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방법 논문

쥐과 배아의 레트로 바이러스 감염은 조혈 분화 분석을위한 세포 유래 배아 바디 줄기 세포

8.3K 조회수

⸱

DOI:

10.3791/52022

⸱

2014년 10월 20일

 ,  ,  , 
1Harper Cancer Research Institute, 2Microbiology and Immunology, Indiana University School of Medicine, 3Department of Biological Sciences, University of Notre Dame

이 논문에서

요약

배아줄기세포(ESC)를 분화할 때 시간적 유전자 발현을 조작하는 것은 유도성 유전자 시스템을 사용하여 달성할 수 있습니다. 그러나 이러한 세포주를 생성하는 데는 비용과 시간이 많이 듭니다. 이 프로토콜은 ES 유래 세포를 분화시키고 다운스트림 조혈 분화에 대한 후속 분석에서 전이유전자의 빠른 발현을 달성합니다.

초록

배아줄기세포(ESC)는 세포 분화의 분자 메커니즘을 밝히는 데 탁월한 모델입니다. 이들은 초기 조혈전구세포(HPC)의 발달을 조사하는 데 특히 유용합니다. 배아줄기세포의 유전자 발현은 발달 과정에서 개별 분자의 역할을 결정할 수 있는 여러 기술에 의해 조작될 수 있습니다. 한 가지 어려움은 특정 유전자의 발현이 종종 시간적 발현에 따라 다른 표현형 효과를 갖는다는 것입니다. 이 문제는 독시사이클린 유도성 전이유전자 시스템(doxycycline-inducible transgene system)과 같은 기술을 사용하여 관심 유전자를 유도적으로 발현하는 배아줄기세포(ESC)를 생성함으로써 우회할 수 있습니다. 그러나 이러한 유도 세포주를 생성하는 데는 비용과 시간이 많이 듭니다. 여기에서는 ESC-유래 배아체(EBs)를 단세포 현탁액으로 세분화하고, 세포 현탁액을 소급하여 감염시킨 후, 행잉드롭(hanging drop)에 의해 EB를 재형성하는 방법을 설명한다. 그런 다음 downstream 분화는 유세포 분석으로 평가됩니다. 이 프로토콜을 사용하여 배아줄기세포 분화 초기에 microRNA 유전자의 외인성 발현이 HPC 생성을 차단한다는 것을 입증했습니다. 그러나 초기 중배엽이 생성된 후 EB 유래 세포에서 발현될 때 microRNA 유전자는 조혈 분화를 향상시킵니다. 이 방법은 특정 생식층 조직이 유도된 후 유전자의 역할을 조사하는 데 유용합니다.

서론

쥐 배아 줄기 세포(ESC)는 만능성이며, 사이토카인 백혈병 억제 인자(LIF)가 있는 상태에서 미분화 상태로 유지되고 자가 재생됩니다1. LIF가 제거되면 배아체(embryoid body, EB)2라고 하는 3차원(3D) 구조로 자발적으로 분화합니다. 3D 구조는 외배엽, 내배엽 및 중배엽의 세 가지 배아층의 발달을 가능하게 하며, 나중에 성숙한 조직 유형3을 생성합니다. 배아줄기세포세포(ESC)는 세포 분화의 분자 메커니즘, 특히 초기 조혈전구세포(HPC)의 발달에 대한 연구를 규명하기 위한 탁월한 모델입니다4.

배아줄기세포의 유전자 발현은 발달 시 개별 분자의 역할을 결정할 수 있는 여러 기술에 의해 조작될 수 있습니다. 가장 일반적인 기술 중 하나는 상동 재조합을 사용하여 관심 유전자가 없는 배아줄기세포주를 생성하는 것입니다5,6. 유전자를 과발현하는 데 사용된 여러 가지 기술도 있습니다. 배아줄기세포에서 유전자 발현을 변형하는 데 사용된 첫 번째 기술은 재조합 레트로바이러스7,8로 감염시키는 것이었습니다. 그러나 관심 유전자는 배아줄기세포(ESC)가 전구세포형(progenitor)형과 성숙세포형(mature cell type)으로 분화함에 따라 종종 침묵을 지킵니다. 렌티바이러스의 사용은 바이러스로 발현된 유전자의 침묵을 제한하는 데 성공적이었다9. 과발현에 사용되는 다른 바이러스 벡터로는 아데노바이러스와 아데노 관련 바이러스10이 있습니다. 또한, 발현 플라스미드를 안정적으로 도입하기 위한 표준 transfection 기술이 ESC transgene 발현에 널리 사용됩니다11. 이러한 시스템의 한 가지 어려움은 특정 유전자의 발현이 종종 시간적 발현에 따라 다른 효과를 갖는다는 것입니다. 예를 들어, Smad1 단백질은 EB 발달의 여러 단계에서 조혈 세포의 발달에 다르게 영향을 미칩니다12,13.

이 문제는 관심 유전자를 유도적으로 발현하는 ESC의 생성에 의해 우회될 수 있습니다. 배아줄기세포에서 전이유전자를 유도적으로 발현하는 가장 일반적인 시스템은 대장균(Escherichia coli)의 테트라사이클린 저항성 오페론을 사용합니다. 여러 가지 다른 테트라사이클린 시스템이 개발되었습니다. 가장 인기 있는 전략 중 하나는 Kyba와 동료들에 의해 개발되었다14. 그들은 구조적으로 활성화된 ROSA26 유전자 자리에 역 테트라사이클린 트랜스액티베이터 유전자가 삽입된 ESC 라인(Ainv15)을 생성했습니다. 테트라사이클린 반응 요소(TETRACYCLINE response element, TRE), 다운스트림 LoxP 부위(박테리오파지 P1에서 X-over P1의 궤적) 및 프로모터리스 네오마이신 카세트를 X 염색체의 HPRT(Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase) 자리에 도입했습니다. CRE 재조합 접근법을 사용하여 네오마이신 저항성 유전자의 발현을 유도하는 진핵 생물 프로모터와 함께 관심 유전자를 LoxP 부위에 삽입할 수 있습니다. 올바르게 표적화된 ESC는 G418 선택에 의해 격리됩니다. 그런 다음 이러한 표적 클론을 전이유전자의 독시사이클린(또는 테트라사이클린) 유도성 발현에 대해 테스트해야 합니다. 이 접근 방식은 HoxB4, Stat5, SCL 및 Smad714-17을 유도적으로 표현하는 ESC 라인을 성공적으로 생성했습니다. 그러나 이러한 유도성 세포주를 생성하는 데는 시간이 많이 걸립니다. 여기에서는 ESC 유래 배아체(EB)를 단일 세포 현탁액으로 분해하고, 다른 발달 일에서 세포 현탁액을 소급하여 감염시킨 다음, 행잉 드롭(hanging drop)으로 EB를 재형성하는 방법을 설명합니다. 다운스트림 분화는 나중에 유세포 분석으로 평가됩니다. 이 논문에서는 EB 유래 세포에서 miRNA 발현이 조혈 분화에 미치는 영향에 대한 예를 보여줍니다. 이 방법은 특정 생식층 조직이 유도된 후 유전자의 역할을 조사하는 데 유용합니다.

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프로토콜

1 배아 바디 (EB) 형성

  1. 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)에 유지 된 ESCS을 젤라틴 - 적응. 통로 ESCS MEFs을 제거하기 위해 0.1 % 젤라틴으로 코팅 여섯 잘 조직 배양 접시에 세 번.
    1. (표 1) 미분화 세포를 유지하기 위해 함께 LIF ESC 유지 매체를 세포 성장. 확인 세포가 결코 80 %의 합류를 초과하지합니다. 분화 세포 (MEFs에서 제거한 후 10 이하 통로) 낮은 통로를 사용합니다.
  2. ESCS는 EB의 분화 배양되기 전에 날, 통로 세포는 그래서 그들은 약 50-70% 합류 다음 날이 될 것입니다. 세포의 다 능성을 유지하는 ESC 유지 배지에서 세포 배양을 계속한다.
  3. 6 웰 플레이트 잘 당 : 분화, 흡인 ESC 유지 보수 매체와의 일에 1 ㎖의 인산염 완충 생리 식염수 (137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 11.9 mM의 인산염 완충액 pH 7.4의 PBS)으로 씻는다.
    1. 0.25 %의 tryps의 200 μl를 추가/ 각 EDTA 잘에서 3 분 동안 37 ° C에서 배양한다.
    2. 차별화 매체의 800 μL와 트립신 / EDTA를 비활성화합니다. 피펫 위아래 P200 팁 2 ㎖의 혈청 학적 피펫에서 휴식 - 최대 세포를 단일 세포 현탁액으로. 미디어 피펫 팁 인터페이스 사이에 이동되지 않도록 P200 팁 끝에 딱 맞는 있는지 확인합니다.
    3. 피펫은 위아래로 약 5 ~ 10 배. 피펫 팅하는 동안 거품을 만들 않도록주의하십시오.
  4. 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. PBS 10 ML에 볼륨을 가져와. 실온에서 5 분 동안 315 XG에 원심 분리기.
  5. 상층 액을 제거합니다. LIF를 포함 남은 용지를 제거하는 5 ㎖의 PBS로 두 번 세척 할 것. 각 세척 단계와 1.4에서와 같이 원심 분리기.
    1. 분화 매체 (표 2) 2 ㎖의 최종 세포 펠렛을 재현 탁.
  6. 혈구 또는 셀 카운터 세포를 세어 10cm 페트리 접시에 6,000-10,000 세포 / ml를 판(비 조직 배양 치료).
    1. 각 ESC 라인에 대한 경험적으로 정확한 세포 / ml를 결정합니다. 일반적으로 세균 작업 또는 낮은 부착 판에 사용되는 멸균 페트리 접시를 사용합니다.
      주 : 최상의 차별화 결과, 사채가 판에 연결하지 않고도 정지에 남아있는 구체를 형성해야한다. 최소한의 준수와 사람을 찾기 위해 판의 여러 브랜드를 테스트합니다.
    2. 5 % CO 2와 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 차별화 ESCS을 품어.
시약 주식 최종 농도 볼륨 회사 카탈로그 번호
DMEM 1 배 410 ml의 S IGMA / 알드리치 D5796
FBS (ES 선별) 백퍼센트 15 % 75 ML Hyclone SH30070.03E
비 필수 아미노산 100 배 1 배 5 ML Life 기술 11140
L-글루타민 100 배 1 배 5 ML Life 기술 35050
Penncillin / 스트렙토 마이신 100 배 1 배 5 ML Life 기술 15070
β-머 캅토 에탄올 14.3 M 114 μM 4 μL 시그마 / 알드리치 M3148
백혈병 억제 인자 (LIF) 10 7 단위 / ㎖ 1,000 개 / ㎖ 50 μL 밀리 포아 ESG1107
"ontent> 표 1 : ESC 유지 미디어.

시약 주식 최종 농도 볼륨 회사 카탈로그 번호
DMEM 1 배 410 ml의 시그마 / 알드리치 D5796
FBS (사용자가 최적의 차별화에 대한 검사) 백퍼센트 15 % 75 ML Hyclone SH30070.03E
비 필수 아미노산 100 배 1 배 5 ML Life 기술 11140
L-글루타민 100 배 1 배 5 ML 생활 TECHNOLOGIES 35050
Penncillin / 스트렙토 마이신 100 배 1 배 5 ML Life 기술 15070
β-머 캅토 에탄올 14.3 M 114 μM 4 μL 시그마 / 알드리치 M3148

표 2 : 차별화 미디어.

바이러스 감염에 대한 2 준비 EB 세포

  1. 개발의 원하는 단계에서 (일 2 일 3 사이), 15 ML 원뿔 관에 10cm 페트리 접시에서 교환 사채를 전송합니다. 5 ㎖의 PBS로 접시를 씻고 원뿔 튜브에 세척을 추가합니다.
  2. 5 분 동안 실온에서 315 XG에 사채 펠렛. 5 ㎖의 PBS와 EB 세포를 씻으십시오.
  3. 해동 세포 분리 솔루션 (포함하는 단백질 분해 및 collagenolytic 효소) 1 ㎖를 추가하고 OCC 30 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 튜브 (또는 창업)을 배치(플릭 또는 빛 소용돌이로 교반부터) asional 교반.
  4. 차별화 미디어의 한 ML을 추가합니다. 상하 피펫 P200 피펫 팁 2ml를 피펫으로. 30 ~ 60 분 동안 다시 37 ° C의 물을 욕조에 튜브를 놓습니다.
  5. 5 분 동안 315 XG에서 세포를 스핀 다운 및 PBS로 세포를 씻어.

3 바이러스 감염

  1. 분화 매체의 1.5 ml의 세포를 재현 탁. 6 잘 아닌 조직 문화 처리 플레이트에 세포 현탁액을 전송합니다.
  2. 미리의 표준 기술에 의해 레트로 바이러스를 준비합니다. 바이러스 역가에 따라 세포에 바이러스 뜨는 5-100 μl를 추가합니다. 이 사채의 후속 개혁을 억제로 감염을 향상시키기 위해 폴리 브렌를 추가하지 마십시오.
  3. 실온에서 90 분 동안 2,120 XG에서 원심 분리하여 바이러스와 세포를 Spinoculate.

4 매달려 방울에 바이러스 성 감염 EB 세포 차별화

  1. 난의 각 웰에 차별화 미디어의 두 ML을 추가nfected EB 세포 현탁액.
  2. 피펫 multipipettors에 대한 멸균 시약 저수지에 감염된 EB 세포 현탁액의 3.5 ML. 팔 20 μL의 15 ~ 20 행 15cm 페트리 접시의 반전 뚜껑에 방울을 피펫하는 multipipettor를 사용합니다.
  3. 페트리 접시의 아래쪽에 멸균 PBS 또는 물 10ml를 추가합니다. 그런 다음 페트리 접시에 방울과 장소 뚜껑을 반전. 방울 챔버 가습 유지하기 위해 거꾸로 PBS 이하 물 뚜껑 매달려되어 있는지 확인합니다.
  4. 5.0 %의 CO 2와 37 ° C 조직 문화 인큐베이터에서 접시를 놓습니다.
  5. 이일 후, 차별화 미디어의 4.5 ml의 뚜껑을 세척 반전에 의해 삭제 교수형에 형성 사채를 수집합니다.
    1. 새 10cm가 아닌 조직 배양 페트리 접시로 전송 미디어 및 사채. 차별화 미디어와 10cm 플레이트로 전송의 3 ㎖로 한 번 뚜껑을 세척 할 것.
  6. 세포 계측법 (8)의 총 후 흐름에 의한 분석을위한 수확 세포차별화 미디어 (-LIF)에 대한 세포의 초기 전송부터 일 문화.

흐름 사이토 분석을위한 5 준비 셀

  1. 10 ml의 피펫과 15 ML 원뿔 튜브에 세포를 전송합니다. 5 ㎖의 PBS로 접시를 씻고 같은 원뿔 튜브로 전송할 수 있습니다.
  2. 315 X g에서 펠렛 세포. 10 ml의 PBS와 펠렛을 씻으십시오.
  3. 해동 세포 분리 용액 1 ㎖를 추가하고 가끔 교반과 함께 30 분 동안 37 ° C의 물을 욕조에 튜브를 배치합니다. 일부 세포 표면 항원의 검출을 위해, 트립신이 대신 사용될 수있다.
  4. 1 ml의 차별화 미디어를 추가하고 최대 피펫 및 2 ml의 피펫과 함께 아래로. 도와 피펫의 끝 P200 팁을 사용하여 해체 단일 세포 현탁액으로 EB 소화.
    1. 세포막 단백질을 세포 표면에 재활용하기 위해서는 60 분 동안 다시 37 ° C의 물을 욕조에 튜브를 놓습니다.
  5. 5 분 동안 315 XG에서 세포 펠렛.
  6. 세포 위스콘신 씻으일 0.1 % 소 혈청 알부민 분수 PBS (PBS / BSA)에서 제조 한 V (BSA)와 특정과 세포를 배양는 형광 항체를 태그.

조혈 전구 세포에 대한 6 유동 세포 계측법 분석

  1. 5 ㎖의 12 × 75 라운드 MM 하단 튜브에 열 여섯 EB 파생 된 세포를 놓습니다. 보상 설정 사이토 흐름을 조절하기위한, 제조사의 지시에 따라 보상 비드를 사용한다.
  2. 315 X g에서 펠렛 세포. 튜브 잔류 PBS / BSA 용액에 뜨는에 resuspend 펠렛을 붓고.
  3. ESC의 HPC를 검출, 형광 표지 된 항체와 세포를 배양 : 항 - 마우스 CD41-PE (R-Phycoerytherin) 및 항 - 마우스 CD117 (cKit) -APC / CY7 (알로 피코시 아닌 7).
    1. 항체 1을 희석 : PBS / BSA 100을. 각 샘플에 희석 항체의 100 μl를 추가합니다. 각 공급 업체, 복제, 로트 또는 항체에 대한 항체의 정확한 희석을 결정합니다. 개별적으로 세포를 라벨에 대한 최적의 희석을 결정합니다.
  4. 30 분 동안 어둠 속에서 얼음에 샘플을 품어.
  5. 5 분 동안 315 XG에 2 ㎖의 PBS / BSA 및 펠릿 세포를 추가합니다.
  6. 기음 상층 액 300 ㎕의 PBS 또는 다른 등장 버퍼에 resuspend 펠렛.
  7. 셀 스트레이너 캡 (0.35 μM)를 통해 필터 재현 탁 세포 대 세포 집합체를 제거합니다.
  8. 플로우 사이토에 세포를 분석 할 수 있습니다.

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결과

RW4을 젤라틴이 연구에서 사용 된 ESCS (129X1 / SVJ 마우스 변형에서 파생). 교환 사채는 차별화 삼일에 고립되었다. 최상의 결과를 위해 사채는 구형 및 비 부착 (그림 1A, B)해야한다. 바이러스가 관심의 유전자와 함께 형광 마커 GFP를 공동으로 표현하는 spinoculation 후, 교환 사채는 매달려 드롭 방식으로 개혁되었다. 사채 성공적 2.0, 2.5, 및 3.0 일 사채로부터 제조 세포 현탁액으로부터 개질 하였다. 그러나 사채는 일 4.0 사채로부터 제조 된 세포 현탁액에서 개혁 할 수 없습니다. 감염과 감염되지 않은 세포 사이 사채의 키메라 비율은 분화의 8 일 (도 2A, B)로 형광 현미경으로 관찰 하였다. 사채의 밀도는 종종 사채 100 % GFP 양성으로 나타날 수있다. 그러나, 다른 초점면에 포커싱하면 사채 (도 2B)로 GFP 양성 및 음성 세포의 기여를 밝힐 수있다.

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토론

상술 한 바와 같이, inducibly 관심 유전자를 발현 ESC 클론 독시사이클린 시스템을 사용하여 생성 될 수 있지만,이 라인의 생성 시간 소모적이고 노동 집약적이다. 이 프로토콜에서 설명하는 교환 사채 파생 ESC로부터 제조 된 단일 세포 현탁액에 대한 관심의 유전자를 표현하는 방법이다. 이 감염된 세포는 이후의 차별화를 검사 할 수 드롭을 걸어서 사채로 개편된다. 예를 (그림 3)에서는 차별화의 일 3 발현 때 mirn23a 클러스터의 표현 조혈 개발을 향상 표시됩니다. 이 시점에서 초기 배아 층 조직의 발달은 혈액 전구 세포를 일으킨다 이른 중배엽 포함 발생했습니다. RW4 ESC 분화 (PAX6), 내배엽 (FoxA2), 중배엽 (T, 트위스트, 그리고 Tbx6가) (Q-RT-PCR, 데이터하지 정량적 역전사 효소 PCR에 의해 감지 외배엽을 나타내는 유전자의 발현 일 2 및 3에서 참조). 마일을 위해rn23a는 HPC의 생산을 향상시키기 위해, 조기 ...

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공개 사항

저자는 공개 경쟁 금융 이익을 더이 없습니다.

감사의 글

이 연구는 분자 혈액학 우수성을 위한 인디애나 대학교 의과대학 센터(IUSM)의 파일럿 및 타당성 보조금(NIDDK, 5P30DK090948)의 지원을 받았습니다. 추가 자금은 IUSM의 Biomedical Enhancement Grant에서 제공되었습니다. 원고에 대해 논평해 주신 Karen Cowden Dahl 박사에게 감사드립니다.

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
DMEMSigma/AldrichD5796
β-메르캅토에탄올Sigma/AldrichM3148
FBS(ES 스크리닝)HycloneSH30070.03E
FBS(정의)HycloneSH30070.03
Non-essential Amino AcidsLife Technologies11140
L-글루타민생명 기술35050
Penn/StrepLife Technologies15070
Trypsin/EDTALife Technologies25200
LIF ESGROMilliporeESG1107
ACCUMAXMilliporeSCR006
Trypsin/EDTALife Technologies25200
Falcon Tissue Culture Plate 6- wellFisher Scientific08-772-1B
팔콘 무처리 플레이트 6-wellFisher Scientific08-772-49
팔콘 페트리 접시 10cmFisher Scientific08-757-100D
팔콘 페트리 접시 15cmFisher Scientific08-757-148
팔콘 튜브 5mlFisher Scientific14-959-11A
팔콘 튜브 5 ml 셀 스트레이너 캡 포함Fisher Scientific08-771-23
흰색 멸균 resevoirsU.S.A. Scientific111-0700
쥐 안티 마우스 CD41 PE 결합Biolegend133906
쥐 안티 마우스 CD117 APC/CY7Biolegend105826
RW4 ESCATCCCRL-12418
결합

참고문헌

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