배아줄기세포(ESC)를 분화할 때 시간적 유전자 발현을 조작하는 것은 유도성 유전자 시스템을 사용하여 달성할 수 있습니다. 그러나 이러한 세포주를 생성하는 데는 비용과 시간이 많이 듭니다. 이 프로토콜은 ES 유래 세포를 분화시키고 다운스트림 조혈 분화에 대한 후속 분석에서 전이유전자의 빠른 발현을 달성합니다.
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이 논문에서
요약
초록
배아줄기세포(ESC)는 세포 분화의 분자 메커니즘을 밝히는 데 탁월한 모델입니다. 이들은 초기 조혈전구세포(HPC)의 발달을 조사하는 데 특히 유용합니다. 배아줄기세포의 유전자 발현은 발달 과정에서 개별 분자의 역할을 결정할 수 있는 여러 기술에 의해 조작될 수 있습니다. 한 가지 어려움은 특정 유전자의 발현이 종종 시간적 발현에 따라 다른 표현형 효과를 갖는다는 것입니다. 이 문제는 독시사이클린 유도성 전이유전자 시스템(doxycycline-inducible transgene system)과 같은 기술을 사용하여 관심 유전자를 유도적으로 발현하는 배아줄기세포(ESC)를 생성함으로써 우회할 수 있습니다. 그러나 이러한 유도 세포주를 생성하는 데는 비용과 시간이 많이 듭니다. 여기에서는 ESC-유래 배아체(EBs)를 단세포 현탁액으로 세분화하고, 세포 현탁액을 소급하여 감염시킨 후, 행잉드롭(hanging drop)에 의해 EB를 재형성하는 방법을 설명한다. 그런 다음 downstream 분화는 유세포 분석으로 평가됩니다. 이 프로토콜을 사용하여 배아줄기세포 분화 초기에 microRNA 유전자의 외인성 발현이 HPC 생성을 차단한다는 것을 입증했습니다. 그러나 초기 중배엽이 생성된 후 EB 유래 세포에서 발현될 때 microRNA 유전자는 조혈 분화를 향상시킵니다. 이 방법은 특정 생식층 조직이 유도된 후 유전자의 역할을 조사하는 데 유용합니다.
서론
쥐 배아 줄기 세포(ESC)는 만능성이며, 사이토카인 백혈병 억제 인자(LIF)가 있는 상태에서 미분화 상태로 유지되고 자가 재생됩니다1. LIF가 제거되면 배아체(embryoid body, EB)2라고 하는 3차원(3D) 구조로 자발적으로 분화합니다. 3D 구조는 외배엽, 내배엽 및 중배엽의 세 가지 배아층의 발달을 가능하게 하며, 나중에 성숙한 조직 유형3을 생성합니다. 배아줄기세포세포(ESC)는 세포 분화의 분자 메커니즘, 특히 초기 조혈전구세포(HPC)의 발달에 대한 연구를 규명하기 위한 탁월한 모델입니다4.
배아줄기세포의 유전자 발현은 발달 시 개별 분자의 역할을 결정할 수 있는 여러 기술에 의해 조작될 수 있습니다. 가장 일반적인 기술 중 하나는 상동 재조합을 사용하여 관심 유전자가 없는 배아줄기세포주를 생성하는 것입니다5,6. 유전자를 과발현하는 데 사용된 여러 가지 기술도 있습니다. 배아줄기세포에서 유전자 발현을 변형하는 데 사용된 첫 번째 기술은 재조합 레트로바이러스7,8로 감염시키는 것이었습니다. 그러나 관심 유전자는 배아줄기세포(ESC)가 전구세포형(progenitor)형과 성숙세포형(mature cell....
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프로토콜
1 배아 바디 (EB) 형성
- 마우스 배아 섬유 아 세포 (MEFs)에 유지 된 ESCS을 젤라틴 - 적응. 통로 ESCS MEFs을 제거하기 위해 0.1 % 젤라틴으로 코팅 여섯 잘 조직 배양 접시에 세 번.
- (표 1) 미분화 세포를 유지하기 위해 함께 LIF ESC 유지 매체를 세포 성장. 확인 세포가 결코 80 %의 합류를 초과하지합니다. 분화 세포 (MEFs에서 제거한 후 10 이하 통로) 낮은 통로를 사용합니다.
- ESCS는 EB의 분화 배양되기 전에 날, 통로 세포는 그래서 그들은 약 50-70% 합류 다음 날이 될 것입니다. 세포의 다 능성을 유지하는 ESC 유지 배지에서 세포 배양을 계속한다.
- 6 웰 플레이트 잘 당 : 분화, 흡인 ESC 유지 보수 매체와의 일에 1 ㎖의 인산염 완충 생리 식염수 (137 mM의 염화나트륨, 2.7 밀리미터의 KCl, 11.9 mM의 인산염 완충액 pH 7.4의 PBS)으로 씻는다.
- 0.25 %의 tryps의 200 μl를 추가/ 각 EDTA 잘에서 3 분 동안 37 ° C에서 배양한다.
- 차별화 매체의 800 μL와 트립신 / EDTA를 비활성화합니다. 피펫 위아래 P200 팁 2 ㎖의 혈청 학....
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결과
RW4을 젤라틴이 연구에서 사용 된 ESCS (129X1 / SVJ 마우스 변형에서 파생). 교환 사채는 차별화 삼일에 고립되었다. 최상의 결과를 위해 사채는 구형 및 비 부착 (그림 1A, B)해야한다. 바이러스가 관심의 유전자와 함께 형광 마커 GFP를 공동으로 표현하는 spinoculation 후, 교환 사채는 매달려 드롭 방식으로 개혁되었다. 사채 성공적 2.0, 2.5, 및 3.0 일 사채로부터 제조 세포 현탁액으로부터 개질 하였다. 그러나 사채는 일 4.0 사채로부터 제조 된 세포 현탁액에서 개혁 할 수 없습니다. 감염과 감염되지 않은 세포 사이 사채의 키메라 비율은 분화의 8 일 (도 2A, B)로 형광 현미경으로 관찰 하였다. 사채의 밀도는 종종 사채 100 % GFP 양성으로 나타날 수있다. 그러나, 다른 초점면에 포커싱하면 사채 (도 2B)로 GFP 양성 및 음성 세포의 기여를 밝힐 수있다.
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토론
상술 한 바와 같이, inducibly 관심 유전자를 발현 ESC 클론 독시사이클린 시스템을 사용하여 생성 될 수 있지만,이 라인의 생성 시간 소모적이고 노동 집약적이다. 이 프로토콜에서 설명하는 교환 사채 파생 ESC로부터 제조 된 단일 세포 현탁액에 대한 관심의 유전자를 표현하는 방법이다. 이 감염된 세포는 이후의 차별화를 검사 할 수 드롭을 걸어서 사채로 개편된다. 예를 (그림 3)에서는 차별화의 일 3 발현 때 mirn23a 클러스터의 표현 조혈 개발을 향상 표시됩니다. 이 시점에서 초기 배아 층 조직의 발달은 혈액 전구 세포를 일으킨다 이른 중배엽 포함 발생했습니다. RW4 ESC 분화 (PAX6), 내배엽 (FoxA2), 중배엽 (T, 트위스트, 그리고 Tbx6가) (Q-RT-PCR, 데이터하지 정량적 역전사 효소 PCR에 의해 감지 외배엽을 나타내는 유전자의 발현 일 2 및 3에서 참조). 마일을 위해rn23a는 HPC의 생산을 향상시키기 위해, 조기 .......
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공개 사항
저자는 공개 경쟁 금융 이익을 더이 없습니다.
감사의 글
이 연구는 분자 혈액학 우수성을 위한 인디애나 대학교 의과대학 센터(IUSM)의 파일럿 및 타당성 보조금(NIDDK, 5P30DK090948)의 지원을 받았습니다. 추가 자금은 IUSM의 Biomedical Enhancement Grant에서 제공되었습니다. 원고에 대해 논평해 주신 Karen Cowden Dahl 박사에게 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| DMEM | Sigma/Aldrich | D5796 | |
| β-메르캅토에탄올 | Sigma/Aldrich | M3148 | |
| FBS(ES 스크리닝) | Hyclone | SH30070.03E | |
| FBS(정의) | Hyclone | SH30070.03 | |
| Non-essential Amino Acids | Life Technologies | 11140 | |
| L-글루타민 | 생명 기술 | 35050 | |
| Penn/Strep | Life Technologies | 15070 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| LIF ESGRO | Millipore | ESG1107 | |
| ACCUMAX | Millipore | SCR006 | |
| Trypsin/EDTA | Life Technologies | 25200 | |
| Falcon Tissue Culture Plate 6- well | Fisher Scientific | 08-772-1B | |
| 팔콘 무처리 플레이트 6-well | Fisher Scientific | 08-772-49 | |
| 팔콘 페트리 접시 10cm | Fisher Scientific | 08-757-100D | |
| 팔콘 페트리 접시 15cm | Fisher Scientific | 08-757-148 | |
| 팔콘 튜브 5ml | Fisher Scientific | 14-959-11A | |
| 팔콘 튜브 5 ml 셀 스트레이너 캡 포함 | Fisher Scientific | 08-771-23 | |
| 흰색 멸균 resevoirs | U.S.A. Scientific | 111-0700 | |
| 쥐 안티 마우스 CD41 PE 결합 | Biolegend | 133906 | |
| 쥐 안티 마우스 CD117 APC/CY7 | Biolegend | 105826 | |
| RW4 ESC | ATCC | CRL-12418 |
참고문헌
- Williams, R. L., et al. Myeloid leukaemia inhibitory factor maintains the developmental potential of embryonic stem cells. Nature. 336, 684-687 (1988).
- Desbaillets, I., Ziegler, U., Groscurth, P., Gassmann, M. Embryoid bodies: an in vitro model of....
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재인쇄 및 허가
