여기에서는 에피솜 기반 재프로그래밍 전략과 히스톤 탈아세틸화효소 억제제를 사용하여 말초 혈액에서 인간 유도 만능 줄기 세포를 생성하는 프로토콜에 대해 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
이 원고는 효율적으로 에피 솜 플라스미드와 히스톤 탈 아세틸 화 효소 (HDAC) 억제제를 사용하여 말초 혈액에서 통합이없는 인간 유도 만능 줄기 세포 (iPSCs)를 생성하기위한 프로토콜을 보여줍니다. 이 방법의 장점은 : (1) 원료로서 말초 혈액의 최소량의 사용; (2) 프로그램을 다시 벡터를 nonintegrating; (3) 자유 iPSCs 벡터를 생성하는 비용 효과적인 방법; (4) 단일 트랜; (5) 작은 분자의 사용은 후생 유전 학적 리 프로그래밍을 용이하게한다. 리 프로그래밍 현저 의무가 높은 증식 적혈구 전구 세포 집단을 수득 요약하면, 말초 혈 단핵 세포 (PBMC)는 루틴 채혈 샘플로부터 분리되어 정의 된 증식 인자에서 배양 하였다. Nonintegrating, OCT4, SOX2, KLF4, MYCL, LIN28A 및 p53의 짧은 머리 핀의 자형 (SH) RNA를 발현하는 nontransmissible 에피 솜 플라스미드는 introdu 있습니다하나의 nucleofection를 통해 도출 된 적혈구 모세포에 세드릭. 녹색 형광 단백질을 강화 표현한다 에피 솜 (eGFP는) cotransfection 된 세포는 형질 전환 된 세포를 쉽게 식별 할 수 있습니다. 엡스타인 - 바르 핵 항원 1 (EBNA1)를 별도의 발현 플라스미드의 복제 - 결함은 에피 솜 단백질의 발현 증가에 대한 반응 혼합물에 첨가된다. 형질 감염된 세포는 계속 재 프로그래밍에 대한 조사 마우스 배아 섬유 아세포 (iMEFs) 층에 도금되어있다. 즉시 IPSC 같은 식민지 nucleofection 후 약 십이일에 나타나는대로, HDAC 억제제는 후생 유전 학적 리모델링을 용이하게하기 위해 중간에 추가됩니다. 우리는 HDAC 억제제를 포함 정기적으로 2 배 완전히 재 프로그래밍 IPSC 식민지의 생성을 증가 시킨다는 것을 발견했다. IPSC 식민지 일반적인 인간 배아 줄기 세포 (hESC의) 형태를 전시되면, 그들은 부드럽게 지속적인 성장과 확장을위한 개별 IMEF 코팅 조직 배양 플레이트로 전송됩니다.
서론
iPSCs는 만능 유전자의 최소한의 자궁외 표현을 통해 체세포 조직에서 파생됩니다. 이 기술은 처음에 매우 만능 상태 1로 표현된다 OCT4, SOX2, KLF4, 및 cMYC 인간 섬유 아세포의 레트로 바이러스 전달에 의해 입증되었다. 이러한 일시적 발현 "리 프로그래밍 인자"는 인간 배아 줄기 세포 (2) 표적 세포의 후성 프리 및 유전자 발현 프로파일이 유사한 변경. 생성 한 후에, iPSCs는 잠재적으로 추가 조사에 대한 조직 형으로 구분 될 수있다. 따라서, 그들은 재생 의학, 질병 모델링, 유전자 치료의 용도로 약속을 누르고 있습니다. 그러나, 바이러스 통합과 함께 게놈을 방해하는 내인성 유전자 발현, 영향 세포 표현형을 변화시킬 가능성이 있고, 궁극적으로 과학적 결과를 편향. 또한, 임의의 바이러스 통합은 해로운 세포 전자로 이어질 수악성화 3 발암 유전자 (4)의 재 발현의 가능성을 포함 ffects. 미래의 임상 적용은 비 통합 IPSC 생성을 필요로 할 것이다.
여분의 염색체 원형 DNA 분자이다 에피 좀은 비용 효율적인 통합없는 iPSCs 5를 생성하기위한 전략을 제공한다. 표....
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프로토콜
프레드 허친슨 암 연구 센터(Fred Hutchinson Cancer Research Center)와 필라델피아 아동 병원(Children's Hospital of Philadelphia)의 기관 검토 위원회(Institutional Review Boards)에서 승인한 서면 동의서는 말초 혈액 샘플을 채취하기 전에 환자로부터 얻었습니다. 모든 제도적 지침을 준수했습니다. MEF 생성 및 기형종 형성을 포함한 모든 동물 실험은 기관 동물 관리 및 사용 위원회의 승인을 받았습니다.
1. PBMCS의 Ficoll 분리 및 적혈구 증식 – Day 0
- 말초 혈액을 Dulbecco의 인산염 완충 식염수(DPBS)로 1:1로 희석합니다. 15ml의 둥근 바닥 폴리스티렌 튜브에 7ml의 희석된 혈액을 실온 Ficoll-Hypaque 3ml에 조심스럽게 겹칩니다.
- 400 x g에서 30분 동안 시료를 원심분리합니다.
- PBMC는 플라즈마와 흐린 백색 층으로 보이는 Ficoll-Hypaque 사이의 계면에 정착할 것입니다. 멸균 전사 피펫을 사용하여 PBMC를 하나의 15ml 원뿔형 튜브에 모읍니다. DPBS를 사용하여 부피를 10ml로 가져옵니다.
- 혈구계를 사용하여 PBMC를 계수합니....
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결과
뉴클레오펙션 후 3일이 지나고 뉴클레오펙션된 세포를 iMEF 상에 도말하기 전에, 형광 현미경을 사용하여 eGFP의 발현 여부를 확인함으로써 뉴클레오펙션 성공 효율을 추정해야 합니다. 그림 1은 전체 세포 집단의 약 5-10%가 eGFP를 발현하는 전형적인 뉴클레오펙션 실험 결과를 보여줍니다.
리프로그래밍된 iPSC 콜로니는 뉴클레오펙션 후 약 2주 뒤부터 나타나기 시작합니다. 콜로니는 일반적으로 경계가 뚜렷한 원형이며, (1) 핵-질 비율이 높고 조밀하게 밀집된 작은 세포들과 (2) 관찰 가능한 인을 포함한 특징적인 hESC 형태를 통해 식별할 수 있습니다(그림 2, 명시야). 불완전하게 리프로그래밍된 세포들은 퇴화하거나, 실제 iPSC 콜로니와 쉽게 구별되는 불균일한 세포 덩어리를 형성하게 됩니다.
완전한 특성 분석을 위해 선택한 대표 세포주들은 모두 표준 다능성 마.......
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토론
이 프로토콜을 사용할 때 성공적인 iPSC 생성을 위해서는 고려해야 할 몇 가지 중요한 주의 사항이 있습니다. 적혈구 확장 단계에서는 편차가 표적 전구 세포 집단의 비효율적인 자극과 iPSC 생성 효율의 저하로 이어질 수 있으므로 배지 변경 일정을 엄격히 따라야 합니다. 매체가 바뀔 때마다 새로운 덱사메타손으로 새로운 확장 배지를 만드는 것이 중요합니다. QBSF-60 기본 배지와 덱사메타손은 보관 중에 빛으로부터 보호해야 합니다. 핵박신 중에 DPBS 세척은 핵 접시관에서 전류를 아크로 일으켜 광범위한 세포 사멸을 초래할 수 있는 세포 현탁액에서 과도한 용질을 제거하는 데 중요합니다. 핵접합 후 약 10일 후에 플레이트를 매일 iPSC 콜로니 모양에 대해 검사해야 합니다. 여러 개의 작은 콜로니가 존재하면 혈청에 장기간 노출되면 자발적인 분화를 유도할 수 있으므로 재프로그래밍 배지를 hESC 배지(HDAC 억제제 포함)로 변경해야 합니다.
실험실 설정 및 사용 가능한 자원에 따.......
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공개 사항
저자는 경쟁하는 금전적 이해관계가 없음을 선언합니다.
감사의 글
저자는 이 연구를 지원하기 위해 NIH로부터 K08DK082783(AR), P30DK56465(BTS), U01HL099993(BTS), T32HL00715036(SKS) 및 K12HL0806406(SKS)의 보조금을 받았으며 JP McCarthy Foundation(AR)에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| Ficoll-Paque PLUS | Fisher Scientific | 45-001-750 | 4°C에서 보관하십시오. 사용하기 전에 실온으로 데우십시오. |
| DPBS | Life Technologies | 14190-250 | 4 °C에 보관하십시오. |
| RPMI 1640 | Life Technologies | 11875-093 | 4 °C.에 보관하십시오. |
| 소 태아 혈청 (FBS) | Life Technologies | 10437028 | -20 °에 보관; C는 필요할 때까지. 해동, 분취, 4 °C에 보관하십시오. |
| 디메틸 설폭사이드(DMSO) | 시그마-알드리치 | 154938 | 실온에서 보관하십시오. |
| QBSF-60 무혈청 배지 | Fisher Scientific | 50-983-234 | 4°C에 보관하십시오. |
| 페니실린/스트렙토마이신 | Life Technologies | 15140122 | 4°C에 매장 |
| 세포주 핵 펙터 키트 V | Lonza | VCA-1003 | 4 °C에 저장. |
| 2% 젤라틴 해결책 | Sigma-Aldrich | G1393 | 4 °에 저장한다; C, 37 °에서 액화; C 사용 전 수조. |
| Hank's Balanced Saline Solution(HBSS) | Life Technologies | 14175-103 | 매장 4°C. |
| Dulbecco의 DMEM(Modified Eagle Medium) | Life Technologies | 11965-092 | Store at 4 °C. |
| Iscove의 Modified Dulbecco's Medium (IMDM) | Life Technologies | 12440-061 | Store at 4 °C. |
| L-글루타민, 200mM | Life Technologies | 25030-081 | 부분 표본, -20°C에서 동결 |
| 비필수 아미노산(NEAA), 100X | Life Technologies | 11140-050 | 4 °에 저장; C, 빛에서 멀리 떨어져. |
| DMEM/Ham's F12, 1:1 | Fisher Scientific | SH30023.02 | 4°C에 보관. |
| KnockOut Serum Replacement | Life Technologies | 10828-028 | 부분 표본, -20°C에서 동결. |
| 나트륨 피루브산, 100 mM | Life Technologies | 11360-070 | 4 °C에 저장. |
| 중탄산나트륨, 7.5% | Life Technologies | 25080094 | 4°C에 보관하십시오. |
| Basic Fibroblast Growth Factor (bFGF) | Life Technologies | PHG0263 | DPBS에 10 mg/ml 스톡을 만들고 분취량은 -20 °C에서 동결합니다. 해동되면 4°C에서 보관하십시오. |
| 부티르산나트륨 | Sigma-Aldrich | B5887-1G | DPBS로 2000x 재고(400mM)를 만들고 분취량, -20°C에서 동결합니다. 해동되면 4°C에서 보관하십시오. |
| hES 세포 클로닝 및 회복 보충제 | Stemgent | 01-0014-500 | -20 °에 저장; C는 필요할 때까지. 해동되면 4°C에서 보관하십시오. |
| ESC 인증 BD matrigel | BD Biosciences | 35-4277 | 에서 얼음 위에서 밤새 해동; C, 미리 냉각된 피펫 팁을 사용하여 미리 냉각된 튜브로 분취합니다. -20 °에서 보관하십시오. C는 필요할 때까지. 4 °에서 해동; C, 즉시 사용하십시오. |
| 스템스팬 SFEM | STEMCELL Technologies | 9650 | 분취량, -20°C에서 동결. |
| 아스코르브산, 분말 | 시그마-알드리치 | A4403-100MG | DPBS, 멸균 필터에 5mg/ml 재고를 만들고 4°C에서 보관합니다. |
| 재조합 인간 줄기 세포 인자 (SCF) | R & D 시스템 | 255-SC-010 | Make 100 μ SFEM의 g/m 재고, 부분 표본, -20 °C에서 동결. 해동되면 4°C에서 보관하십시오. |
| 재조합 인간 인터루킨 3 (IL-3) | R & D 시스템 | 203-IL-010 | 메이크 100 μ SFEM의 g/ml 재고, 분취량, -20°C에서 동결. 해동되면 4°C에서 보관하십시오. |
| 에리트로포이에틴(EPO) | R & D Systems | 287-TC-500 | SFEM으로 1000 U/ml 재고를 만들고 분취량, -20°C에서 동결합니다. 해동되면 4°C에서 보관하십시오. |
| 재조합 인간 인슐린 유사 성장 인자 1 (IGF-1) | R & D 시스템 | 291-G1-200 | Make 100 μ SFEM의 g/ml 재고, 분취량, -20°C에서 동결. 해동되면 4°C에서 보관하십시오. |
| β-메르캅토에탄올 | Sigma-Aldrich | M7522 | DPBS로 1000배 재고(100mM) 제조. |
| 덱사메타손 | 시그마-알드리치 | D4902-25MG | 50x 주식 만들기 (50 μ M)을 DPBS에 넣고 멸균 필터를 4°C에서 보관합니다. |
| SAHA (vorinostat) | Cayman Chemical | 149647-78-9 | DPBS로 2,000x 재고(400mM)를 만들고 분취량, -20°C에서 동결합니다. 해동되면 4°C에서 보관하십시오. |
| 12웰 조직 배양 플레이트 | Fisher Scientific | 08-772-29 | |
| 15ml 원뿔형 튜브 | Sarstedt | 62553002 | |
| 1.5ml Eppendorf 튜브 | Fisher Scientific | 05-408-129 | |
| 6웰 조직 배양 플레이트 | Fisher | Scientific 08-772-1B | |
| 35mm 티수 배양 플레이트 | BD Biosciences | 353001 | |
| 10 ml 일회용 혈청학 피 | Fisher Scientific | 13-675-20 | |
| 5 ml 일회용 혈청학 피 | Fisher Scientific | 13-675-22 | |
| 2 ml 일회용 혈청학 피 | Fisher Scientific | 13-675-17 | |
| 20 μ l 피펫 팁, 배리어 팁 | Genessee | 24-404 | |
| 유리 파스퇴르 피 | Fisher Scientific | 13-678-20D | |
| 피펫 원조 | Fisher Scientific | 13-681-15 | |
| pCXLE-hOCT3/4-shp53-F | Addgene | 27077 | |
| pCXLE-hSK | Addgene | 27078 | |
| pCXLE-hUL | Addgene | 27080 | |
| pCXLE-EGFP | 애드젠 | 27082 | |
| pCXWB-EBNA1 | 애드겐 | 37624 |
참고문헌
- Takahashi, K., et al. Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell. 131 (5), 861-872 (2007).
- Koche, R. P., et al. Reprogramming factor expression initiates widespread targeted chromatin remodelin....
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재인쇄 및 허가
