에피 솜과 HDAC 억제제를 사용하여 혈액에서 효율적인 유도 만능 줄기 세포 생성

Summary

여기에서는 에피솜 기반 재프로그래밍 전략과 히스톤 탈아세틸화효소 억제제를 사용하여 말초 혈액에서 인간 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다.

Abstract

이 원고는 효율적으로 에피 솜 플라스미드와 히스톤 탈 아세틸 화 효소 (HDAC) 억제제를 사용하여 말초 혈액에서 통합이없는 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)를 생성하기위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 방법의 장점은 : (1) 원료로서 말초 혈액의 최소량의 사용; (2) 프로그램을 다시 벡터를 nonintegrating; (3) 자유 iPSCs 벡터를 생성하는 비용 효과적인 방법; (4) 단일 트랜; (5) 작은 분자의 사용은 후생 유전 학적 리 프로그래밍을 용이하게한다. 리 프로그래밍 현저 의무가 높은 증식 적혈구 전구 세포 집단을 수득 요약하면, 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)는 루틴 채혈 샘플로부터 분리되어 정의 된 증식 인자에서 배양 하였다. Nonintegrating, OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A 및 p53의 짧은 머리 핀의 자형 (SH) RNA를 발현하는 nontransmissible 에피 솜 플라스미드는 introdu 있습니다하나의 nucleofection를 통해 도출 된 적혈구 모세포에 세드릭. 녹색 형광 단백질을 강화 표현한다 에피 솜 (eGFP는) cotransfection 된 세포는 형질 전환 된 세포를 쉽게 식별 할 수 있습니다. 엡스타인 - 바르 핵 항원 1 (EBNA1)를 별도의 발현 플라스미드의 복제 - 결함은 에피 솜 단백질의 발현 증가에 대한 반응 혼합물에 첨가된다. 형질 감염된 세포는 계속 재 프로그래밍에 대한 조사 마우스 배아 섬유 아세포 (iMEFs) 층에 도금되어있다. 즉시 IPSC 같은 식민지 nucleofection 후 약 십이일에 나타나는대로, HDAC 억제제는 후생 유전 학적 리모델링을 용이하게하기 위해 중간에 추가됩니다. 우리는 HDAC 억제제를 포함 정기적으로 2 배 완전히 재 프로그래밍 IPSC 식민지의 생성을 증가 시킨다는 것을 발견했다. IPSC 식민지 일반적인 인간 배아 줄기 세포 (hESC의) 형태를 전시되면, 그들은 부드럽게 지속적인 성장과 확장을위한 개별 IMEF 코팅 조직 배양 플레이트로 전송됩니다.

Introduction

iPSCs는 만능 유전자의 최소한의 자궁외 표현을 통해 체세포 조직에서 파생됩니다. 이 기술은 처음에 매우 만능 상태 ^1로 표현된다 OCT4, SOX2, KLF4, 및 cMYC 인간 섬유 아세포의 레트로 바이러스 전달에 의해 입증되었다. 이러한 일시적 발현 "리 프로그래밍 인자"는 인간 배아 줄기 세포 ⁽²⁾ 표적 세포의 후성 프리 및 유전자 발현 프로파일이 유사한 변경. 생성 한 후에, iPSCs는 잠재적으로 추가 조사에 대한 조직 형으로 구분 될 수있다. 따라서, 그들은 재생 의학, 질병 모델링, 유전자 치료의 용도로 약속을 누르고 있습니다. 그러나, 바이러스 통합과 함께 게놈을 방해하는 내인성 유전자 발현, 영향 세포 표현형을 변화시킬 가능성이 있고, 궁극적으로 과학적 결과를 편향. 또한, 임의의 바이러스 통합은 해로운 세포 전자로 이어질 수악성화 ³ 발암 유전자 ^(4)의 재 발현의 가능성을 포함 ffects. 미래의 임상 적용은 비 통합 IPSC 생성을 필요로 할 것이다.

여분의 염색체 원형 DNA 분자이다 에피 좀은 비용 효율적인 통합없는 iPSCs ^5를 생성하기위한 전략을 제공한다. 표 1에 나타내는 에피 솜 벡터의 조합은 리 프로그래밍이 OCT4, SOX2, KLF4, MYCL 및 LIN28A 인자 표현한다. pCXLE_hOCT3 / 4 shp53-F 플라스미드는 세포 재 프로그래밍 ^(6)을 향상시키기 위해 TP53의 일시적인 억제를위한 p53의 shRNA를 포함되어 있습니다. 복제 - 결핍 pCXWB EBNA1 벡터가 EBNA1 발현 ⁷ 일시적인 증가를 제공함으로써 리 프로그래밍 인자의 증폭과 증가 된 리 프로그래밍 효율을 촉진한다. pCXLE_EGFP 플라스미드 dete의 목적 nucleofection 혼합물에 첨가 될 수있다셀 정렬 응용 프로그램에 대한 형질 전환 효율 또는 rmining. P는 CXWB-EBNA1을 제외하고,이 프로토콜에서 사용하는 에피 솜 플라스미드는 숙주 세포 ^(8)의 분할 중에 복제 및 에피 솜의 파티션을 매개 바이러스 복제 및 EBNA1 유전자의 엡스타인 바 바이러스 원점을 함유한다. 에피 솜은 자발적으로 연속 IPSC 확장 ⁷ 손실됩니다. 서브 클로닝 및 eGFP는 표현의 손실을 추측 할 수있다 에피 솜 벡터 손실과 iPSCs의 특성은 미래의 임상 응용 프로그램에 완전히 통합 무료 iPSCs로 이어질 수 있습니다.

IPSC 생성의 과정에 고유 혈통 특정 유전자의 억제 및 분화능 관련 유전자의 활성화입니다. 유전자 발현의 규제 대상으로 전사 인자를 허용하는 DNA 및 염색질 변형을 규제 DNA 요​​소, 및 RNA 폴리머 라제 이용과 같은 핵 내부의 여러 레벨에서 일어난다유전자. 글로벌 염색질 수정을 통해 후성 유전 적 풍경의 리모델링을 다시 표현하는 핵심 요소 다 능성 유전 적 프로그램입니다. 유전자 발현의 조절에 중요​​한 특정 염색질 변형 히스톤-DNA 코일 장력의 감소를 통해 유전자를 타겟팅 액세스를 허용하는 특정 리신 잔기에서 히스톤의 아세틸 화이다. HDAC 억제제 인해 아세틸 상태 ^(11)를 지원하는 것으로, IPSC 리 프로그래밍 및 hESC의자가 재생 (self-renewal) ^{9,10 향상하는} 것으로 나타났다 작은 분자이다. 통합 렌티 ^12을 사용 전에 공보에서 적응 후술 프로토콜은 말초 혈액 이용한 에피 솜 및 HDAC 억제제에서 최적화 IPSC 생성을위한 단계적인 방법을 제공한다. 여기에 사용되는 HDAC 억제제의 농도는 도자기에 의해 설명 된의 절반, 등. ^9, 일상적으로 표준을 통해 완벽하게 재 프로그램 IPSC 식민지에서 2 배 증가 주도HDAC 억제제없이 에피 솜 재 프로그래밍 프로토콜. 재 프로그래밍의 수준은 우리가 렌티 바이러스 방법과 관찰 효율성과 비슷한 수준이다. 이 프로토콜을 사용하여, 우리는 효율적으로 나이 팔십칠년만큼 오래된 개인에서 IPSC를 생성 한.

Protocol

프레드 허친슨 암 연구 센터(Fred Hutchinson Cancer Research Center)와 필라델피아 아동 병원(Children's Hospital of Philadelphia)의 기관 검토 위원회(Institutional Review Boards)에서 승인한 서면 동의서는 말초 혈액 샘플을 채취하기 전에 환자로부터 얻었습니다. 모든 제도적 지침을 준수했습니다. MEF 생성 및 기형종 형성을 포함한 모든 동물 실험은 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.

1. PBMCS의 Ficoll 분리 및 적혈구 증식 – Day 0

1. 말초 혈액을 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 1:1로 희석합니다. 15ml의 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브에 7ml의 희석된 혈액을 실온 Ficoll-Hypaque 3ml에 조심스럽게 겹칩니다.
2. 400 x g에서 30분 동안 시료를 원심분리합니다.
3. PBMC는 플라즈마와 흐린 백색 층으로 보이는 Ficoll-Hypaque 사이의 계면에 정착할 것입니다. 멸균 전사 피펫을 사용하여 PBMC를 하나의 15ml 원뿔형 튜브에 모읍니다. DPBS를 사용하여 부피를 10ml로 가져옵니다.
4. 혈구계를 사용하여 PBMC를 계수합니다.
5. 피펫 2 × 10⁶ PBMC를 별도의 15ml 원뿔형 튜브에 넣고 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다. 나머지 세포를 스핀다운하고 90% 소 태아 혈청(FBS)/10% 디메틸 설폭사이드(DMSO)에서 2 × 10⁶ PBMCs/ml의 농도로 동결합니다.
6. 팽창 배지 준비: QBSF-60 무혈청 배지(빛으로부터 보호) + 페니실린/스트렙토마이신(1%) + 아스코르브산(50ng/ml) + 줄기세포 인자(SCF, 50ng/ml) + 인터루킨 3(IL-3, 10ng/ml) + 에리트로포이에틴(EPO, 2U/ml) + 인슐린 유사 성장 인자 1(IGF-1, 40ng/ml) + 덱사메타손(1μM, 빛으로부터 보호, 배지가 변경될 때마다 새로운 분취액을 해동).
7. 갓 만든 팽창 배지 2ml에 2 × 10⁶ PBMC를 재현탁하고 12 웰 조직 배양 플레이트의 한 웰에 넣고 5 % O₂, 5 % CO₂ 및 90 % N₂ 분위기의 37 ° C 가습 인큐베이터에서 배양합니다.
8. 3일차와 6일차에 미디어를 교체합니다.
   1. 세포를 모으고 QBSF-60 2ml로 웰을 세척하여 남은 세포를 수집합니다.
   2. 세포 현탁액을 300 x g에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 흡입합니다.
   3. 2ml의 새로운 확장 배지에 세포를 재현탁시키고 동일한 12웰 플레이트에 다시 넣습니다.

2. 핵 절제에 의한 세포 재프로그래밍 – 9일차

1. 재프로그래밍된 플라스미드를 멸균된 1.5 ml Eppendorf tube에 피펫팅합니다(표 1).
2. nucleofection solution과 Supplement(제조업체에서 제공) 및 피펫을 멸균 1.5 ml Eppendorf tube에 혼합합니다.
3. 팽창 배지 2ml를 12웰 플레이트의 한 웰에 피펫팅하고 세포를 추가하기 전에 평형을 위해 가습된 37°C 인큐베이터(5% O₂, 5% CO₂ 및 90% N₂)에 넣습니다.
4. 배양된 세포를 모으고 QBSF-60 2ml로 웰을 세척하여 남은 세포를 수집합니다.
5. 300 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 흡인합니다.
6. 5ml의 DPBS에 재현탁하고 300 x g에서 5분 동안 원심분리하여 세포를 세척합니다.
7. 상층액을 흡인합니다.
8. 세포 펠릿을 100μl의 핵 펙션 용액 + 보충제에 재현탁하고 기포가 생성되지 않도록 주의합니다.
9. 세포 현탁액을 재프로그래밍 플라스미드가 포함된 튜브에 피펫팅하고, 위아래로 한 번 피펫팅하고, 샘플을 뉴클레펙션 큐벳의 바닥에 피펫팅합니다.
10. 큐벳을 핵융합 기계에 넣고 프로그램 T-019를 실행합니다.
11. 예열된 팽창 배지 100μl(2.3단계의 평형판에서)를 핵 펙션 큐벳으로 옮깁니다.
12. 즉시 전체 샘플을 수집하고 예열된 팽창 매체의 우물에 침전합니다. 하얗고 떠다니는 죽은 세포 파편을 수거하지 마십시오.
13. 성장을 위해 플레이트를 가습된 37°C 인큐베이터(5% O₂, 5% CO₂ 및 90% N₂)에 넣습니다.

3. 도금 피더 셀 – 10일 또는 11일

1. 10일째에는 플레이트 피더 셀.
   1. 젤라틴으로 6 웰 조직 배양 플레이트 하나를 코팅합니다.
      1. Hank's Buffered Saline Solution(HBSS)에 있는 0.1% 젤라틴 1m를 플레이트의 각 웰에 피펫으로 넣습니다.
      2. 플레이트를 가습된 37°C 인큐베이터에 최소 5분 동안 놓습니다.
      3. 사용 직전에 플레이트에서 젤라틴 용액을 흡입하십시오.
   2. 3,000 cGy로 조사된 2 × 10⁶ 마우스 배아 섬유아세포 1바이알을 10ml의 예열된 MEF 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM) + FBS(10%) + 페니실린/스트렙토마이신(1%))으로 해동합니다.
   3. 300 x g에서 5분 동안 세포를 원심분리하고 상층액을 흡인합니다. 12ml의 MEF 배지 및 피펫 2ml에 세포를 젤라틴으로 코팅된 6웰 플레이트의 각 웰에 재현탁합니다. 플레이트를 가습된 37°C 인큐베이터(5% O₂, 5% CO₂ 및 90% N₂)에 12일까지 놓습니다.

4. 피더 셀의 도금 셀 및 매체 변경 – Day 12

1. 핵형성된 세포를 하나의 15ml 원뿔형 튜브에 모으고 2ml의 QBSF-60으로 웰을 세척하여 남은 세포를 수집합니다. 샘플을 300 x g에서 5분 동안 원심분리합니다.
2. 재프로그래밍 배지 준비: Iscove의 변형된 둘베코 배지(IMDM) + FBS(10%) + 비동물성 L-글루타민(1mM) + 비필수 아미노산(NEAA, 1%) + 페니실린/스트렙토마이신(1%) + β-메르캅토에탄올(0.1mM) + 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF, 수유 시 신선하게 첨가, 10ng/ml) + 아스코르브산(수유 시 신선하게 첨가, 50μg/ml).
3. 상등액을 흡인하고 12ml의 Reprogramming Medium에 세포를 재현탁합니다. 세포 현탁액의 웰당 2ml를 피더 셀의 6웰 플레이트에 넣습니다(섹션 3에서 준비한 대로). 실온에서 50 x g으로 플레이트를 30분 동안 원심분리합니다.
4. 성장을 위해 플레이트를 가습된 37°C 인큐베이터(5% O₂, 5% CO₂ 및 90% N₂)에 넣습니다. iPSC 콜로니가 나타나기 시작할 때까지(1-2주) 격일로 Reprogramming Medium을 변경합니다.
5. hESC 배지 준비: DMEM/F12 1:1 + 녹아웃 세럼 대체물(20%) + 페니실린/스트렙토마이신(1%) + NEAA(1%) + 비동물 L-글루타민(1mM) + 피루브산나트륨(1%) + 중탄산나트륨(0.12%) + β-메르캅토에탄올(0.1mM) + bFGF(수유 시 신선 첨가, 10ng/ml)
6. HDAC 억제제를 준비합니다: 부티르산나트륨(수유 시 신선하게 첨가, 100μM), 수베아닐로하이드록사믹산(SAHA, 수유 시 신선하게 첨가, 200nM). iPSC 콜로니가 나타나면 hESC 배지 + HDAC 억제제를 세포에 공급하기 시작하고 매일 배지를 교체하십시오.
   참고: 부티르산나트륨은 플라스틱 튜브에 흡착되는 작은 분자이므로 4°C의 붕규산 유리관에 보관하십시오.

5. iPSC 클론 분리

1. iPSC 콜로니가 분리할 수 있을 만큼 충분히 커지면(20-25개 세포) P20 피펫으로 선별합니다.
2. HDAC 억제제 준비: 부티르산나트륨(수유 시 신선하게 첨가, 100μM), SAHA(수유 시 신선하게 첨가, 200nM)
3. hESC Medium + HDAC 억제제 + Cloning & Recovery Supplement가 들어있는 개별 35mm 접시에 분리된 콜로니를 iMEF에 놓습니다.
4. 콜로니를 채취한 다음 날, 배지를 hESC 배지 + HDAC 억제제로 변경합니다.
5. iPSC 콜로니가 계대 형성 준비가 될 때까지 배지를 매일 교체합니다.
6. 통로 2-3에서 집락이 안정화되면 배지에서 HDAC 억제제를 제거합니다.

Results

핵 절제 후 3일 후 및 핵 절제된 세포를 iMEF에 도금하기 전에 성공적인 핵 절제의 효율은 eGFP에 대한 형광 현미경으로 추정해야 합니다. 그림 1은 전체 세포 집단의 약 5-10%가 eGFP를 발현하는 일반적인 핵 절제 실험을 보여줍니다.

재프로그래밍된 iPSC 콜로니는 핵 절제 후 약 2주 후에 나타나기 시작합니다. 군체는 일반적으로 경계가 잘 정의된 원형이며 (1) 핵-세포질 비율이 높은 작고 밀집된 세포와 (2) 눈에 보이는 핵체(그림 2, 명시야)를 포함한 특징적인 hESC 형태학으로 식별될 수 있습니다. 불완전하게 재프로그래밍된 세포는 악화되거나 실제 iPSC 콜로니와 쉽게 구별되는 이질적인 세포 덩어리를 형성합니다.

우리가 완전히 특성화하기 위해 선택한 대표 계통 중 모든 세포주는 표준 다능성 마커(그림 2)를 발현하고, ...

Discussion

이 프로토콜을 사용할 때 성공적인 iPSC 생성을 위해서는 고려해야 할 몇 가지 중요한 주의 사항이 있습니다. 적혈구 확장 단계에서는 편차가 표적 전구 세포 집단의 비효율적인 자극과 iPSC 생성 효율의 저하로 이어질 수 있으므로 배지 변경 일정을 엄격히 따라야 합니다. 매체가 바뀔 때마다 새로운 덱사메타손으로 새로운 확장 배지를 만드는 것이 중요합니다. QBSF-60 기본 배지와 덱사메타손은 보관 중에 빛으로부터 보호해야 합니다. 핵박신 중에 DPBS 세척은 핵 접시관에서 전류를 아크로 일으켜 광범위한 세포 사멸을 초래할 수 있는 세포 현탁액에서 과도한 용질을 제거하는 데 중요합니다. 핵접합 후 약 10일 후에 플레이트를 매일 iPSC 콜로니 모양에 대해 검사해야 합니다. 여러 개의 작은 콜로니가 존재하면 혈청에 장기간 노출되면 자발적인 분화를 유도할 수 있으므로 재프로그래밍 배지를 hESC 배지(HDAC 억제제 포함)로 변경해야 합니다.

실험실 설정 및 사용 가능한 자원에 따...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ficoll-Paque PLUS	Fisher Scientific	45-001-750	4°C에서 보관하십시오. 사용하기 전에 실온으로 데우십시오.
DPBS	Life Technologies	14190-250	4 °C에 보관하십시오.
RPMI 1640	Life Technologies	11875-093	4 °C.에 보관하십시오.
소 태아 혈청 (FBS)	Life Technologies	10437028	-20 °에 보관; C는 필요할 때까지. 해동, 분취, 4 °C에 보관하십시오.
디메틸 설폭사이드(DMSO)	시그마-알드리치	154938	실온에서 보관하십시오.
QBSF-60 무혈청 배지	Fisher Scientific	50-983-234	4°C에 보관하십시오.
페니실린/스트렙토마이신	Life Technologies	15140122	4°C에 매장
세포주 핵 펙터 키트 V	Lonza	VCA-1003	4 °C에 저장.
2% 젤라틴 해결책	Sigma-Aldrich	G1393	4 °에 저장한다; C, 37 °에서 액화; C 사용 전 수조.
Hank's Balanced Saline Solution(HBSS)	Life Technologies	14175-103	매장 4°C.
Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium)	Life Technologies	11965-092	Store at 4 °C.
Iscove의 Modified Dulbecco's Medium (IMDM)	Life Technologies	12440-061	Store at 4 °C.
L-글루타민, 200mM	Life Technologies	25030-081	부분 표본, -20°C에서 동결
비필수 아미노산(NEAA), 100X	Life Technologies	11140-050	4 °에 저장; C, 빛에서 멀리 떨어져.
DMEM/Ham's F12, 1:1	Fisher Scientific	SH30023.02	4°C에 보관.
KnockOut Serum Replacement	Life Technologies	10828-028	부분 표본, -20°C에서 동결.
나트륨 피루브산, 100 mM	Life Technologies	11360-070	4 °C에 저장.
중탄산나트륨, 7.5%	Life Technologies	25080094	4°C에 보관하십시오.
Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF)	Life Technologies	PHG0263	DPBS에 10 mg/ml 스톡을 만들고 분취량은 -20 °C에서 동결합니다. 해동되면 4°C에서 보관하십시오.
부티르산나트륨	Sigma-Aldrich	B5887-1G	DPBS로 2000x 재고(400mM)를 만들고 분취량, -20°C에서 동결합니다. 해동되면 4°C에서 보관하십시오.
hES 세포 클로닝 및 회복 보충제	Stemgent	01-0014-500	-20 °에 저장; C는 필요할 때까지. 해동되면 4°C에서 보관하십시오.
ESC 인증 BD matrigel	BD Biosciences	35-4277	에서 얼음 위에서 밤새 해동; C, 미리 냉각된 피펫 팁을 사용하여 미리 냉각된 튜브로 분취합니다. -20 °에서 보관하십시오. C는 필요할 때까지. 4 °에서 해동; C, 즉시 사용하십시오.
스템스팬 SFEM	STEMCELL Technologies	9650	분취량, -20°C에서 동결.
아스코르브산, 분말	시그마-알드리치	A4403-100MG	DPBS, 멸균 필터에 5mg/ml 재고를 만들고 4°C에서 보관합니다.
재조합 인간 줄기 세포 인자 (SCF)	R & D 시스템	255-SC-010	Make 100 μ SFEM의 g/m 재고, 부분 표본, -20 °C에서 동결. 해동되면 4°C에서 보관하십시오.
재조합 인간 인터루킨 3 (IL-3)	R & D 시스템	203-IL-010	메이크 100 μ SFEM의 g/ml 재고, 분취량, -20°C에서 동결. 해동되면 4°C에서 보관하십시오.
에리트로포이에틴(EPO)	R & D Systems	287-TC-500	SFEM으로 1000 U/ml 재고를 만들고 분취량, -20°C에서 동결합니다. 해동되면 4°C에서 보관하십시오.
재조합 인간 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF-1)	R & D 시스템	291-G1-200	Make 100 μ SFEM의 g/ml 재고, 분취량, -20°C에서 동결. 해동되면 4°C에서 보관하십시오.
β-메르캅토에탄올	Sigma-Aldrich	M7522	DPBS로 1000배 재고(100mM) 제조.
덱사메타손	시그마-알드리치	D4902-25MG	50x 주식 만들기 (50 μ M)을 DPBS에 넣고 멸균 필터를 4°C에서 보관합니다.
SAHA (vorinostat)	Cayman Chemical	149647-78-9	DPBS로 2,000x 재고(400mM)를 만들고 분취량, -20°C에서 동결합니다. 해동되면 4°C에서 보관하십시오.
12웰 조직 배양 플레이트	Fisher Scientific	08-772-29
15ml 원뿔형 튜브	Sarstedt	62553002
1.5ml Eppendorf 튜브	Fisher Scientific	05-408-129
6웰 조직 배양 플레이트	Fisher	Scientific 08-772-1B
35mm 티수 배양 플레이트	BD Biosciences	353001
10 ml 일회용 혈청학 피	Fisher Scientific	13-675-20
5 ml 일회용 혈청학 피	Fisher Scientific	13-675-22
2 ml 일회용 혈청학 피	Fisher Scientific	13-675-17
20 μ l 피펫 팁, 배리어 팁	Genessee	24-404
유리 파스퇴르 피	Fisher Scientific	13-678-20D
피펫 원조	Fisher Scientific	13-681-15
pCXLE-hOCT3/4-shp53-F	Addgene	27077
pCXLE-hSK	Addgene	27078
pCXLE-hUL	Addgene	27080
pCXLE-EGFP	애드젠	27082
pCXWB-EBNA1	애드겐	37624