 첨가하여 세포를 감염시킨다.
  5. 무균는 20 ㎖ 주사기로 접종을 추가하고, 반응기에 공급 부가 포트 중 하나에 연결 주사기. 주사기 플런저를 눌러 반응기로 접종을 소개합니다.
  6. 샘플링을 계속 아데노 바이러스 세포 내 입자 농도에 대한 문화를 분석.

결과

그림 3에서 생물 반응기 실행의 개시에 대한 매개 변수가 표시됩니다. 이 그림은 온도, 용존 산소, pH와 교반의 매개 변수를 설정하기 전에 화면을 보여줍니다. 매개 변수가 설정되면, 실행 파라미터는 연속적으로 모니터링하고 조정이 필요한 상태를 유지하도록 할 수있다. 이 소프트웨어는 문제를 쉽게 식별 할 수있는 연속 판독 값을 생성합니다. DMEM은 10 % FBS, SAFC 안티 폼 C 250 PPM, 2mm의 L-글루타민 및 3g / 마이크로 캐리어들의 L을 함유하는 2.5 L를 이용하여 본 실험에서, 시스템은 매우 산소 퍼센트가 50 %, 인 안정 온도는 37 ° C이며, pH는 7.2이다. 반응기를 7 × 104 세포 / ml (또는 / 미세 담체 10 세포)의 농도에서 A549 세포를 접종한다. 이 실행을 위해 선택된 파라미터는 2 시간 (도 4) 내에 마이크로 캐리어에 부착 된 세포의 대다수되었습니다. 12 시간 후, 세포는 악마입니다(그림 5) 평탄화 및 마이크로 캐리어 표면에 확산 trating 표지판. 24 시간으로, 마이크로 캐리어 (그림 6) 세포없이 어떤 마이크로 사업자 및 마이크로 캐리어에 세포의 더 큰 덩어리와 세포의 비교적 고른 분포를 가지고있다. A549 세포에 의해 마이크로 캐리어 식민지의 비율은 24 시간 후 90 % (그림 7) 75 %이다. 세포는 48 시간 (그림 8) 후 ~ 1,000,000 세포 / ml로 기하 급수적으로 증가하는 것을 계속했다. 50 시간에 온 콜리 틱 아데노 바이러스 (2 × 10 8 비리 온 / ㎖)의 투여에 의해 감염 후, 밀도는 ML 1,200,000 세포 / 증가하고 용균 감염이 진행됨에 따라 감소하기 시작했다. 바이러스 접종 ~ 10,000 배 증폭이 있었다.

이전의 실험에서, 우리는 가스 흐름을 모니터링하고 조정하는 것은 세포의 성장 (게시되지 않은 데이터)를 극대화하는 데 중요한 것으로 나타났습니다. 빠르게 성장하는 세포는 산소 시스템을 고갈 수 제로로 떨어지는 DO 수준입니다. 세포는 성장을 계속하지만, 훨씬 더 느린 속도로했다. 그것은 모니터링 및 대수 성장 단계에서 세포의 요구를 충족시키기 위해 산소 유량을 조정하는 것이 중요하다. 각각의 실행은 매일 세포 수와 산도, DO, 온도를 비교하여 최적의 성장을 분석 할 수 있습니다.

figure-results-1
다양한 원자로 볼륨에서 벽 전단력을 측정 교반기 탱크 생물 반응기에 비해 공압 생물 반응기 시스템 (PBS)의 그림 1 유체 역학.

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그림 2 공압 에어 휠 원자로 임펠러.

52008 / 52008fig3highres.jpg "/>
생물 반응기의 실행을 시작하는 매개 변수의 3 공압 에어 휠 소프트웨어 스크린 샷 그림.

figure-results-3
A549 세포 2 시간 게시물 접종 그림 4 마이크로 캐리어 식민지. (평균 마이크로 캐리어 직경 ~ 180 μm의.) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-4
도 5에서 12 시간 배양 개시 후, A549 세포는 부착 평탄화 및 마이크로 캐리어 상으로 확산된다.5highres.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

figure-results-5
문화 24 시간 후 세포로 코팅 된 그림 6 마이크로 캐리어. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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A549 세포에 의해 마이크로 캐리어 식민지의 그림 7 비율 접종을 게시 할 수 있습니다.

figure-results-7
도 8 adenovir 함께 예비 배양에서 생존 A549 세포의 수와 포스트 감염우리는. 바이러스 감염 단계는 50 시간에서 발생합니다.

토론

이 회용 바이오 리액터 시스템은 사용하기 비교적 간단하고 반응기 모니터링 및 분석을위한 실시간 분석을 제공한다. 그것은 매우 잘 천만명 이상의 세포 / ml에 도달 한 세포 밀도가 포유 동물과 곤충 세포 배양에 적합하다. A549 세포는이 보고서 11에 설명 외에, 우리는뿐만 아니라 생물 반응기에서 SF-9 곤충 세포를 성장했다. 공압 공기 휠이 제공하는 부드러운 혼합 세포 손상을 줄일 수 있습니다. 이 반응기를 설정할 때 몇 가지 단계가 중요하다. 첫째, 적절한 산도의 교정 및 센서는 문화의 최적의 모니터링 및 산도 또는 시스템의 산소를 조절 시약을 첨가 한 중요 않습니다. 둘째, 시약 및 종자 병이 채워지고 루어 첨부는 BSC로 무균 환경에서 이루어져야한다. 시약 병은 무균 환경에서 벗어나게되면, 생물 반응기 공급 라인의 연결은 미생물이 오염되지 않도록주의해야합니다.

이 생물 반응기 시스템이이 박테리아 배양을 위해 설계되지 포유 동물과 곤충 세포주 잘 작동하는 동안. 시스템은 세균 세포에 필요한 산소와 급속한 혼합을 제공 할 수 없다. 세균의 성장에 가장 교반 탱크 생물 반응기에서 수행됩니다. 포유 동물 또는 곤충 세포 배양에 대한 다른 일회용 바이오 리액터에 비해,이 시스템은 사용하기 쉽고 실행의 분석을 위해 충분한 데이터를 제공하고, 우리가 평가 한 다른 단일 사용 시스템보다 비슷하거나 더 나은 세포의 성장이 있습니다.

회용 바이오 리액터 공압 시스템은 세포를 연구 biotherapeutics, 백신의 임상 응용 분야에서의 여러 줄기를 충족 할 가능성, 및 개인화 된 약 4를 갖는다. 또한,이 시스템의 유연성은 배치, 회분, 관류 및 형질을 기반으로 생물 반응기 애플리케이션 다섯 수 있습니다. 마지막으로, 단일 사용 회용 바이오 리액터 시스템이 poten대규모 산업 생산의 요구를 충족하고, 가이드 라인과 국내 및 국제 규제 기관 6-10의 권장 사항을 준수 자유형.

공개 사항

저자 D. 지로와 Y Hashimura이 문서에서 사용되는 시약 및 장비를 생산 PBS 바이오 테크의 직원입니다.

감사의 글

이 프로젝트는 존스 홉킨스 대학의 교무처가 Gateway Science Initiative를 통해 부분적으로 지원했습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
PBS 3 PBS
단일 용도 회의PBS
인간적인 폐 암종 세포 (A549)ATCCCCL-185
DMEM 높은 포도당 매체
소 태아 혈청
트립신 EDTA, 0.25%
Cytodex 1 MicrocarriersGE3781
소포제 C시그마A8011

참고문헌

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