허혈성 뇌 손상의 여러 측면을 재생할 수 있습니다 entorhino - 해마의 Organotypic 슬라이스 문화에 대한 프로토콜은 제공됩니다. 신경 세포의 변화에 더하여 neurovasculature의 변화를 연구함으로써,이 프로토콜은 손상 후 신경 조직 플라스틱 변화를 연구하는 다양한 도구입니다.
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이 논문에서
요약
초록
허혈성 뇌 손상은 적절한 뇌 기능을 저하 가장 일반적이고 치명적인 상태 사이이며 종종 영향 환자에서 기능적 결손을 지속 리드. 집중적 인 연구 노력에도 불구하고, 여전히 신경 세포의 손상을 줄이고 지연 보조 죽음 허혈 영역의 신경 세포를 보호 가능한 효과적인 치료 옵션이 없습니다. 이 분야의 연구는 일반적으로 문제가 정교하고 동물 모델의 사용을 포함한다. 산소와 포도당 결핍 (OGD)에 도전 Entorhino - 해마의 Organotypic 슬라이스 문화는 뇌허혈을 모방 생체 모델에서 설정됩니다. 본 연구의 목적은 신규 한 뇌 혈관의 변화가 비교 상관 될 수있는 변경 및 신경 신경 혈관 구획과 구획 모두 반응 이외에 다룬다는 것이다. 이 프로토콜에서 제시된 방법은 실질적으로의 잠재적 인 응용 범위를 확장하거나ganotypic 슬라이스 문화 접근 방식. OGD 또는 단독 저산소증 유도의 Organotypic 슬라이스 문화 오히려 간단한 방법에 의해 적용하고 신경 조직의 신뢰성과 재현성 손상에 이르게 할 수 있습니다. 이 생체 내에서 뇌졸중 및 허혈을 유도 복잡하고 문제가 동물 실험 완전히 대조적이다. 분석을 확대하여 보존하고 뇌 기능을 복원하는 방법에 대한 새로운 방법을 제공 할 수있는 혈관의 반응에 대한 연구를 포함합니다. 여기에 제시된 슬라이스 문화 접근 방식은 허혈성 뇌 손상의 연구를위한 매력적이고 중요한 도구로 발전 할 수 있으며 신경 보호하기위한 잠재적 인 치료 대책을 테스트하는 데 유용 할 수 있습니다.
서론
중추 신경계는 혈관에 의한 손실이나 산소와 포도당 공급의 감소에 특히 민감하다. 뇌에 혈액을 공급하더라도 다소 짧은 중단 일반적인 스트로크 증후군 선도 중요한 뇌 영역의 기능에 영구적 손실을 유도 할 수있다. 주 영향 영역에서 신경 세포 손실에 더하여, 일반적으로 이차 손상으로 인한 추가적인 지연 성 뉴런의 손실이있다. 불행하게도 지금까지 차 신경 죽음의 감소에 대한 신경 치료는 1 사용할 수 없습니다. 이차 손상의 기전 연구를위한 연구 노력은 중간 대뇌 동맥 폐쇄 다양한 혈전 폐색 기법 등 뇌허혈 동물 모델의 사용에 의존한다 (검토를 위해 최근 2 참조). 병렬로 인해 제한 및 동물 모델, 다양한 CNS 조직의 Organotypic 슬라이스 문화의 사용과 윤리적 인 문제로 스튜를 허용하는 사용되었다상해 3-5의 다양한 유형에 대한 신경 반응의 마구.
허혈성 뇌 손상을 모방하는 조건 하에서 반응 신경 연구를위한 산소 포도당 박탈 모델 시스템 (OGD)가 개발되었다. 이 모델에서, 슬라이스 문화 일시적 글루코스 부족과 산소의 부재하에 질소 가스로 평형화 한 매체에 노출된다. 이러한 처리로, 생체 6,7 허혈성 손상 후 관찰 된 것과 다소 유사하다 신경 손상 및 손실을 유도 할 수있다. 해마에서, 이러한 치료에 특히 CA1에서 신경 세포 손실을 유발하지만 CA3 영역 또는 해마의 치아 이랑 (dentate gyrus). 반대로, 슬라이스 배양 혈관 반응 연구는 지금까지 광범위하게 수행되지 않았다. 명백한 이유는 슬라이스 배양 모델에서 순환과 혈관 관류의 부족이다. 그러나, 우리는 B를 유지하는 것이 가능하다는 것을 미리 보여 주었다CNS에서들 (100d) 선박은 9, 몇 일 8 문화를 슬라이스.
이 방법의 전반적인 목표는 OGD 후 신경 세포의 운명을 모니터링하지만 부상 응답의 중요한 부분입니다 혈관의 운명과 리모델링에 대한 연구를 확장 할뿐만 아니라. 지금까지 이러한 연구는 동물 실험의 사용 필수있다 (. 데 용 등, 1999; Cavaglia 등, 2001.). 프로토콜이 여기에 제시, 우리는 이러한 연구는 저산소증으로 또는 둘 다 신경 세포의 생존과 혈관 반응의 분석을 다음에 흥분 독성 병변 중 하나에 도전 entorhino - 해마의 Organotypic 슬라이스 문화에 상세하게 할 수있는 방법. 이 프로토콜은이 주제 10에 이전에 출판 된 연구를 바탕으로하며, 중추 신경계의 신경 혈관의 상호 작용에 관심이있는 실험실 유용 할 수 있습니다.
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프로토콜
동물 실험을 2010 년 9 월 (22)의 유럽 공동체위원회 지침에 따라 수행 하였다 (63분의 2,010 / EU)과 검토하고 스위스 당국에 의해 허용되었다.
1의 Organotypic Entorhino - 해마 슬라이스 문화를 설정
- 정적 배양 방법 4,11를 사용하여 출생 후의 일 4 (P4) 마우스 새끼에서 entorhino - 해마의 Organotypic 슬라이스 문화 (EHOSCs)를 준비합니다. 여기 C57BL6 및 CB6F1 마우스를 사용합니다.
- 즉 슬라이스 문화의 준비를 위해 마우스 강아지 당 약 30 분, 6 마우스 새끼의 쓰레기에 대한 세 시간을 가져 가라. 멸균 된 수술 도구와 층류 벤치에서 무균 조건 하에서 모든 단계를 수행합니다.
- septo-시간축을 따라 슬라이스의 위치에서 가능한 간섭을 피하기 위해, 단지 해마 중격 절반의 조각을 사용한다. 달리 명시하지 않으면, RT에서 모든 단계를 수행한다.
- t 잘라그는 수술 가위로 P4 마우스 강아지의 머리입니다. 마취는이 단계가 필요하지 않습니다.
- 뇌 주변의 두개골을 제거하고 대뇌 반구와 중뇌의 꼬리 끝 사이의 균열을 식별합니다. 조심스럽게 두개골에서 중뇌에 뇌 주동이의 부분을 제거하고 L-글루타민의 안정화 된 형태로 보충 MEM 구성된 얼음처럼 차가운 준비 매체에 넣습니다.
- 뇌가 냉담한 준비 매체에 침지와 실체 현미경 해부를 계속합니다. 대뇌 피질 반구에서 남은 수막을 제거합니다. 반구의 내측 꼬리 표면에서 해마를 확인하고 뇌의 나머지 부분에서 인접한 entorhinal 피질과 함께 그것을 구분합니다.
- 조직 헬기에 조직을 전송하고 해마의 septo - 시간 축에 무균 조건 횡단에서 400 μm의 두께 조각을 잘라.
- CE의 조각을 배치LL 문화 삽입 (약 6 삽입 당 조각) 배양 배지 (47 ㎖의 MEM, 25 ㎖의 이글 중간을 잘 당 1 ㎖, 25 ㎖의 말 혈청, 1 ㎖ glutamax I, 1 mL를 6 웰 플레이트에서 그들을 품어 37 ° C에서 5 % CO 2 가습 분위기에서 살균 10 % 포도당 용액의 pH 7.3). 매체 다음날과 일주에 다음 다른 모든 일을 위로 변경합니다.
재관류와 체외 저산소증에서 2 및 산소 - 포도당 박탈
- 절차의 정확한 시간 일정은 표 1을 참조하십시오. 저산소증 또는 OGD에 노출하기 전에 오일 (DIV5)에 대한 문화 EHOSCs. 이 시점에서 다음과 같은 조성으로 배지를 혈청 25 % 말 혈청을 함유하는 배양 배지에서 매체를 전환 : Neurobasal 배지를 2 % B27 보충제, 1 % glutamax 추가 0.1 % 글루코스와.
- 참조 7 구성 요소의 국지적 인 최종 농도에서 설명하는대로 다음이 될 것 OGD 매체를 준비합니다 : 0.3MM의 염화칼슘이, 70 mM의 염화나트륨, 5.25 mM의 탄산 수소 나트륨, 70 밀리미터의 KCl, pH가 6.8에서 1.25 밀리미터의 NaH 2 PO 4, 2 mM의 황산, 10 mM의 크로스. 두 개의 6 - 웰 조직 배양 플레이트의 각 웰에 OGD 배지 1 ㎖를 추가한다.
- 저산소 챔버에서 1 시간 동안 N 2 OGD 매체를 관류 한 다음 밀봉 O를 유지 / 37 ° C에서 인큐베이터에서 N.
- 저산소 지표로 혐기성 스트립을 사용합니다. 스트립의 색이 흰색에 분홍색에서 변경 될 때 산소가 없음을 매체를 고려한다.
- 저산소증의 유도를 들어, 대신 OGD 매체의 혈당과 혈청 배지를 사용합니다. 사용 전에 OGD 매체에 대해 위에서 설명한 바와 같이 저산소증 챔버에서 N 2와 함께 매체를 관류.
- 슬라이스는 OGD에 노출되기 전에, 30 분 동안 N 2로 다시 OGD 매체를 관류. 1 ㎎ / ㎖ 프로피 디움 아이오다 이드 (PI)가 30 분 동안 조각에 (2 μg / ML의 최종 농도에 대해) 잘 당 솔루션은 선택의 2 μl를 추가실험 만 건강한 슬라이스 PI 양성 세포의 낮은 숫자로 나타낸 바와 같이.
- . OGD 노출과 재관류 그림 1에 표시된의 일정을 사용하여 15 분 동안 하나의 산소 만 (저산소증) 또는 산소와 포도당 (OGD)의 조각을 박탈.
- 저산소증 또는 OGD의 유도를 들어, OGD 매체에 조각을 전송하고 저산소 챔버에서 15 분 동안 유지한다. 문화가 OGD 매체 다시 정기적 매체로 전환 할 때 삽입의 측면에 남아있는 모든 유체 거리에 흡입되어 있는지 확인합니다.
- 저산소증 또는 OGD 후, 산소 혈청 배지와 OGD 매체를 대체하고 문화는 5 % CO 2와 37 ° C에서 일반 배양기에서 무 혈청 배지에서 3, 24 또는 48 시간 동안 복구 할 수 있습니다. 세포 죽음의 결정에 대한 고정 다시 이전 PI를 추가합니다.
Entorhino - 해마 Organotypic 슬라이스 문화의 3 약리 치료
- 이 배양약물 치료에 노출하기 전에 배양 배지에서 오일 (DIV5)에 대한 전자 EHOSCs. 약물 치료 OGD 동안 즉시 조각 혈청 배지로 전송하는 경우 OGD 후를 시작합니다.
- OGD에서 보호를위한 트리트먼트.
- 30 분 동안 OGD 유도 직후에 100 μM 6 - 시아 노 -7 - 퀴녹 살린 2,3 - 디온 (CNQX) 또는 (15 분 동안) OGD의 유도시 배지 1 μM 테트로도톡신 (TTX) 또는 추가. 그런 다음, 고정하기 전에 48 시간 동안 정상 산소 혈청 배지에서 배양한다.
- 흥분 독성 죽음의 유도 치료.
- 배양 배지 스위치 배양 5 일 후에 30 분 동안 100 μM (RS) -α 아미노 -3 - 하이드 록시 -5 - 메틸-4-isoxazolepropionic 산 (AMPA)를 함유하는 배지를 혈청한다.
- 흡인 (삽입에 남아있는 매체를 제거하는데주의를 기울여야)에 의해 AMPA를 포함하는 배양 배지를 제거한 다음 정상 혈청 배지와 신선한 판에 조각을 전송고정 될 때까지 48 시간 동안 보관하십시오.
(4)의 고정 및 면역 염색 Entorhino - 해마 Organotypic 슬라이스 문화
- 요오드화 프로피 듐 (PI) 염색.
- 2 μg / ml의 농도에서 살고있는 조각의 문화 매체에 30 분 동안 PI를 추가합니다. 형광 광학 장착 거꾸로 현미경으로 살아있는 문화를보기 및 추가 치료에 대한 슬라이스를 선택합니다. 면역 조직 화학 염색과 함께 PI 염색의 경우, 이전에 문화의 정착에 PI 솔루션 30 분을 추가합니다.
- 조각의 고정.
- 6 - 웰 플레이트로부터 배지를 제거하고 각 웰에 새로 제조 한 4 % 파라 포름 알데히드 (PFA) 3 ㎖를 추가한다. 그런 다음 냉장고에 6 웰 플레이트를 배치하고 4 ° C에서 O / N을 고정한다.
- PFA 솔루션에게 다음과 같은 일을 제거하고 인산염 완충 생리 식염수 (PBS)으로 조각 3 ~ 4 회 반복한다.
- 세포 배양에서 I 슬라이스 제거nsert 무료 부동 섹션의 면역 조직 화학 염색에 대한 차단 절차.
- 조심스럽게 분리하고 크기가 0 이하의 아트 페인트 브러시를 사용하여 문화 삽입에서 슬라이스를 제거합니다. (3 % 정상 염소 혈청 (NGS)와 2 % 트리톤 - X100과 PBS)를 버퍼를 차단 가득 96 웰 플레이트의 우물에 각각의 조각을 전송합니다. 오비탈 쉐이커로 일정한 교반 하에서 RT에서 2 시간 동안 블로킹 버퍼 슬라이스를 보관.
- 슬라이스 문화의 면역 염색
- 표지 용 혈관은 1 희석 폴리 클로 날 항 - 라미닌을 사용 (200)을 PBS는 NGS 1 % 및 0.5 % 트리톤-X100을 포함한다.
- PBS가 1 % NGS 0.5 % 트리톤 - X100을 포함에 500 : 라벨 뉴런은 하나의 희석 단백질 2 (MAP2) 관련 안티 미세 소관 (microtubule)을 사용하십시오.
- 일정한 교반과 함께 4 ° C에서 48 시간 동안 차 항체 조각을 품어. 잠복기 후, 3 ~ 4 회 0.5 % 트리톤 - X100과 PBS로 닦아냅니다.
- 1 차 항체를 희석 : 500 PBS가 1 % NGS 및 0.5 % 트리톤-X100을 포함한다. 알렉사 형광 물질 이차 항체와 함께 어둠 속에서 실온에서 2 시간 동안 조각을 품어. 알렉사 350 또는 488에 접합 적절한 염소 항 - 토끼 나 염소 항 - 마우스 차 항체를 사용합니다.
- 차 항체 용액을 제거하고 트리스 완충 용액 (TBS)로 조각을 세 번 씻어; 유리 슬라이드에 그들을 마운트 Mowiol와 슬라이드를 커버 슬립.
- 스테인드 조각의 현미경
- 표면 형광 장비와 표준 현미경이나 공 초점 현미경으로 하나 스테인드 조각을 볼 수 있습니다. 적절한 카메라로 이미지를 가져 가라. 일부 이미지를 들어, 밝은 배경에 은밀히 스테인드 혈관을 수득하기 위해서, 형광 콘트라스트 (도 5 및 6)을 반전.
문화의 국가 별 선박 밀도 (5) 결정
- vesse 정량화참조 8에 설명 된대로 선박 횡단에 따라 리터 밀도.
- 이러한 측정을위한 라미닌 스테인드 조각을 사용합니다. 각 그리드 평방 당 100 × 100 μm의, 0.25 mm 2의 총 필드에 해당하는 6 × 6 그리드와 10 배 배율의 녹화 영상을 첨부합니다.
- CA1, CA3, DG, 및 EC 지역에서 오버레이 세 등의 그리드 (그림 2). 그리드의 줄을 건너 용기를 계산합니다.
- 통계적 관련성 좋은 결과를 얻기 위해, 마우스 새끼 당 3 개 조각 3 새끼 마우스에서, 적어도 3 개의 독립적 인 실험에 각각 포함하는 데이터를 측정 할.
- 각 지역의 그리드에서 선박 횡단의 평균 값을 결정하고 적절한 통계 소프트웨어를 사용하여 (같은 중요한 정의 P <0.05) 사후 시험과 페로 니 보정과 ANOVA로 통계 분석을 수행합니다.
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결과
산소 및 글루코스 부족 저산소증은 해마 CA1 영역의 신경 세포 특이 죽음과 혈관의 감소를 유도한다.
이전에 설명한 바와 같이 유사한 7 해마 (도 3)의 CA1 영역에서 특히 요오드화 프로피 듐 염색하여 본 OGD 또는 산소 결핍 혼자 15 분 동안 세포 사멸의 강한 유도 유도. 마커는 혈관 네트워크를 시각화, 그것은 혈관 밀도 및 조직 CA1 영역을 제외한 대부분의 지역 문화의 OGD 도전 후 제어 유사한 등장하였습니다. 혈관 밀도를 감소시키고있다 혈관 네트워크는 부분적으로 (도 3, E 및 F)을 중단시켰다. 이러한 변경은 요오드화 프로피 듐 염색이 증가 지역에서 관찰되었다.
혈관 변화의 시간 코스 neur의 평행ONAL 변성.
우리는 3 시간, 24 시간 및 산소 결핍 (저산소증) 후 48 시간에서 시간 포인트...
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토론
여기에 제시된 방법으로, 해마의 Organotypic 슬라이스 문화는 손상 후 신경 조직 플라스틱 변화를 연구하기 위해 다양한 도구로 사용할 수 있습니다. Organotypic 슬라이스 배양 혈관 변화의 동시 연구의 새로운 형태 7, 6 허혈 후 신경 반응을 연구를 위해 이전에 사용 되었으나 크게이 방법의 응용 가능성을 향상시킨다. OGD 또는 단독 저산소증 유도의 Organotypic 슬라이스 문화 오히려 간단한 방법에 의해 적용하고 신경 조직의 신뢰성과 재현성 손상에 이르게 할 수 있습니다. 또한, 슬라이스 배양 방법은 허혈성 도전 결과를 연구하지 수 있지만 또한 신경 보호 목적으로 잠재적 인 치료 방법의 테스팅을 허용한다. 슬라이스 문화 따라서 허혈성 뇌 손상의 연구를위한 매력적이고 중요한 도구입니다.
여기에 제시된 방법은 헥타르 모든 실험실에 쉽게 구현할 수있다CNS 슬라이스 문화와 경험을 ving. OGD 또는 저산소증을 적용하면 재현 가능한 결과...
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공개 사항
동물 실험은 1986년 11월 24일 (609분의 86 / EEC)의 유럽 공동체위원회 지침에 따라 수행하고, 스위스 당국에 의해 검토하고 허용 하였다. 저자가 공개하는 게 없다.
감사의 글
이 작품은 바젤 대학의 생물 의학 교실 및 스위스 국립 과학 재단 (31003A_141007)에 의해 지원되었다. 마르쿠스 Saxer 기술 지원을 제공했다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 최소 필수 매체 MEM | Gibco | 11012-044 | |
| Glutamax | Gibco | 35050-061 | 안정화된 형태의 L-글루타민 |
| 밀리셀 세포 배양 삽입물 | Millipore | PICM03050 | |
| 기초 매체 Eagle | Gibco | 41010-026 | |
| 호스 세럼 | Gibco | 26050-088 | |
| Neurobasal medium | Gibco | 21103-049 | |
| B27 보충제 | Gibco | 17504-044 | |
| 혐기성 스트립 | Sigma-Aldrich | 59886 | |
| Propidium iodide 용액 | Sigma-Aldrich | P4864 | |
| AMPA | R& D 시스템 | 0169-10 | |
| CNQX | R& D 시스템 | 0190/10 | |
| TTX | R& D 시스템 | 1078/1 | |
| 다클론 안티 라미닌 | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| anti-MAP2 | Abcam | ab11267 | |
| Alexa anti-mouse 350 | 분자 프로브 | A11045 | |
| Alexa anti-mouse 488 | 분자 프로브 | A11001 | |
| Alexa anti-rabbit 350 | 분자 프로브 | A11046 | |
| Alexa anti-rabbit 488 | 분자 프로브 | A11008 | |
| 통계 소프트웨어 | GraphPad 소프트웨어 | GraphPad Prism | |
| McIlwain 조직 초퍼 | Ted Pella | 10180 | |
| 저산소증 챔버 | Billups-Rothenberg | MIC-101 |
참고문헌
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