방법 논문

단백질 분해의 체계적인 분석을위한 기자 기반의 성장 분석

DOI:

10.3791/52021

⸱

2014년 11월 6일

 ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, The Hebrew University of Jerusalem

이 논문에서

요약

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여기에서는 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의한 단백질 분해의 상대적 속도를 정량화하기 위한 강력한 생물학적 분석법을 설명합니다. 분석 판독은 액체 배양에서의 효모 성장 속도이며, 이는 필수 대사 마커에 융합된 분해 신호로 구성된 리포터 단백질의 세포 수준에 따라 달라집니다.

초록

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유비퀴틴 - 프로 테아 좀 시스템 (UPS)에 의한 단백질 분해는 모든 진핵 생물의 단백질 항상성의 주요 규제 메커니즘입니다. 세포 내 단백질 분해를 결정하는 표준 접근 방식은 단백질 감소의 반응 속도를 다음과 같은 사항에 대해 생화학 적 분석에 의존합니다. 이러한 방법은 종종 시간과 노력이 소요되고 여러 기판 및 분해 조건을 평가하기위한 실험을하는 것이 의무가 없습니다. 대안으로, 세포 성장 기반 분석은 정량적 단백질 수준에서의 상대적인 변화를 결정할 수있는 그들의 종래의 형식, 종점 분석법이다이 개발되고있다.

여기에서 우리는 충실하게 효모 세포 성장 속도론에 결합하여 단백질 분해 속도의 변화를 결정하는 방법을 설명합니다. 방법은 URA3의 우라실 영양 요구 효모 세포 외 인적으로 발현 리포터 단백질에 의해 구출 -deleted 확립 선택 시스템에 기초, 필수적인 URA3 유전자 및 열화 행렬식 (degron) 간의 융합 구성. 리포터 단백질의 분해 속도가 degron 의해 결정되는 반면 그 합성 속도가 일정하게되도록 설계된다. 우라실이 결핍 된 배지에서 세포 성장이 URA3의 상대적 수준에 비례하기 때문에, 성장 속도론은 리포터 단백질 분해에 전적으로 의존한다.

이 방법은 정확하게 세포 내 단백질 분해 반응 속도의 변화를 측정한다. (a) E2 효소 컨쥬 게이트 구조 - 기능 (c) 식별 및 신규 degrons의 특성을 분석하여 단백질 분해 (b)에 공지 유비퀴틴 공역 요인의 상대적 기여도를 평가 : 그것은 적용 하였다. 그것은 또한 다른 세포질 통로의 기능과 연관된 단백질 수준의 변화를 모니터링하도록 구성 될 수 degron- URA3 기반 시스템의 적용은, 단백질 분해 필드를 초월.

서론

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유비퀴틴 - 프로 테아 분해 시스템은 모든 진핵 세포에서 단백질의 항상성 유지에 관여한다 주요 조절 시스템이다. UPS는 처음에 폴리 - 유비퀴틴 태그 단백질 26S 프로 테아 좀에 의해 분해 된 후, 표적 단백질에 여러 유비퀴틴 분자 공액. 대부분의 경우, 유비퀴틴 매개 된 분해에 대한 속도 제한 단계가 E2 효소 컨쥬 게이트 및 E3 효소 결찰에 의해 매개되는 기판 ubiquitylation (E3 리가 제) 1이다. 결과적으로, 특정 단백질의 세포 내 안정성은 유비퀴틴 접합 감수성과 동족 ubiquitylation 효소의 활성을 반영한다.

E3 리가 제는 UPS의 주요 기판 인식 구성 요소입니다. 따라서,이 효소가 없거나 자신의 안정적인 대응이 노출되지 중 하나 그들의 기판 내 degrons을 인식하고 있습니다. 세포주기 m의 예를 들면, 많은 레귤레이터UST 합성 순서 세포주기 진행을 유지하기 위해 시간적으로 특이 적으로 분해 될 수있다. 이러한 단백질의 분해는 종종 세포 시그널링 조절 키나아제에 의해 매개되는 3,4-, 인산화에 의해 제어된다. 반면에, 비정상적으로 접힌 단백질 애매한 degrons 통해 인식된다. 이들은 일반적으로 기본 구조에 숨겨진 구조의 교란에 노출되....

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프로토콜

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1. 세포 배양

  1. 플라스미드의 선택 및 유지를위한 융합 및 (b) 추가의 대사 마커 -degron (a) URA3을 함유하는 플라스미드, 예컨대 Try467 (표 2)와 같은 적절한 영양 요 구성 효모 세포를 변형.
    . NOTE - 효모 전사로부터 유도 degron 적절한 플라스미드의 예는 YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-URA3 (LYS2) (Deg1- UV)이이 Deg1 구성된 융합 단백질을 함유하는 효모 통합 플라스미드이다 요인 Mat2 17 FLAG 에피토프 - 안정적인 ER 단백질 및 URA3 15,18 (그림 3A) - 면역, Vma12에 의해 감지. (본 연구에 적합한 플라스미드의 추가 예제에 사용되는 플라스미드는 표 3을 참조하십시오.)
  2. 플라스미드의 선택과 유지 관리를 위해 정의 적절한 합성에서 한천 플레이트에 세포를 유지는 (SD) 매체는 아미노산 선택 마커 부족 19까지 (예를 들어, Deg1-UV를 선택하고 SD-LYS 선택적 미디어에서 관리됩니다).
  3. 정상기에 도달 할 때까....

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결과

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리포터 기판의 열화 Doa10 경로의 효소의 역할을 조사

그것이 전통적인 분해 분석과 비교 하​​였다 GILS 방법의 유효성을 테스트한다. 이 실험은 ER-막의 성분의 상대적 기여도를 평가 지역화 단백질 품질 관리 리포터 기판 Deg1- VU (도 3A)의 열화에 20,21 복잡한 Doa10 E3-리가. Deg1- VU 플라스미드 야생형 세포 내로 또는 E2 공역 효소 유전자를 결핍 세포 내에 통합 된, UBC7 (ubc7)과 단백질의 안정성이어서 CHX 체이스 분석 (6)에 의해 측정 하였다. 안티 - 플래그의 면역 야생 형 세포 (그림 3B)에 결석 ubc7 세포에서 안정적인 Deg1 -VU 단백질 밴드를 한 것으로 밝혀졌습니다. <.......

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토론

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여기에서 우리는 (GILS) '선택적 조건에서 액체 배양에서 성장 속도론'라고 상대 단백질 분해 속도를 결정하는 세포의 성장을 기반으로 분석을 설명합니다. 그것은 설정하는 간단한 데이터 수집 및 분석은 간단하고 매우 모듈 형 : GILS 분석은 몇 가지 장점이 있습니다. 따라서, 높은 처리량 GILS 애플리케이션을위한 자동화하도록 적응 될 수있는 사용자 친화적 인 멀티 웰 플레이트 형식으로 여러 개의 샘플에 동시에 적용될 수있다. 가장 중요한 것은, GILS는 매우 재현 양적 및 강력한 데이터를 제공하고, 양 / 음 성장을위한 선택 한천 플레이트를 기반으로 성장 분석보다 더 유연하다. 또한, GILS 관련 UPS 성분 또는 degrons의 활성을 반영가 단백질 분해 속도 또는 정상 수준에 작은 변화를 감지 할 수 있다는 점에서 매우 민감하다. 마지막 GILS 분석법은 growt 비교 (<12 시간)이 크게 성장 짧은 기간을 필요한천 플레이트 (일반적으로 2~4일)에 시간 분석.

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공개 사항

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저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

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원고를 비판적으로 검토해 주신 Yuval Reiss 박사님과 William Breuer 박사님, 그리고 Ura3-GFP 스크린 분석 개발에 도움을 주신 Omri Alfassy님께 감사드립니다. 또한 플라스미드 및 균주에 대해 M. Hochstrasser박사와 R. Kulka 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 이스라엘 과학 아카데미(보조금 786/08)와 미국-이스라엘 양국 과학 재단(보조금 2011253)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Difco 효모 질소 베이스 w/o 아미노산 및 황산암모늄BD Biosciences233520SD 최소 매체에서의 효모 성장용.  공급되는 아미노산은 다음과 같습니다 : 아르기닌, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판
황산 암모늄시그마 - 알드리치A4418
포도당시그마 - 알드리치16325
아데닌시그마 - 알드리치A8626
우라실시그마 - 알드리치U0750
최고 아미노산 순도 사용 가능 
96-웰 플레이트Nunc167008다른 호환 가능한 브랜드는
Cyclohexamide를 사용할 수 있습니다 Sigma - AldrichC7698Working conc. 0.5 mg/ml
Infinite 200 PRO 시리즈Tecan효모 배양 및 OD600 측정용. 다른 호환 가능한 온도 제어 리더를 사용할 수 있습니다.
MDTcalc실험용 소프트웨어

참고문헌

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  1. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).
  2. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).....

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URA3E2

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