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방법 논문

단백질 분해의 체계적인 분석을위한 기자 기반의 성장 분석

10.5K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52021

⸱

2014년 11월 6일

 ,  ,  , 
1Department of Biological Chemistry, The Hebrew University of Jerusalem

이 논문에서

요약

여기에서는 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의한 단백질 분해의 상대적 속도를 정량화하기 위한 강력한 생물학적 분석법을 설명합니다. 분석 판독은 액체 배양에서의 효모 성장 속도이며, 이는 필수 대사 마커에 융합된 분해 신호로 구성된 리포터 단백질의 세포 수준에 따라 달라집니다.

초록

유비퀴틴 - 프로 테아 좀 시스템 (UPS)에 의한 단백질 분해는 모든 진핵 생물의 단백질 항상성의 주요 규제 메커니즘입니다. 세포 내 단백질 분해를 결정하는 표준 접근 방식은 단백질 감소의 반응 속도를 다음과 같은 사항에 대해 생화학 적 분석에 의존합니다. 이러한 방법은 종종 시간과 노력이 소요되고 여러 기판 및 분해 조건을 평가하기위한 실험을하는 것이 의무가 없습니다. 대안으로, 세포 성장 기반 분석은 정량적 단백질 수준에서의 상대적인 변화를 결정할 수있는 그들의 종래의 형식, 종점 분석법이다이 개발되고있다.

여기에서 우리는 충실하게 효모 세포 성장 속도론에 결합하여 단백질 분해 속도의 변화를 결정하는 방법을 설명합니다. 방법은 URA3의 우라실 영양 요구 효모 세포 외 인적으로 발현 리포터 단백질에 의해 구출 -deleted 확립 선택 시스템에 기초, 필수적인 URA3 유전자 및 열화 행렬식 (degron) 간의 융합 구성. 리포터 단백질의 분해 속도가 degron 의해 결정되는 반면 그 합성 속도가 일정하게되도록 설계된다. 우라실이 결핍 된 배지에서 세포 성장이 URA3의 상대적 수준에 비례하기 때문에, 성장 속도론은 리포터 단백질 분해에 전적으로 의존한다.

이 방법은 정확하게 세포 내 단백질 분해 반응 속도의 변화를 측정한다. (a) E2 효소 컨쥬 게이트 구조 - 기능 (c) 식별 및 신규 degrons의 특성을 분석하여 단백질 분해 (b)에 공지 유비퀴틴 공역 요인의 상대적 기여도를 평가 : 그것은 적용 하였다. 그것은 또한 다른 세포질 통로의 기능과 연관된 단백질 수준의 변화를 모니터링하도록 구성 될 수 degron- URA3 기반 시스템의 적용은, 단백질 분해 필드를 초월.

서론

유비퀴틴 - 프로 테아 분해 시스템은 모든 진핵 세포에서 단백질의 항상성 유지에 관여한다 주요 조절 시스템이다. UPS는 처음에 폴리 - 유비퀴틴 태그 단백질 26S 프로 테아 좀에 의해 분해 된 후, 표적 단백질에 여러 유비퀴틴 분자 공액. 대부분의 경우, 유비퀴틴 매개 된 분해에 대한 속도 제한 단계가 E2 효소 컨쥬 게이트 및 E3 효소 결찰에 의해 매개되는 기판 ubiquitylation (E3 리가 제) 1이다. 결과적으로, 특정 단백질의 세포 내 안정성은 유비퀴틴 접합 감수성과 동족 ubiquitylation 효소의 활성을 반영한다.

E3 리가 제는 UPS의 주요 기판 인식 구성 요소입니다. 따라서,이 효소가 없거나 자신의 안정적인 대응이 노출되지 중 하나 그들의 기판 내 degrons을 인식하고 있습니다. 세포주기 m의 예를 들면, 많은 레귤레이터UST 합성 순서 세포주기 진행을 유지하기 위해 시간적으로 특이 적으로 분해 될 수있다. 이러한 단백질의 분해는 종종 세포 시그널링 조절 키나아제에 의해 매개되는 3,4-, 인산화에 의해 제어된다. 반면에, 비정상적으로 접힌 단백질 애매한 degrons 통해 인식된다. 이들은 일반적으로 기본 구조에 숨겨진 구조의 교란에 노출되는 지역이다. 이러한 degrons 소수성 도메인 5-7과 본질적으로 무질서 세그먼트 (8)을 포함한다.

망상 적혈구 용 해물 (9)에서 단백질 분해 및 펀더멘털 특성화 유비퀴틴 시스템의 정액 발견 이래, 효모는 유전학 유비퀴틴 시스템 (10)의 많은 구성 요소를 발견하는 수단이되었다. UPS에 의한 단백질 분해에 대한 체계적인 분석 모델 생물로서 효모의 성공은 UPS가 높다는 사실에 주로 기인LY는 실험 시스템으로 그들의 복종 할 의무와 결합, 모든 진핵 생물 4 보존. 실제로, 효모 기반 시스템은 일반적으로 ubiquitylation 기계의 작용 메커니즘을 해독하기 위해 사용된다.

생화학 적 수단에 의한 단백질 분해를 공부하는 것은 일반적으로 세포 추출물의 준비가 필요합니다. 동물 세포 단백질 단백질 상호 작용 및 기능을 보존 비교적 온화한 조건에서 추출 될 수있는 반면, 효모 11 튼튼한 세포벽의 존재는 단백질의 복구에 영향을 미칠 수있는 붕괴 상당히 엄격한 조건이 필요하다. 실제로, 효모 세포 파괴에 대해 서로 다른 절차가 제대로 상대적인 세포 풍부을 나타내는 양 그대로 단백질을 복구하는 능력에 상당히 다릅니다. 또한 부정확 특정 단백질의 분해 속도를 결정하기 위해 사용되는 다양한 방법에 내재 : IM 다음 대사 라벨 기반의 '펄스 체이스'실험munoprecipitation, 특정 단백질 (12)을 분리, 자주 엄격하게 정량적 없습니다. 단백질 분해가이 방법에 의해 비교 될 때 따라서, 특별한주의는 결과를 해석에서 수행되어야한다. 이러한 결점을 회피하기 위해, 대안 사이클로 헥시 미드 (CHX) 체이스 분석은 (12)를 채용 할 수있다. 이 분석에서, 번역 억제제는 이후 모니터되는 세포 배양 및 단백질 정상 상태 수준의 시간 변화에 첨가된다. 그럼에도 불구하고, CHX의 사용은 비교적 짧은 반감기 (<90 분), 단백질 합성의 장기 억제 세포 독성 인 단백질로 한정한다. 특히, 상술 한 분석법 둘 항상 사용할 수없는 단백질 - 특이 적 항체의 사용을 필요로한다.

이러한 기술적 한계를 극복하기 위해, 연구자들은 세포 추출 및 직접 단백질 처리를 필요로하지 않는 여러 가지 방법을 개발했다. 하나의 접근법은 영양 요 참의 확립에 기초필수적인 대사 효소를 코딩하는 유전자의 결실에 의해 얻어진 세인트 균주. 이러한 유전자는 OMP 디카 르 복실 라제를 코딩 HIS3,는 Leu2, LYS2 및 TRP1, 아미노산 생합성에 필요한 효소 부호화뿐만 아니라 URA3 (URA3), 피리 미딘 리보 뉴클레오티드 생합성 필수적인 효소를 포함한다. URA3 광범위 단백질 분해 연구에서 사용되어왔다. 상기 분석에서, URA3의 구성 적 발현이 우라실 - 결핍 배지 13 URA3 세포의 성장을 구출. 따라서, degron의 융합을 통해 URA3를 불안정화하는 최소 배지에 우라실 결핍 세포의 성장을 감소시킬 수있다. 이 방법은 성능 저하의 식별을 포함하여 다양한 단백질 분해 연구에서 5 결정 사용되고, E3는 14 리가 및 보조 ubiquitylation 15 요인과 새로운 UPS의 degrons (16)의 발견. 이 모든 방법은 분석 판독 등의 한천 플레이트에 세포 성장을 고용했다. 그러나, t그 성장 조건 (양 / 음의 성장), 견고하고 효율적인 주로 질적이며 degron의 효능 또는 다양한 보조 열화 요인의 상대적 기여도를 평가하는 것이 중요하다 정량적 정보를 제공하지 않고있다.

따라서 우리는 개발 및 융합 시스템 -degron URA3에 의해 단백질 분해 체계적이고 정량적 인 분석을 가능하게 효모 벡터 및 심사 방법을 활용했다. 프로토콜은 선택적 조건 하에서 액체 배양 (GILS)과 표준 성장 곡선의 생성에 성장 동역학을 측정하기 쉬운 핸들 분석에 기초한다. 지연, 지수 (로그)과 정지상 - 효모 성장 속도론은 세 가지 주요 단계를 특징으로한다. URA3-degron의 발현의 수준에 의해 결정되는 조건 하에서 선택적 로그 단계 동안 효모 복제 동력학 계산, 공평 정량적 측정을 제공 오F 단백질 분해. 이 방법은 측정하고 동시에 다수의 변형 및 다양한 조건 하에서 여러 UPS 기판의 분해율을 비교에 적용될 수있다.

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프로토콜

1. 세포 배양

  1. 플라스미드의 선택 및 유지를위한 융합 및 (b) 추가의 대사 마커 -degron (a) URA3을 함유하는 플라스미드, 예컨대 Try467 (표 2)와 같은 적절한 영양 요 구성 효모 세포를 변형.
    . NOTE - 효모 전사로부터 유도 degron 적절한 플라스미드의 예는 YDpK-MET25p-Deg1-FLAG-Vma12-URA3 (LYS2) (Deg1- UV)이이 Deg1 구성된 융합 단백질을 함유하는 효모 통합 플라스미드이다 요인 Mat2 17 FLAG 에피토프 - 안정적인 ER 단백질 및 URA3 15,18 (그림 3A) - 면역, Vma12에 의해 감지. (본 연구에 적합한 플라스미드의 추가 예제에 사용되는 플라스미드는 표 3을 참조하십시오.)
  2. 플라스미드의 선택과 유지 관리를 위해 정의 적절한 합성에서 한천 플레이트에 세포를 유지는 (SD) 매체는 아미노산 선택 마커 부족 19까지 (예를 들어, Deg1-UV를 선택하고 SD-LYS 선택적 미디어에서 관리됩니다).
  3. 정상기에 도달 할 때까지, 플라스미드 유지를위한 적절한 선택적 SD 배지에서 30 ° C에서 세포 O / N 성장. 샘플 수 (섹션 2) 피검에 따라 테스트 튜브 또는 96- 웰 플레이트에서 세포를 성장.

분석 2. 셀 준비

  1. 샘플의 소수 (N≤15)를 분석 할 때, 세포를 희석하여 다음과 같이 매체를 교체 :
    1. 96 웰 플레이트 (일반 아래)에서 잘 당 SD 매체의 150 μL와 O / N 문화에서 세포의 50 μl를 희석. 빈은 매체를 포함로 첫 번째 샘플이 지정되어 있습니다.
    2. 마이크로 플레이트 리더를 사용하여 96- 웰 플레이트에 샘플의 OD 600의 값을 결정한다.
    3. ㅁ에서 잘 희석 계수 (X4)에 의한 600 OD 판독을 곱하여 각 실제 OD 600 계산빈 독서의 가치를 무형 문화 유산하는 뺀​​다. 맥주 - 램버트 법칙에 따라 1cm의 계산 된 경로 길이를 얻기 위해 0.55으로 나눈 결과 값을 정규화. 표준 96 웰 플레이트에서 세포에 OD 600 200 μl를 측정 할 때,이 값이 일정한 참고.
    4. 0.25 600 OD하고 에펜 도르프 튜브로 전송 상당액에서 효모 세포를 얻기 위해 필요한 정확한 부피를 계산.
    5. 1 분 동안 고속 (12,000 XG)에서 세포를 스핀 다운.
    6. 상등액을 제거하고 적절한 선택 배지 1 ㎖로 세포를 재현 탁 OD에게 0.25 600을 얻었다 (3.1 절 참조).
    7. 96 웰 플레이트에 새 우물에 희석 된 균주의 200 μl를 전송합니다.
  2. 샘플들의 다수 (N> 15)이 테스트 될 때, 다음과 같이, 세포를 희석 전에 OD 600 측정없이 매체를 교체 :
    1. 고정 된 세포의 10 μl를 전송적절한 선택 배지 190 μL (희석 1:20)를 포함하는 새로운 96 웰 플레이트에 96 웰 플레이트에서 자란 O / N (3.1 절 참조).

선택적 조건에서 액체 배양 3. 성장 속도론 (GILS)

  1. URA3-degron 기자를 사용하여 성장 측정을 위해 다음과 같은 용지를 사용하십시오 :
    1. 비 제한 조건에서 효모의 성장, 사용 플라스미드 선택적 SD 미디어의 긍정적 인 컨트롤 (1.2 절 참조). 어떠한 플라스미드의 선택이 필요하지 않은 경우, 예를 들면 Deg1-UV, 필요한 모든 아미노산 (완전한 SD)를 함유하는 SD 배지로 통합 된 플라스미드를 사용하는 경우 사용할 수있다.
    2. 제한적인 조건에서 성장을 측정하는 실험 샘플은, SD-URA 매체를 사용합니다.
  2. 멀티 마이크로 플레이트 리더로 설정 :. 15 분의 30 ° C, 600 OD 측정 간격의 배양 온도, 1 분 매 7 분의 궤도 및 선형 진탕 사이클
    참고 :이 듀얼 모드는 세포의 균일 한 분포를 얻기 위해 최적화 된 진탕; 그러나, 다른 진동 모드 또는 어떠한 흔들림도 작동 할 수 있습니다.
  3. 30 ° C에서 세포를 인큐베이션 마이크로 플레이트 리더 O / N 또는 세포 정지상 (12-24 시간)에 도달 할 때까지.
  4. 스프레드 시트 파일에 원시 데이터를 내 보냅니다.
  5. (; 자세한 내용은 4 절을 참조하십시오 최소 두배 시간 (MDT)) 세포가 인구의 크기를 두 배로 할 MDTcalc, (시간에) 최소한의 시간을 계산하는 사용자 정의 소프트웨어 프로그램을 사용하여 효모의 성장 속도론을 결정합니다.

최소 두배 시간 4. 계산 (MDT) : MDTcalc 알고리즘의 원리

NOTE : MDTcalc 알고리즘의 원리, SD 완전 배지에서 자란 Try467 효모 세포 (표 2)의 대표 샘플을 사용하여이 데이터를 스프레드 시트 및 성장 플롯을 보여주는 표 1 및도 1에 도시되어, 스펙상대적으로.

  1. 웰 샘플에서 얻어진 측정 값 각각으로부터, 각 웰에서 얻어진 OD 600 블랭크 값을 차감한다. 0.55에 의해 얻어진 차이 나눈다 (96 웰 플레이트의 경우)의 광로 길이를 보정한다. 최종 값을 (표 1, 트란스.) 시간에 대하여 플롯 실제 효모 성장 곡선 (OD 600 / 시간) (도 1a)을 생성한다.
  2. 선형 곡선 (도 1B)으로 대수 증식기를 변환하는 변환 된 값 각각에 대한 2 로그 (OD 600)를 계산한다.
  3. (도 1C 표 1, 경사) 10 시간 포인트 간격 (N = 10)는 시간 0에서 시작하여 N <10까지 한 번에 하나의 시간 - 점을 이동의 기울기를 계산한다.
  4. 배로 세포 집단에 필요한 시간 수득 각 슬로프의 역수를 계산 (표 1, 1 / 기울기도 1C). 최소한의 계산1 / 기울기 값은 MDT (; 그림 1C 표 1, 검은 사각형)을 결정합니다. 선택한 시간 간격에서 샘플에서 세포 (표 1, 1 / 기울기, 검은 사각형)에 대한 계산 된 MDT를 추출 (빨간색 사각형으로 설명 표 1, 1B, 1D도).
    NOTE : SD-URA 매체상의 세포 성장 속도는 MDT에 반비례한다.

5. MDTcalc 사용

  1. 컴퓨터의 지정된 폴더로 보충 프로그램 파일을 복사합니다.
  2. 성장 데이터가 포함 된 스프레드 시트 파일이 저장되고 폐쇄되어 있는지 확인합니다. 화면이 나타납니다 시작을 볼 수있는 MDTcalc 응용 프로그램을 엽니 다.
    1. 그림 2에서 입증 된 바와 같이, 필요한 정보를 삽입합니다 :
      1. '파일 경로'에서 스프레드 시트 파일을 찾으려면 오른쪽에있는 사각형을 클릭합니다.
      2. 여기서 t '시트 이름'에서 스프레드 시트 이름을 쓰기그는 원시 데이터가 있습니다.
      3. '시작 위치'에서 스프레드 시트가 첫 번째 샘플의 시간 0의 좌표를 삽입합니다.
      4. '시간 열'에서 시점 컬럼의 위치 (시간은 초 단위로 제공되어야한다) 형성 문자를 삽입한다.
      5. '빈 열'에서 빈 컬럼의 위치를​​ 정의하는 문자 삽입 (보통을하지만, 96 웰 플레이트의 반드시 잘 A1).
      6. 'OD 값'에서 MDT 계산의 시작 (일반적으로 0.15-0.25)에 필요한 최소한의 변형 OD 600 값을 선택합니다. MDT는 정의 된 OD 600 값 이상에 도달 샘플에 대해 계산 될 수 있도록이 값을 설정하면 과도한 희석 지연 단계에서 문화에 대한 MDT의 계산을 방지 할 수 있습니다.
    2. 마지막 값이 입력되면, 화면 하단의 '계산'버튼을 누른다. 오른쪽에 진행 표시 줄이 점차 g로 변경되었는지 확인리엔. 계산 과정에서 스프레드 시트 파일을 열지 마십시오.
    3. 스프레드 시트로 MDT 계산의 완료시 자동으로 화면에 나타나는 두 세트의 데이터 내보내기. (a) 최소 OD 값 (섹션 5.2.1.6에 설정된 바와 같이) 테스트 및 (b) MDT가 산출되는 구간의 초기 시점을 통과하는 각각의 웰에 대한 MDT 값 (시작 : 데이터가 포함되어 있는지 확인 시간).

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결과

리포터 기판의 열화 Doa10 경로의 효소의 역할을 조사

그것이 전통적인 분해 분석과 비교 하​​였다 GILS 방법의 유효성을 테스트한다. 이 실험은 ER-막의 성분의 상대적 기여도를 평가 지역화 단백질 품질 관리 리포터 기판 Deg1- VU (도 3A)의 열화에 20,21 복잡한 Doa10 E3-리가. Deg1- VU 플라스미드 야생형 세포 내로 또는 E2 공역 효소 유전자를 결핍 세포 내에 통합 된, UBC7 (ubc7)과 단백질의 안정성이어서 CHX 체이스 분석 (6)에 의해 측정 하였다. 안티 - 플래그의 면역 야생 형 세포 (그림 3B)에 결석 ubc7 세포에서 안정적인 Deg1 -VU 단백질 밴드를 한 것으로 밝혀졌습니다. <...

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토론

여기에서 우리는 (GILS) '선택적 조건에서 액체 배양에서 성장 속도론'라고 상대 단백질 분해 속도를 결정하는 세포의 성장을 기반으로 분석을 설명합니다. 그것은 설정하는 간단한 데이터 수집 및 분석은 간단하고 매우 모듈 형 : GILS 분석은 몇 가지 장점이 있습니다. 따라서, 높은 처리량 GILS 애플리케이션을위한 자동화하도록 적응 될 수있는 사용자 친화적 인 멀티 웰 플레이트 형식으로 여러 개의 샘플에 동시에 적용될 수있다. 가장 중요한 것은, GILS는 매우 재현 양적 및 강력한 데이터를 제공하고, 양 / 음 성장을위한 선택 한천 플레이트를 기반으로 성장 분석보다 더 유연하다. 또한, GILS 관련 UPS 성분 또는 degrons의 활성을 반영가 단백질 분해 속도 또는 정상 수준에 작은 변화를 감지 할 수 있다는 점에서 매우 민감하다. 마지막 GILS 분석법은 growt 비교 (<12 시간)이 크게 성장 짧은 기간을 필요한천 플레이트 (일반적으로 2~4일)에 시간 분석.

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공개 사항

저자는 공개할 것이 없습니다.

감사의 글

원고를 비판적으로 검토해 주신 Yuval Reiss 박사님과 William Breuer 박사님, 그리고 Ura3-GFP 스크린 분석 개발에 도움을 주신 Omri Alfassy님께 감사드립니다. 또한 플라스미드 및 균주에 대해 M. Hochstrasser박사와 R. Kulka 박사에게 감사드립니다. 이 연구는 이스라엘 과학 아카데미(보조금 786/08)와 미국-이스라엘 양국 과학 재단(보조금 2011253)의 지원을 받았습니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Difco 효모 질소 베이스 w/o 아미노산 및 황산암모늄BD Biosciences233520SD 최소 매체에서의 효모 성장용.  공급되는 아미노산은 다음과 같습니다 : 아르기닌, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 트레오닌, 트립토판
황산 암모늄시그마 - 알드리치A4418
포도당시그마 - 알드리치16325
아데닌시그마 - 알드리치A8626
우라실시그마 - 알드리치U0750
최고 아미노산 순도 사용 가능 
96-웰 플레이트Nunc167008다른 호환 가능한 브랜드는
Cyclohexamide를 사용할 수 있습니다 Sigma - AldrichC7698Working conc. 0.5 mg/ml
Infinite 200 PRO 시리즈Tecan효모 배양 및 OD600 측정용. 다른 호환 가능한 온도 제어 리더를 사용할 수 있습니다.
MDTcalc실험용 소프트웨어

참고문헌

  1. Hershko, A., Ciechanover, A. The ubiquitin system. Annual review of biochemistry. 67, 425-479 (1998).
  2. Ravid, T., Hochstrasser, M. Diversity of degradation signals in the ubiquitin-proteasome system. Nature reviews. Molecular cell biology. 9, 679-689 (2008).
  3. Willems, A. R., et al. SCF ubiquitin protein ligases and phosphorylation-dependent proteolysis. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 354, 1533-1550 (1999).
  4. Tyers, M., Jorgensen, P. Proteolysis and the cell cycle: with this RING I do thee destroy. Curr Opin Genet Dev. 10, 54-64 (2000).
  5. Johnson, P. R., Swanson, R., Rakhilina, L., Hochstrasser, M. Degradation signal masking by heterodimerization of MATα2 and MAT a1 blocks their mutual destruction by the ubiquitin-proteasome pathway. Cell. 94, 217-227 (1998).
  6. Furth, N., et al. Exposure of bipartite hydrophobic signal triggers nuclear quality control of Ndc10 at the endoplasmic reticulum/nuclear envelope. Molecular Biology of the Cell. 22, 4726-4739 (2011).
  7. Fredrickson, E. K., Gallagher, P. S., Clowes Candadai, S. V., Gardner, R. G. Substrate recognition in nuclear protein quality control degradation is governed by exposed hydrophobicity that correlates with aggregation and insolubility. J Biol Chem. 10, (2013).
  8. Rosenbaum, J. C., et al. Disorder Targets Misorder in Nuclear Quality Control A Disordered Ubiquitin Ligase Directly Recognizes Its Misfolded Substrates. Molecular cell. 41, 93-106 (2011).
  9. Ciechanover, A., Hod, Y., Hershko, A. A heat-stable polypeptide component of an ATP-dependent proteolytic system from reticulocytes. Biochemica., & Biophysical Research Communications. 81, 1100-1105 (1978).
  10. Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 192, 319-360 (2012).
  11. Klis, F. M., Boorsma, A., De Groot, P. W. Cell wall construction in Saccharomyces cerevisiae. Yeast. 23, 185-202 (2006).
  12. Zhou, W., Ryan, J. J., Zhou, H. Global analyses of sumoylated proteins in Saccharomyces cerevisiae. Induction of protein sumoylation by cellular stresses. J Biol Chem. 279, 32262-32268 (2004).
  13. Alani, E., Kleckner, N. A new type of fusion analysis applicable to many organisms: protein fusions to the URA3 gene of yeast. Genetics. 117, 5-12 (1987).
  14. Swanson, R., Locher, M., Hochstrasser, M. A conserved ubiquitin ligase of the nuclear envelope/endoplasmic reticulum that functions in both ER-associated and Matalpha2 repressor degradation. Genes Dev. 15, 2660-2674 (2001).
  15. Ravid, T., Kreft, S. G., Hochstrasser, M. Membrane and soluble substrates of the Doa10 ubiquitin ligase are degraded by distinct pathways. EMBO J. 25, 533-543 (2006).
  16. Gilon, T., Chomsky, O., Kulka, R. G. Degradation signals for ubiquitin system proteolysis in Saccharomyces cerevisiae. Embo J. 17, 2759-2766 (1998).
  17. Hochstrasser, M., Varshavsky, A. In vivo degradation of a transcriptional regulator: the yeast 2 repressor. Cell. 61, 697-708 (1990).
  18. Metzger, M. B., Maurer, M. J., Dancy, B. M., Michaelis, S. Degradation of a cytosolic protein requires endoplasmic reticulum-associated degradation machinery. J Biol Chem. 283, 32302-32316 (2008).
  19. Guthrie, C., Fink, G. R. Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology. 194, Academic Press. (1991).
  20. Carvalho, P., Goder, V., Rapoport, T. A. Distinct ubiquitin-ligase complexes define convergent pathways for the degradation of ER proteins. Cell. 126, 361-373 (2006).
  21. Denic, V., Quan, E. M., Weissman, J. S. A luminal surveillance complex that selects misfolded glycoproteins for ER-associated degradation. Cell. 126, 349-359 (2006).
  22. Wu, P. Y., et al. A conserved catalytic residue in the ubiquitin-conjugating enzyme family. Embo J. 22, 5241-5250 (2003).
  23. Boeke, J. D., Trueheart, J., Natsoulis, G., Fink, G. R. 5-Fluoroorotic acid as a selective agent in yeast molecular genetics. Methods Enzymol. 154, 164-175 (1987).
  24. Alfassy, O. S., Cohen, I., Reiss, Y., Tirosh, B., Ravid, T. Placing a disrupted degradation motif at the C terminus of proteasome substrates attenuates degradation without impairing ubiquitylation. J Biol Chem. 288, 12645-12653 (2013).
  25. Cronin, S. R., Hampton, R. Y. Measuring protein degradation with green fluorescent protein. Methods in Enzymology. 302, 58-73 (1999).

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